Nuevo edificio en construcción del IOBA en el campus Miguel Delibes. Mª Pilar Sánchez Bailón 4º BIOQUÍMICA

Transcripción

1 Nuevo edificio en construcción del IOBA en el campus Miguel Delibes. Mª Pilar Sánchez Bailón 4º BIOQUÍMICA

2 ÍNDICE 1-INTRODUCCIÓN....Pág PRÁCTICAS REALIZADAS 2.1- Extracción de ADN para genotipado a partir de muestras de sangre...pág Extracción de explantes de retina de cerdo y cultivo de los mismos.....pág Prueba de distintos polímeros en ojos de conejos..pág CONCLUSIONES..... Pág. 13 2

3 1 INTRODUCCIÓN He estado realizando mis prácticas durante el mes de julio en los laboratorios del Instituto de Oftalmobiología Aplicada (IOBA) de Valladolid. Es una clínica oftalmológica cuyos laboratorios están situados en la 3ª planta de la facultad de Medicina. Hay varios grupos investigadores: 1- Superficie ocular 2- Retina 3- Cirugía refractiva y calidad de visión 4- Glaucoma 5- Tumores oculares A mí me incluyeron en el grupo de retina el cual estaba formado por varios oftalmólogos, un veterinario, una técnico de laboratorio y una estadístico. Asimismo, mi tutor de prácticas, me ofertó la posibilidad de incluirme en cualquiera de los grupos si me interesaba algo de lo que estaban haciendo. El primer día de prácticas la técnico de laboratorio me enseñó los distintos laboratorios, y el animalario y me explicó los proyectos que se estaban llevando a cabo. También me proporcionó papers y tesis para que pudiera informarme de lo que habían hecho en estos últimos años. Asimismo, me enseñó a hacer hojas de pedido de los materiales que allí se usaban. Dentro del IOBA hay laboratorios específicos para cada grupo, aunque también hay laboratorios compartidos, como el laboratorio de cultivos celulares y el laboratorio de biología molecular. Asimismo, utilizan los laboratorios del departamento de histología situados en el primer piso de la facultad, donde se llevan a cabo las inmunofluorescencias y donde se ven con el microscopio de fluorescencia. El horario estipulado era de 9 a 15h aunque era flexible, además fui varias veces por la tarde, de forma voluntaria, para asistir a las reuniones que se hacían dos veces por semana, en las cuales participé activamente, y también para trabajar en el laboratorio. En las reuniones se hablaba de los proyectos que se estaban llevando a cabo, así como de las tesis de los doctorandos. 3

4 También tuve la oportunidad de entrar en quirófano para ver una operación de cataratas, una vitrectomía y una trabeculotomía a un paciente. Mi función allí fue ayudar al equipo de investigación en los proyectos que estaban llevando a cabo. Aunque no había unas prácticas específicas para mí, pienso que esto tuvo su lado positivo ya que pude hacer cosas totalmente diferentes. 4

5 2- PRÁCTICAS REALIZADAS 2.1- EXTRACCIÓN DE ADN PARA GENOTIPADO A PARTIR DE MUESTRAS DE SANGRE La extracción de ADN se llevaba a cabo para después genotiparlo y así poder asociar determinados SNP s a la patología denominada vitreoretinopatía proliferante (VRP); ya que, es la causa más frecuente de fracaso de la cirugía del desprendimiento de retina. Materiales y aparatos necesarios: Tubos eppendorf de 1.5ml estériles Isopropanol Etanol al 70% Solución de lisis RBC (1) Solución de lisis (2) Solución de precipitación de proteínas (3) Campana de flujo laminar Baño de agua a 37 ºC Microcentrífuga Vortex Protocolo de extracción: 1. Se añaden 900 µl de solución de lisis RBC (1) a un tubo eppendorf de 1.5 ml. 2. Agitar suavemente el tubo de sangre hasta que esté bien mezclado y poner 300µl al mismo eppendorf. Invertirlo 5-6 veces para mezclar. 3. Incubar la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA) e invertir los tubos varias veces durante la incubación. Centrifugar a rpm durante 30 segundos a TA. 4. Quitar y descartar el sobrenadante lo máximo posible sin tocar el precipitado (sobrarán alrededor de de µl de líquido residual en el eppendorf). 5. Vortexear vigorosamente hasta que los linfocitos se resuspendan (10-15 segundos). 6. Añadir 300 µl de solución de lisis (2) y resuspender mediante pipeta para lisar las células. Incubar a 37 ºC hasta que la solución quede homogénea, sin grupos celulares. 5

6 7. Dejar que la muestra se atempere a TA. 8. Añadir 180 µl de solución de precipitación de proteínas (3) al lisado nuclear y vortexear vigorosamente durante 30 segundos. 9. Centrifugar a rpm durante 3 minutos, tiene que aparecer un precipitado marrón de proteínas. Si no aparece volver a centrifugar después de incubar en hielo por 5 minutos. 10. Transferir el sobrenadante a un eppendor que contenga 300 µl de isopropanol a TA, y mezclar suavemente por inversión unas 50 veces. Centrifugar a 13ooo rpm durante 2 minutos a TA. El ADN será visible en forma de un pequeño precipitado blanco. 11. Descartar el sobrenadante y secar el tubo de forma breve en papel absorbente. Añadir 300 µl de etanol al 70 %. Invertir los tubos 5-6 veces y centrifugar a 13ooo rpm durante 1 minuto. 12. Aspirar cuidadosamente el etanol, evitando tocar el precipitado. Se puede volver a centrifugar brevemente para recoger las últimas gotas de etanol residual. Invertir el tubo en papel absorbente limpio y dejar secar el precipitado durante 15 minutos. 13. Añadir 25 µl de TE al 1% y almacenar a -20 ºC. Desarrollo de la práctica La extracción de ADN se lleva a cabo en el laboratorio de biología molecular, en el cual se utiliza una bata de uso exclusivo en este laboratorio, también es necesario el uso de guantes. El proceso se lleva a cabo en una campana de flujo laminar la cual se ha limpiado previamente con un producto especial para eliminar posibles restos de ADN que hubiera. Todos los materiales que se usen dentro de la campana deben limpiarse con un papel empapado en etanol al 70% e introducirlos en la campana. Se numeran los tubos eppendorf que se van a utilizar según el número de muestra. Este número se corresponde con un código de barras formado por cinco números, el primer número es el hospital del que procede la muestra, el segundo es un 1 ó un 0, según proceda la sangre de un paciente con VRP o DR respectivamente y los tres últimos dígitos corresponden al número de muestras recibido de ese hospital. Ej Hospital Clínico Universitario de Valladolid 1- Paciente con VRP 089- Paciente número 89 6

7 Al final de proceso, de algunas muestras no se puedo extraer ADN, por lo que, se repitió el proceso, pero esta vez se hace la extracción por duplicado, es decir, se coge sangre de cada uno de los dos tubos que corresponden al mismo paciente. En las últimas muestras no precipitaban bien las proteínas con lo que el ADN quedaba contaminado, esto se debía a que a principio del proceso de extracción en lugar de dejar 20 µl de precipitado se dejó más cantidad y por tanto, la cantidad de solución de precipitación de proteínas (3) que se añadía no era suficiente para que todas precipitaran. La extracción de ADN se llevaba a cabo cada viernes ya que es cuando reciben las muestras de los hospitales, aunque si el número de muestras era muy elevado se hacía en más días EXTRACCIÓN DE EXPLANTES DE RETINA DE CERDO Y CULTIVO DE LOS MISMOS Los ojos de cerdo se iban a buscar al matadero de Laguna de Duero, situado cerca de Valladolid. Yo acompañé al veterinario en una ocasión a buscarlos, para ello, llevamos una caja de corcho blanco con hielo, un frasco con medio DMEM-CO 2 independent con penicilina/estreptomicina (1:1000) y un bisturí para que el personal del matadero extrajera los ojos. Cogimos cuatro ojos, los cuales introdujimos en el medio de cultivo y metimos el bote en la caja con hielo. Después los llevamos al laboratorio de cultivos del IOBA, donde se llevó a cabo el cultivo. Se trabaja en la campana de flujo laminar y lo primero que se hace es limpiar los ojos con unas tijeras, después se le hace un agujero con una aguja a la altura de la ora serrata por el que se comenzará a cortar de tal forma que al final la cámara vítrea quede separada de la cámara anterior y posterior. Posteriormente, se extrae el vítreo y se separa la retina ayudándonos con un pincel y se pone sobre una placa Petri con medio DMEM-CO 2 independent. Después se hacen cortes de 1 0,5 cm evitando que en estos fragmentos haya vasos sanguíneos. Luego se pone cada explante en unos pocillos con una 7

8 membrana que están embebidos en medio DMEM-CO 2 independent y se incuban a 37 ºC. El medio de cultivo hay que cambiarlo a las 24 horas y luego cada 2 días. Medio de cultivo para hacer 10ml: 100 µl B µl L- Glutamato 8 ml FBS (suero bovino fetal) FIJACIÓN Y CORTE DE EXPLANTES Cada día se extraen dos o tres retinas y se dejan en paraformaldehido al 4% durante 3 horas a 4 ºC para que se fijen. Al día siguiente se retira el paraformaldehido y se pone una solución de sacarosa al 30%, dejándolo durante toda la noche a 4 ºC. Cortes de los explantes de retina con el criostato Se coge cada pocillo con el explante y se quita de la solución de sacarosa, si la membrana está muy pegada a la placa se echa un poco más de solución de sacarosa y se despegará. Después se corta la membrana, alrededor de la retina, se pone sobre un pequeño vaso al que previamente se le ha echado tissue-tek que se he congelado al ponerlo en contacto con hielo seco (CO 2 congelado). Luego se añade un poco más de tissue-tek y se deja que se congele, se le pega un papel para poder identificar la retina. Esto se hace con todos los trozos de retina y después se meten al congelador a -80 ºC donde se conservarán. Después se sacarán del congelador para ser cortadas con el criostato. Se hacen cortes de dos grosores: 10 y 20 µm. Cortes de los explantes de retina con el microtomo El proceso es igual que para hacer cortes con el criostato, solo que en lugar de tissue-tek se incluye en parafina. Cuando la parafina está solidificada se hacen cortes con el microtomo de 8, 10, 20 µm. Lo primero que hay que hacer es localizar el trozo de retina y quitar con una cuchilla la parafina que rodea al trozo que nos interesa. 8

9 Después se hacen unos cortes hasta llegar a la zona donde está la retina para saber si está o no se cogen en un portaobjetos los trozos y se miran al microscopio óptico. Una vez hechos los cortes se recogen con un pincel y se pasan a una solución con agua y alcohol al 70%, se dejan unos dos minutos y se recogen con un portaobjetos para pasarlos a un baño con agua a una temperatura de 60 ºC. Se dejan ahí hasta que los cortes estén bien estirados, es decir, hasta que no presenten arrugas. Luego se recogen de nuevo con el portaobjetos y se dejan secar, se puede quitar el exceso de agua con un papel. Inmunofluorescencia Se lleva a cabo una reacción de inmunofluorescencia a los explantes de retina para poder visualizarlos al microscopio. Posteriormente se observan las retinas al microscopio de fluorescencia y se hacen fotografías de algunas de ellas. Como cada explante ha estado en cultivo diferente tiempo, desde 0 hasta 6 días, se puede observar la diferencia en tamaño de las células de Müller de unas muestras a otras. Las células que mejor se ven son de retinas que han permanecido en cultivo durante 5 ó 6 días. Retina que ha permanecido 6 días en cultivo. Las células de Müller aparecen en rojo y los núcleos en azul. 9

10 2.3- PRUEBA DE DISTINTOS POLÍMEROS EN OJOS DE CONEJOS Debido a la agresividad de la inyección de determinados fármacos en el humor vítreo del ojo se está probando la reacción de diferentes polímeros al inyectarlos en la parte posterior del globo ocular. A estos polímeros se les pondrá después el fármaco, y así el ojo lo absorberá, impidiendo de esta forma, la agresión de la inyección. El ojo izquierdo de cada conejo era el control y solo se les administraba suero y al ojo derecho se le administraba el suero y se les inyectaba el polímero. Desarrollo de la práctica Específicamente mi labor en esta práctica consistió en cargar las jeringuillas, coger a los conejos, poner el bléfaro y ver las lesiones que presentaban los conejos en los ojos. Protocolo 1. Se anestesia al conejo por inyección intramuscular. 2. Una vez anestesiado, se le administra una gota de anestésico ocular en cada ojo. 3. En el ojo izquierdo se le pone un bléfaro para sujetar el párpado y se echa suero. 4. En el ojo derecho se repite la misma operación y además se echan 0,3 ml de polímero en la parte de atrás del globo ocular con una cánula torcida. El polímero es de color blanco y solidifica rápidamente. El experimento se llevó a cabo con 9 conejos de entre 2,5 y 3kg de peso y se vio la reacción a las 24, 48 y 72 horas. En una hoja de screening se valora la reacción que ha producido cada polímero en cada ojo en la conjuntiva, en la córnea y el daño producido en la superficie ocular. Se valoran desde 0-3 la congestión, el edema y la supuración conjuntival, así como el reflejo del humor acuoso. Desde 0-2 se valora la respuesta de la pupila frente a la luz y desde 0-4 se valora la zona que envuelve al iris, si está o no capilarizada y la opacidad de la córnea. También se valora de 0-4 el daño producido 10

11 en el epitelio corneal y esto se ve al echar una gota de fluoresceína sobre el ojo y verlo con una lámpara de luz azul. Control a las 24 horas El conejo 2 reaccionó al polímero aplicado al ojo. Con la luz azul aplicando fluoresceína se observó que el cuadrante superior del ojo derecho presentaba una moderada tinción con fluoresceína. El conejo 3 también tenía dañado el epitelio corneal del ojo derecho, por lo que ambos conejos habían reaccionado a los polímeros. Algunos conejos presentaban edema y congestión. Control a las 48 horas Al conejo 2 le había desaparecido la úlcera y el conejo 3 aún presentaba una pequeña úlcera. Algunos conejos seguían presentando edema y congestión. Control a las 72 horas Los conejos 2 y 3 ya no presentaban úlceras. En los conejos 6 y 7 se había extruido el polímero. Algunos conejos seguían presentando edema y congestión pero muy leves. Conclusión A la vista de los resultados la conclusión que se obtuvo fue que los conejos toleraban bastante bien los polímeros. Enucleación del ojo derecho a la semana de haberles administrado el polímero 1- Se vuelven a revisar laso ojos de los conejos, dos de ellos, el conejo 6 y el conejo 8, presentaban edema el resto no presentan nada. 2- Se inyecta 2ml de Dolethal en una vena de la oreja para matar al conejo. Inmediatamente, el conejo muere, se puede observar la dilatación de las pupilas y el cambio de color del fondo de ojo de rojo a blanco. 11

12 3- Se le pone el bléfaro para sujetar el párpado y se corta el recto y todo alrededor del ojo, cortando bien hacia el fondo con una tijera curvada, por último se corta la arteria. 4- Posteriormente se limpia el ojo con agua y suero; en el cual se puede ver el polímero. Se fotografían los ojos de frente y lateralmente. Después se meten en un frasco con formol. 12

13 3- CONCLUSIONES Por ser los laboratorios de una clínica especializada en el campo de la oftalmología las enseñanzas recibidas en la facultad no tenían una aplicación tan directa; de hecho, mientras estuve allí mi tutor me proporcionó información para que ampliara mis conocimientos acerca del tema. Lo cual fue positivo para mí ya que pude aprender más cosas. Para mí, ha sido una grata experiencia, porque pude comprobar de forma directa el funcionamiento diario de un laboratorio, la cooperación entre todos los integrantes del equipo de investigación y la forma de afrontar las diferentes situaciones. Las investigaciones que allí se llevaban a cabo tienen una aplicación directa sobre los pacientes, lo cual es muy satisfactorio para el investigador, ya que se puede comprobar la utilidad de las mismas sobre personas que lo necesitan. 13