Estudio de caso 1: Frijol resistente a virus (RV)

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1 Estudio de caso 1: Frijol resistente a virus (RV) PARTE I: LA PLANTA NO TRANSGÉNICA DESCRIPCIÓN GENERALDE LA PLANTA El frijol común (Phaseolus vulgaris L.), es una planta anual, herbácea, e intensamente cultivada desde la zona tropical hasta las templadas. Es originario de América y se le conoce con diferentes nombres: poroto, haricot, caraota, judía, alubia, habichuela, feijão y otros. El frijol es la leguminosa más cultivada a nivel mundial y participa con el 57% de la oferta mundial de leguminosas. En Colombia, el frijol es uno de los cultivos más importantes en varias regiones del país, especialmente en climas fríos y medios y en zonas de economía campesina. A él se dedican pequeños productores que siembran hectáreas, con una producción de toneladas al año, que no son suficientes para abastecer el consumo interno. Este producto es componente principal en la dieta alimenticia de la poblacióny es la principal fuente de proteína; es rico en lisina pero deficiente en los aminoácidos azufrados metionina, cistina y triptófano; por lo cual una dieta adecuada en aminoácidos esenciales se logra al combinar frijol con cereales (arroz, maíz, otros). El frijol se adapta bien desde 50 hasta 2,600 msnm. El cultivo necesita entre 300 a 400 mm de lluvia. La falta de agua durante las etapas de floración, formación y llenado de vainas afecta seriamente el rendimiento. El exceso de humedad afecta el desarrollo de la planta y favorece el ataque de gran número de plagas y enfermedades. El frijol requiere desde el inicio del ciclo hasta un mínimo de sesenta días después de la siembra de humedad adecuada en el suelo, para un buen crecimiento, desarrollo de la planta, formación y llenado del grano; a la vez requiere de un período seco o de poca precipitación al final del ciclo, para favorecer el proceso de maduración y cosecha. Por estas razones es importante sembrar a tiempo, para no carecer de humedad y para que la cosecha coincida con una estación seca favorable. Cuando se desea sembrar al final de la época de siembra recomendada, se sugiere el uso de variedades precoces o de ciclo corto. Respecto de la morfología y fenología de la planta sólo se menciona aquí brevemente, la existencia de varios hábitos de crecimiento que se correlacionan directamente y en general, con la longitud del ciclo de desarrollo; el intervalo va desde el hábito determinado, precoces desde 80 días (matas), hasta el indeterminado hasta 180 días (enredaderas), En cada variedad, la sucesión y duración de las diferentes etapas de desarrollo, aunque están determinadas genéticamente, se ven también afectadas en cierto grado por las condiciones del medio, siendo los factores del clima como temperatura, humedad, duración e intensidad de la luz, los más importantes. Se mencionan otros aspectos importantes en su biología reproductiva. Las flores de frijol desarrollan en una inflorescencia de racimo, la cual puede ser terminal como sucede en las variedades de hábito determinado o lateral en las indeterminadas. La inflorescencia consta de pedúnculo raquis, brácteas y botones florales. Los botones florales desarrollan en las axilas de las brácteas. Pueden ser blancas, rosada o de color púrpura. La floración inicia cuando por lo menos el 10% de las plantas presentan una o más flores. Prosigue en plena floración durante un período en que todas las plantas presentan flores y más del 50% de éstos muestra una floración abundante. El final de la floración se considera cuando solamente el 10% de las plantas muestran flores bien desarrolladas. El fruto es el ovario desarrollado en forma de vaina con dos suturas que unen las dos valvas; Las semillas se unen a las valvas en forma alterna sobre la sutura placentaria. Las divergencias laterales están constituidas por los cotiledones y las dos hojas primarias verdaderas; Los cotiledones forman la parte voluminosa de la semilla, son hojas modificadas para el almacén de carbohidratos y proteínas y 1

2 constituyen la parte aprovechable de la semilla. El embrión se sitúa dentro de la semilla entre los cotiledones con la radícula orientada hacia el micrópilo y la plúmula haciaa el interior del grano. La madurez fisiológica ocurre cuando la planta ha completadoo su ciclo de vida y se puede arrancar o cortar sin consecuencias negativas en la fisiología y peso de la semilla. En frijol se presenta cuando la planta aún tiene algunas hojas senescentes (envejecidas y amarillentas) y la mayoría de las vainas muestran sus valvas apergaminadas y secas. Figura 1. Etapas de desarrollo temprano de la planta de frijol y componentes morfológicos y fisiológicos del rendimiento agronómico. SIGLAS: 2C: Cotiledones; HC: Hojas de cotiledón; 3F: Hojas trifolioladas (no. variable según hábito de crecimiento; BA: brotes axiales (para trifolios o racimos florales) 3F H 2C B CENTROS DE ORIGEN Y CENTROS DE DIVERSIDADD GENÉTICA Colombia posee una gran riqueza en cuanto a materiales genéticos de fríjol. Esta especie, por ser originaria de Centro y Suramérica, presenta una gran diversidad en cuanto a sus características y comportamiento como reacción a las condiciones ambientales y de manejo. De acuerdo con el origen, ciertos tipos de fríjol se han ido adaptando a las condiciones de cada lugar. Por ejemplo, los fríjoles de hábito IV (volubles) se han adaptado a las condiciones del clima frío. Así mismo, dependiendo de los hábitos de consumo, determinadas regiones se han especializado en la producción con variedades cuyo grano pertenece a determinada clase comercial. Es el caso del fríjol tipo: cargamanto en Antioquia (figura 2a), el bola roja en el Altiplano Cundiboyacense (figura 2b), o el mortiño (figura 2c) en Nariño. Caso contrario sucede con otros tipos de fríjol como la clase calima (figura 2d), que se producen y se consumen en varias regiones de Colombia. (Arias et al, 2007, 2

3 (Figura 2a.) Frijol cargamanto (Figura 2b.) Frijol bola roja (Figura 2c.) Frijol mortiño (Figura 2d.) Frijol clase calima MEDIOS DE DISPERSIÓN Y ESTABLECIMIENTO Las variedades cultivadas de frijol común, como parte de una especie parcialmente domesticada, han perdido varios de los mecanismos silvestres de establecimiento y dispersión presentes en otros miembros del género. En principio es una especie cleistogámica, que significa que se autopoliniza a una alta frecuencia, ya que en esta condición, las anteras maduran y el polen fecunda a los óvulos dentro de flores bisexuales, antes de que abra la corola. Los fitomejoradores deben recurrir a prácticas de polinización forzada, emasculando precozmente a las flores receptoras; aún así el promedio de éxito es cercano al 10%. La dispersión de semilla es también muy limitada en variedades cultivadas, ya que los mecanismos de dehiscencia de la vaina han sido contraseleccionados en el germoplasma domesticado para evitar la pérdida de grano. El consumo de vainas tiernas (ejotes), implica el cocimiento de las semillas dentro de la legumbre; para procesar las vainas secas y extraer las semillas, los métodos manuales recurren a la movilización de la cosecha a espacios distintos a las parcelas de cultivo; con los métodos mecanizados que procesan el cultivo sobre los surcos, se reducen sustancialmente la dispersión de semillas. No existen estrategias de propagación vegetativa en el frijol, ya que las variedades cultivadas de P. vulgaris son anuales y distinto a algunas variedades arvenses de P. coccineus o de P. polyanthus (acalete), no quedan estructuras de propagación de un año a otro; por otro lado, para la propagación clonal de líneas de frijol, se debe recurrir al cultivo in vitro, que requiere medios especiales de cultivo conteniendo fitohormonas. HIBRIDACIÓN (CRUZAMIENTOS) INTRAESPECÍFICA E INTERESPECÍFICA O INTERGENÉRICA Existen diversos estudios sobre la taxonomía y relaciones filogenéticas de las especies de Phaseolus spp. cultivadas dentro del género y de la subtribu Phaseoline. Estas relaciones ha sido continuamente restablecidas a partir de nueva información fenética y genómica, que sugieren posibles flujos con poblaciones arvenses y silvestres en regiones específicas y restricciones a la hibridación entre las pozas genéticas presentes en los centros de origen y diversidad (Acosta-Gallegos et al. 2007). Como se mencionó, la condición de cleistogamia y la selección agronómica, reducen significativamente la hibridación natural en 3

4 este género, y en especial, a nivel intraespecífico en variedades cultivadas. Desde el punto de vista agronómico, la selección del tipo de variedad y la calidad de la semilla en cuanto a su pureza genética han cobrado especial importancia, en virtud de la diversificación del mercado para las cosechas en México, aunque hay preferencias regionales muy marcadas en el consumo entre el norte, el centro y el sur. REFERENCIAS Acosta-Gallegos J, JA Kelly & P Gepts (2007) Prebreeding in common bean and use of genetic diversity form wild germplasm. Crop Sci. 47 (S3): Escalante JA & Kohashi-Shibata J. (1993) El rendimiento y crecimiento de frijol. Manual para la toma de datos. Centro de Botánica (COLPOS), Montecillo, Méx. 84 pp. Piñero D, et al. (2009) 15. La diversidad genética como instrumento para la conservación y el aprovechamiento de la biodiversidad: estudios en especies mexicanas, p ( Frijoles) En: Capital natural de México, Vol. I (Conocimiento actual de la biodiversidad), Tercera parte (El conocimiento de la variabilidad genética), Conabio, México. Reyes-Rivas E., et al. (2008) Historia, naturaleza y cualidades alimentarias del frijol, Revista Investigación Científica (UAZ). 4(3): ISSN cavol4no3_1.pdf PARTE II: EL AMBIENTE RECEPTOR CULTIVO DE LA ESPECIE DE ESTUDIO EN COLOMBIA El frijol es uno de los cultivos más importantes en varias regiones del país, especialmente en climas fríos y medios y en zonas de economía campesina. Este producto es componente principal en la dieta alimenticia de la población y participa con el 1,3% en el IPC de los alimentos. Sin embargo, y como se verá más adelante, la producción nacional se está rezagando frente a la creciente demanda interna y ese déficit se ha estado cubriendo con producto importado. La distribución de estas variedades en Colombia responde al gusto de los consumidores locales: en Antioquia predominan las variedades de frijol moteado vol u b l e o d e e n r e d a d e r a ( t i po cargamanto) que se cultivan en relevo 3/ o asocio 4/ con maíz y en monocultivo; en Nariño, Huila, Tolima y los Santanderes se siembran principalmente las variedades de frijol rojo o moteado tipo arbustivo; en Cundinamarca y Boyacá se cultiva tradicionalmente frijol rojo y rosado voluble y arbustivo, y en la Costa Atlántica, variedades de frijol arbustivo. 4

5 Area de producción y rendimiento del frijol en Colombia ( Principales departamentos productores de frijol (2010) ( PRESENCIA DE CUALQUIER PARIENTE SEXUALMENTE COMPATIBLE EN EL AMBIENTE RECEPTOR. México, como parte de una región de origen y diversificación del género Phaseolus, específicamente del llamado complejo genético (o gene pool) mesoamericano, posee una distribución amplia de variedades silvestres y mejoradas. La dinámica poblacional de este género, indica que los procesos de hibridación silvestre son muy infrecuentes y que la diversificación se ha dado principalmente por deriva y selección humana. Asimismo coexisten las otras tres especies con variedades cultivadas (P. coccineus [ayocote], P. acutifolius [tépari] y P. lunatus ([frijol lima, ibes o comba]), cada una con algún nicho preferencial, regional, pero sin perder su identidad ya que incluso cruzas interespecíficas experimentales son poco viables e infértiles. Sólo con técnicas de rescate de embriones se han logrado progenies útiles para mapeo genético y con potencial para la introgresión de caracteres de interés agronómico (Acosta-Gallegos et al. 2007). INTERACCIONES ECOLÓGICAS EN EL AMBIENTE RECEPTOR Para el presente documento, se hará una reseña de las dos plagas más relevantes relacionadas con este evento, haciéndose mención de otras en el contexto de la evaluación de riesgos ambientales, dentro de las parcelas, como en sus inmediaciones. Plagas del frijol 5

6 Las plagas son responsables en alto grado de mermas en el rendimiento y el manejo que se les dé es determinante para lograr una buena producción. Es frecuente encontrar dos tipos de daño: el directo, ocasionado por insectos masticadores, y el indirecto, causado por insectos chupadores, que transmiten principalmente enfermedades de tipo viral. En Colombia se han registrado cerca de 85 plagas en fríjol: 76 insectos, cinco ácaros, un miriápodo y tres moluscos. De éstos, solamente diez alcanzan el nivel de plaga de importancia económica (Posada, citado por Ríos, 2002). pág 86. Por la relevancia de caso, se amplía la información al respecto del Complejo mosquita blanca: Bemisia tabaci y B. argentifolii. La importancia de la mosquita blanca en el cultivo de frijol se debe a su capacidad para transmitir el virus del mosaico dorado. Los síntomas de esta enfermedad son: el aspecto en mosaico de las hojas, enanismo y/o superbrotación en las plantas. Además de esto, las plantas infectadas precozmente, tienden a alargar su ciclo vegetativo, hecho relacionado a la brotación excesiva de flores. Las vainas, cuando se desarrollan, presentan deformaciones o un tamaño reducido, con semillas subdesarrolladas y deformes, lo que afecta la calidad final del grano y su valor comercial. Las mayores poblaciones de este insecto vector ocurren durante el verano (julio-septiembre) y decrecen en el invierno (a partir de octubre), por los cuales las fechas de siembra son determinantes para reducir riesgos de daño por mosquita blanca. Se considera que siembras muy tempranas (septiembre) o muy tardías (diciembre) son las más afectadas. En general, las siembras de la tercera decena de octubre son las más apropiadas para disminuir los riesgos mencionados. Cuando se requieren aplicaciones de insecticidas debe considerarse la etapa tecnológica en que se encuentra el cultivo. Los muestreos y aplicaciones deberán realizarse antes de las 8:00 A.M. o bien durante la tarde, debido a la actividad de vuelo de la plaga. Los adultos de mosca blanca miden 1.5 milímetros, son de color blanco-amarillento; se les encuentra en el envés de las hojas y cuando se les disturba vuelan rápidamente. Ovipositan cientos de huevecillos en el envés de las hojas; las ninfas son aplanadas y al nacer pegan a las hojas succionando la savia y produciendo mucha excreta melosa en donde se desarrolla fumagina lo que da una coloración negruzca a las plantas. Como el control químico es difícil y costoso, antes de aplicar insecticidas se debe hacer una buena evaluación de los niveles de plaga y estimar sus posibles daños económicos. Se ha encontrado que la aplicación de soluciones jabonosas ayudan al control de la plaga a costos comparativamente, pero las aplicaciones deben hacerse con pulverizadores que garanticen una buena cobertura. La solución jabonosa actúa sobre la ligera capa cerosa que protege el cuerpo de la plaga y al exponerla al sol, provoca su deshidratación y muerte. Combate de malezas El frijol una planta poco competitiva. Se han observado reducciones en la cosecha hasta de 75% cuando no se han manejado las malezas durante todo el ciclo de cultivo. Los primeros treinta días de cultivo, debe mantenerse libre de malezas, ya que este es el período crítico en que las malezas causan un daño irreversible y por lo tanto pérdidas en el rendimiento. Existen varios métodos de combate de malezas: el mecánico, por medio de deshierbas manuales, mediante el uso de cultivadores tirados por tractor en siembras mecanizadas y el combate químico por medio de herbicidas, método que ha demostrado ser una alternativa eficaz, oportuna y económica. Existen varios ingredientes activos que se utilizan en el combate de malezas en frijol. PARTEIII: LA PLANTA TRANSGÉNICA (Embrapa 5.1) EL PROPÓSITO DE LA TRANSFORMACIÓN La Empresa Brasileña de Investigación Agropecuaria (Embrapa) desarrolló una línea de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) genéticamente modificada (GM), en adelante denominada Embrapa 5.1. El evento Embrapa 5.1 en frijol, fue generado con el uso de la estrategia de ARN interferente o de interferencia (RNAi) 6

7 y es altamente resistente al virus del mosaico dorado del frijol [cuya nomenclatura oficial en lengua inglesa es Bean golden mosaic virus (BGMV)]. El evento Embrapa 5.1 se obtuvo a partir de la inserción de transgenes en el genoma nuclear utilizando el método de biobalística descrito por Aragão et al. (1996). Para la obtención de resistencia al virus se insertó un gen quimérico para la expresión de un ARN que contiene un par de fragmentos del gen rep (AC1) del BGMV, colocados en sentido y antisentido pero intercalados por un intrón. Ese RNA fue diseñado para formar un transcrito con secuencias de ARN bicatenario (double stranded, o dsrna) que son reconocidas por un complejo molecular de la célula, el cual genera pequeños fragmentos de ARN (small, interfering o sirna) los cuales interfieren con la expresión del gen rep viral (cf. Cuadro 1.). Como consecuencia de la falta de expresión del gen rep, la replicación viral se ve comprometida y las plantas se vuelven resistentes a la virosis. En adelante, el casette (módulo) de expresión del ARN en horquilla ( hp por hairpin que forma dsrna) será llamado ΔAC1hpRNA. Para la selección de los brotes genéticamente modificados originados de células apicales de embriones cigóticos de frijol, se insertó el gen AtAhas de Arabidopsis thaliana (también llamado csr1.2; AtAhas será la denominación aquí), junto a su propio promotor y la región 3 no traducida (3 UTR) nativa. El gene AtAhas codifica la subunidad mayor de la enzima aceto-hidroxiácido sintasa (AHAS), también llamada acetolactato sintasa, que confiere tolerancia a los herbicidas del grupo químico de las imidazolinonas. Aunque el evento Embrapa 5.1 presenta copias íntegras del gen AtAhas, se verificó que las plantas no tuvieran una tolerancia significativa a este tipo de herbicidas. La tolerancia es suficiente apenas para permitir la selección in vitro de los brotes generados a partir de células transformadas, originados a partir del meristemo apical de embriones de frijol. REGIÓN DE CULTIVO PREVISTA (COMO CULTIVO PARA AUTOCONSUMO, DE ESPECIALIDAD O A NIVEL INDUSTRIAL) El evento Embrapa 5.1 ha sido la base para el desarrollo de variedades comerciales de frijol de diversos grupos para cultivo en Brasil. El aprovechamiento de las variedades de frijol común Embrapa 5.1 GM será una importante herramienta para el control del mosaico dorado en Brasil y posiblemente, en otros países de América Latina. Como se ha mencionado anteriormente, el mosaico dorado es causado por el BGMV, el cual se transmite por poblaciones plaga de mosquita blanca (Bemisia tabaci) presentes en todas las regiones del continente donde se cultiva el frijol. Cuando se presenta la enfermedad, las pérdidas estimadas en la producción de granos puede variar de 40 a 100% dependiendo de la incidencia, la época de cultivo y el cultivar. En México, se reportan pérdidas importantes por virosis en varios estados productores, por lo que las regiones previstas para experimentación e introducción serían aquellas a nivel de alta producción comercial, donde no se reportan complejos cultivados-arvenses silvestres, estrechos (Zac, Dgo, Sin, Nay) La búsqueda de cultivares resistentes al mosaico dorado fue iniciada en la década de los 70 s habiendo sido encontrados apenas bajos niveles de tolerancia a la enfermedad. No existe, ni en Brasil ni en México, una variedad con un nivel adecuado de resistencia al mosaico dorado; tampoco se ha observado inmunidad a la enfermedad dentro del género Phaseolus. Hay tolerancia en cultivares de origen mesoamericano, especialmente vs. el Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV), pero no inmunidad. Como consecuencia de esta falta de un alto nivel de resistencia genética, el control del mosaico dorado se ha hecho dependiente de prácticas culturales para el manejo de la enfermedad por métodos de control químico del vector (mosca blanca). El principal método de control de la mosca blanca continúa siendo el químico. Se ha registrado un número aproximado de 23 principios activos para el control de la mosca blanca en frijol, aunque, pocos de ellos han mostrado ser eficientes. En pruebas realizadas en condiciones controladas, los principios activos en los grupos de los organofosforados, los piretroides, carbamatos, han sido eficientes para el control de adultos de mosca blanca B. tabaci raza A, pero ineficientes para B. tabaci raza B. 7

8 Los insecticidas del grupo de los neonicotinoides han sido eficientes en el control de adultos de mosca blanca B. tabaci raza B. Los principios activos thiamethoxan, acetamiprid e imidacloprid fueron los más eficientes en el control de la mosca blanca B. tabaci raza B. Las formulaciones de thiametoxan y de imidacloprid se utilizan en el tratamiento de semillas y en pulverizaciones. Actualmente, en pruebas realizadas con pulverizaciones de neonicotinoides, se ha verificado una reducción acentuada de la eficiencia y del efecto residual para el control de adultos. Este hecho tiene como causa principal, la exposición continua de las poblaciones de mosca blanca a los neonicotinoides, continuamente utilizados para su control. Por otro lado, se recomienda como una medida preventiva al tratamiento de semillas y pulverizaciones secuenciales con adulticidas, el establecimiento de un cultivo de frijol, con probabilidad de ser infestada por mosquitas blancas provenientes de otros cultivos, como la soya. En áreas de cultivo continuo de frijol, esta misma recomendación, no tendría el efecto esperado, porque se presenta una migración de adultos virulíferos, portadores del virus de mosaico dorado. El insecticida actúa con eficiencia en el control de adultos de mosca blanca, pero no es capaz de evitar la transmisión del virus. Además de ello, la aplicación continua de insecticidas ocasiona la elevación en los costos de producción. UN RESUMEN DE LOS ELEMENTOS GENÉTICOS INTRODUCIDOS Y SU ORIGEN (TIPO DE SECUENCIA, ORGANISMO DONADOR) Cuadro 1. Resumen de elementos genéticos en el evento EMBRAPA 5.1 ELEMENTO GENETICO* FUNCIÓN P- ahas3 Promotor y secuencia líder del gen ahas de Arabidopsis thaliana (AtAhas) CS - ahas-cds Secuencia codificante del producto AHAS (aceto-hidroxiácido sintasa) de A. thaliana que confiere resistencia al herbicida imazapyr T- ahas5 Región de terminación del gen de Atahas P-35S Promotor del ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) Fragmento del gen viral AC1 (rep) del mosaico dorado del frijol común AC1 (fragmento interno) (BGMV) involucrado en la replicación del virus I - pdk Intrón del gen pdk de Flaveria trinervia ocs3 Región terminal del gen de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens Bloque génico dentro del inserto en el genoma de frijol Embrapa 5.1, que ΔAC1 incluye 2 copias del fragmento de interferencia de 424 pb de AC1 del BGMV e incluye los fragmentos 35S, pdk y ocs3 (cf. Fig. 3) P Promotor; I Intrón; CS Coding Sequence (secuencia codificante); T secuencias 3 no traducida con señales para terminación de transcripción y poliadenilación; *cf. Fig. 3 Figura 3. Mapa esquemático del inserto pbgmvrnaiahas que contiene los elementos genéticos descritos en el Cuadro 1. Las flechas sólidas indican los iniciadores de PCR usados en el monitoreo de plantas. [Tomado de: Bonfim et al. (2007). Molec. Plant-Microbe Interact. 20(6): ] 8

9 Los análisis genético y moleculares mostraron que los transgenes fueron insertados en un único locus del genoma nuclear y que se han mantenido estables por varias generaciones de autofecundación, y después de cruzas y retrocruzas con variedades comerciales no modificadas genéticamente (no-gm). En este evento, no se encontraron secuencias funcionales del gen bla de E. coli que codifica para una beta-lactamasa (la cual confiere resistencia a compuestos beta-lactámicos como la ampicilina que es usada como marcador de selección bacteriano). Esto era lo que se esperaba, ya que el vector pbgmvrnaiahas, utilizado en la transformación del frijol, fue digerido con la enzima de restricción FspI. Como el sitio de restricción que corta esa enzima se encuentra dos veces dentro del vector y al interior de la secuencia del gen bla, la digestión del vector resulta en la inactivación del gen marcador. HERENCIA Y ESTABILIDAD DE CADA ATRIBUTO INTRODUCIDO (E.G. ANÁLISIS DE SEGREGACIÓN, INTEGRIDAD DEL INSERTO, ETC.) Figura 4. Herencia del atributo introducido. Representación esquemática de plantas de frijol GM (sombreado gris) y no-gm (cuadros blancos) en la primera generación (R 1 ) y en líneas heterócigas (R 2 ) y homócigas (R 2 H) de la segunda generación. Las plantas que mostraron síntomas de BGMV están marcados con un punto negro; las flechas indican las progenies (generación R 2 ) derivadas de las tres plantas transgénicas identificadas en la primera generación. T: líneas transformadas; C controles cv. Olathe. [Tomado de: Bonfim et al. (2007). Molec. Plant-Microbe Interact. 20(6): ] 9

10 Marcadores de peso molecular (Kpb) Figura 5. Estabilidad del inserto. Análisis (tipo Southern) de ADN genómico de frijol para detectar el módulo ΔAC1en plantas de varias generaciones (carriles 1-10: marcados en gris en panel B) del evento Embrapa 5.1. El carril 11 es una planta no-transgénica (F. Aragão, com.pers.). En hojas de frijol GM cultivados en tres localidades de Brasil (Londrina, estado de Paraná [PR]; Santo Antônio de Goiás, estado de Goiás [GO] y en Sete Lagoas, estado de Minas Gerais [MG]), fueron detectados los ARN pequeños de interferencia (sirna) codificados por el transgén insertado. Tales sirna son el resultado de la expresión del inserto ΔAC1hpRNA, que produce una horquilla de ARN bicatenaria (dsrna) que no es traducido, pero que es procesado por componentes macromoleculares de la célula para la formación de dos especies de sirna. Mas aún, los sirna se encontraron en hojas, pero se detectaron a niveles traza en las semillas frescas; en semillas cocidas no fue posible detectar sirna. Más adelante, los análisis in silico e in planta no mostraron ninguna señal de efecto off-target (ectópicos; es decir, el silenciamiento no intencional de otros genes en leguminosas, humanos y animales) y se descarta la 10

11 posibilidad de alteración bioquímica de las plantas, tal y como pudo ser observado por los análisis de caracterización agronómica y los análisis de composición nutricional. DIFERENCIAS EN VARIABILIDAD GENÉTICA Y FENOTÍPICA CON EL CULTIVO NO TRANSGÉNICO Aparte de los aspectos agronómicos (ver p. 14), esta apartado se refiere a los aspectos de equivalencia sustancial. La inocuidad para el consumo humano y animal de los transgenes expresados en el evento Embrapa 5.1 fue evaluada por varios estudios que confirmaron que la composición de este es sustancialmente equivalente al de su tipo parental, y similar al de otras variedades de frijoles cultivados en Brasil. También se llevaron a cabo estudios de alimentación con animales que no mostraron alteraciones comparados con grupos testigo que fueron alimentados con el frijol cv. parental Olathe. El frijol es fuente de fibra, proteína y hierro. Por tanto, se realizó un análisis extenso de composición de granos colectados en las localidades cultivadas de Paraná, Goiás y Minas Gerais en el año de 2008, y sólo de los dos últimos en Los granos fueron colectados y sometidos a un análisis de composición para la determinación del contenido de azúcares, de vitaminas (B 1 y B 2 ), minerales (aluminio, calcio, cobre, hierro, fósforo, magnesio, manganeso, potasio, zinc); de aminoácidos (triptófano, cisteína, metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, glicina, histidina, arginina, treonina, alanina, prolina, tirosina, valina, lisina, isoleucina, leucina, fenilalanina). Paralelamente, se determinó también el % de humedad, cenizas, proteína total, extracto etéreo, así como de la concentración de ácido fítico y de inhibidores de tripsina. En razón de no tener disponible información sobre el contenido de factores nutricionales y anti-nutricionales presentes en granos de frijol cultivados en Brasil, se generó una base de datos para este cultivo utilizando las variedades BRS Valente, Diamante Negro, Pérola, Timbó y Olathe (parental del evento Embrapa 5.1), cultivados en distintos ciclos de los años 2003 a 2007 en municipios de los estados de Goiás, Espírito Santo, Minas Gerais, Paraná y Rio Grande do Sul. Tal estudio mostró que los niveles de estos componentes son similares entre la variedad GM, su parental y las otras cuatro variedades convencionales cultivadas en Brasil.En relación a la inocuidad, los animales alimentados con sirna aislados de hojas de frijol GM no mostraron ninguna alteración bioquímica o de desarrollo en relación a los controles. Aunque la expresión del gen AtAhas fue muy reducida, a juzgar por la dificultad de detectar la proteína AtAHAS en tejidos de hoja y semillas del frijol Embrapa 5.1, los análisis realizados tanto in sillico como in vitro mostraron que esa proteína no tienen ningún potencial de alergenicidad. La predicción del potencial alergénico de las proteínas AtAHAS y SEC61 (de cuya secuencia tampoco se detectaron transcritos)requirió un análisis in silico que reveló que no tienen identidad con alergenos conocidos. Adicionalmente, la comparación de las proteínas AHAS de A. thaliana y de Phaseolus vulgaris mostró una similitud en secuencia de aminoácidos del 83% y de % en las regiones catalíticas, característica de la superfamilia de las enzimas dependientes de tiamina difosfato (ThDP). Recientemente la CTNBio en Brasil, aprobó el evento BPS-CV127 de soya genéticamente modificada la cual es tolerante a los herbicidas del grupo químico de las imidazolinonas, debido a la expresión del gen AtAhas (con el mismo fragmento de expresión usado para la generación del evento de frijol Embrapa 5.1). En este proceso, quedó demostrado experimentalmente que las proteínas AtAHAS e SEC61 no poseen características de proteínas tóxicas ni alergénicas. Para complementar esto, debe mencionarse que esas proteínas están presentes en plantas (de una forma general), y no existen antecedentes de alergenicidad para la especie donadora del gen (A. thaliana). Se analizó asimismo, el perfil protéico de los granos de las variedades GM y no-gm cultivados en localidades agrícolas de los tres estados mencionados. Las principales proteínas presentes en granos maduros de frijol fueron identificadas y los resultados revelaron que el patrón es el mismo tanto entre las variedades como entre localidades. DIFERENCIAS EN LAS MANERAS Y/O TASAS DE REPRODUCCIÓN COMPARADAS CON EL CULTIVO NO TRANSGÉNICO 11

12 Como se indicó anteriormente, por la condición autogámica más o menos generalizada de los frijoles cultivados y basados en los estudios de segregación, no se llevaron a cabo otras estimaciones de polinización cruzada, por lo que no hay datos adicionales disponibles sobre posibles tasas diferenciales de entrecruzamiento. EXPRES IÓN DE NUEVAS PROTEÍNAS EN DIFERENTES TEJIDOS A LO LARGO DEL DESARROLLO Se verificó asimismo, que el evento Embrapa 5.1, que posee copias íntegras del gen AtAhas, no tuviera en campo, una tolerancia significativa a los herbicidas de selección. Su tolerancia debe ser apenas suficiente para permitir la selección in vitro de brotes generados a partir de células transformadas, derivadas a su vez, de meristemos apicales de embriones de frijol. El evento Embrapa 5.1 no presenta tolerancia a dosis equivalentes a 1/10 de la utilizada comercialmente. Consecuentemente el evento no podrá ser utilizado como alternativa tecnológica para el control de maleza. Figura 6 Análisis de expresión de ARN en plantas de frijol por hibridación (análisis tipo Northern) y por tinción (bromuro de etidio; loading control). Las plantas fueron mantenidas por 6 días en presencia de mosquitas blancas virulíferas. Se aisló el RNA total de hojas primarias de 6 y 12 días a partir de plantas transgénicas (T) y no transgénicas (NT), inoculadas (i) o no-inoculadas (ni) con el Bean Golden Mosaic Virus (BGMV); C+ control positivo con ADN del virus. Los patrones trasferidos (blots), se hibridaron con probadores para detectar la presencia de sirna específicos, en A: fragmento de AC1 (rep), -24 y -18, marcadores de PM del ARNr; en D (arriba), el ADN del virus BGMV se detectó con un ensayo de PCR semicuantitativo para AC3; (abajo), el nivel del gen Pv18SrRNA se usó como control interno de carga equivalente. [Modificado de: Bonfim et al. (2007). Molec. Plant-Microbe Interact. 20(6): ]. DIFERENCIAS EN CARACTERÍSTICAS AGRONÓMICAS COMPARADAS AL CULTIVO NO TRANSGÉNICO La caracterización agronómica del evento Embrapa 5.1 cultivado en tres regiones de Brasil por un período de dos años, no derivó en ninguna alteración fenotípica del frijol Embrapa 5.1, cuando fue comparado con su cultivar parental Olathe. Tampoco se observaron diferencias en la germinación de las semillas, sometidas o no a un proceso de almacenamiento. Cuando se cultivaron plantas de frijol GM y no-gm en suelos de baja y alta fertilidad, no se observaron diferencias significativas en los parámetros agronómicos, reflejando que en esas condiciones, no hubo una alteración en la absorción de nutrientes. 12

13 Cuadro 2. Análisis de las características agronómicas entre las líneas de frijol Embrapa 5.1 (GM, BGMV R,) y el parental convencional cv. Olathe (no-gm, BGMV S ), en tres localidades de cultivo en Brasil. [Tomado de: Aragão & Faria (2009), Nat. Biotech 27 (12): ]. LOCALIDAD Goiás Minas Gerais Paraná Convenciona Frijol Convenciona Convenciona Genotipo Frijol GM Frijol GM l GM l l Característica* Rendimiento (Kg/ Ha) ,460 2,476 2,268 2,344 Germinación de semillas (%) Altura inicial de plantas (cm) Anchura de hojas (cm) Peso de 100 semillas (g) Tiempo a floración (dd-germ) Semillas por vaina * El análisis estadístico indicó la ausencia de diferencias significativas entre las líneas transgénicas y controles (P < 0.05; intervalo de prueba de Tukey-Studentizado, n=48). DIFERENCIAS EN SUSCEPTIBILIDAD A ENFERMEDADES O PLAGAS COMPARADAS AL CULTIVO NO TRANSGÉNICO Figura 7. Desarrollo de la virosis con BGMV en líneas de frijol común cultivadas en campo en distintos años en Brasil. Comparación de líneas modificadas genéticamente para resistencia al mosaico dorado del frijol por silenciamiento génico mediado por sirna (Olathe T lines, trazo sobre el eje de abcisas), comparado con 3 variedades no-transgénicas. La evaluación de la enfermedad se llevo a cabo visualmente, registrando la aparición del aclaramiento de nervaduras. [Tomado de: Aragão & Faria (2009), Nat. Biotech 27 (12): ] IMPACTO POTENCIAL EN ORGANISMO NO-BLANCO EN EL AMBIENTE RECEPTOR La evaluación de riesgo ambiental del evento de frijol Embrapa 5.1 implicó realizar múltiples estudios con la intención de analizar posibles efectos sobre diversos organismos que interaccionan con la planta en condiciones de campo. Los ensayos se realizaron en condiciones de invernadero y de parcela experimental en tres regiones de Brasil durante un período de dos años. Se determinó en primera instancia, la estructura así como la fluctuación poblacional de artrópodos asociados a las parcelas cultivadas con frijoles Embrapa 5.1 y convencional, tanto en la parte aérea como en la superficie del suelo. Las especies conocidas como plagas y enemigos naturales más comunes de los sistemas de producción de frijol, se identificaron visualmente utilizando los manuales correspondientes. En tales estudios fueron observadas pocas diferencias dentro de las comunidades de artrópodos en la superficie del suelo entre ambos tratamientos, lo que permite concluir que el evento Embrapa 5.1 no causa ningún efecto sobre la diversidad de artrópodos en esta zona. Considerando los análisis cualitativos y cuantitativos complementarios sobre la macro y mesofauna 13

14 (especies más abundantes en suelos bajo influencia del frijol Embrapa 5.1), se determinó que los grupos de macrofauna más abundantes fueron: hormigas, larvas y adultos de coleópteros, larvas de dípteros, isópteros y oligoquetos. La comunidad de mesofauna del suelo tuvo al grupo de los ácaros como el más representativo. El número medio de unidades taxonómicas por muestra o la diversidad promedio en cada grupos presentó una variación significativa en función de la localidad, tanto para macrofauna como para mesofauna del suelo. No obstante, no se observaron diferencias significativas en ambos tipos de comunidades, entre los suelos cultivados con frijol convencional y los del transgénico Embrapa 5.1, en cada localidad individual de ensayo. Otras evaluaciones comparativas de relevancia ecológica, incluyeron las siguientes: a). Los posibles efectos sobre Zabrotes subfasciatus, que es el principal gorgojo que ataca los granos de frijol almacenado en las regiones más cálidas de los trópicos. Para ello se estimó el efecto del frijol Embrapa 5.1 sobre el desarrollo biológico de 10 generaciones del gorgojo Z. subfasciatus. Este experimento se llevó a cabo en el Laboratorio de entomología de Embrapa Arroz e Feijão, en Santo Antônio de Goiás, GO. Los resultados demuestran que este evento biotecnológico no interfiere con los parámetros de desarrollo biológico de Z. subfasciatus. b). Estudios para determinar la producción de materia seca y acumulación de nitrógeno. Se concluyó que la producción de materia seca por las plantas de frijol varió entre los tratamientos dependiendo sólo del suelo de las diferentes localidades analizadas. c). La comparación de los dos genotipos (evento Embrapa 5.1 y su parental Olathe) mostraron un comportamiento similar frente a condiciones de estrés. Los resultados coinciden con el análisis de los mecanismos de defensa antioxidante a través de las enzimas: catalasa, ascorbato peroxidasa e superóxido dismutasa (SOD), así como las mediciones de daño celular (peroxidación lipídica) y daños a proteínas, utilizando extractos de hojas de frijol GM (Embrapa 5.1) y su parental no-gm (Olathe). En estos casos también, los resultados no mostraron diferencias entre los genotipos. d). La nodulación y dependencia por fijación biológica de N 2 por las raíces en plantas de frijol se revisó también y no se encontraron alteraciones significativas entre los genotipos comparados. e). Se estudió también la asociación de una comunidad de hongos micorrízicos arbusculares y las raíces de las plantas de frijol, por medio de: el análisis de la densidad de esporas de HMAs (hongos micorrízicos arbusculares) en la rizosfera de las plantas; la colonización de las raíces por HMA nativos y el número de especies de HMAs identificadas en la rizosfera, es decir, el censo de especies dentro de la comunidad de HMAs nativos. De una manera general, no se observaron diferencias significativas entre el frijol Embrapa 5.1 y su cv. parental Olathe no-gm, lo que indica la ausencia de alteraciones en la capacidad de micorrización debido a la modificación genética derivada del evento en cuestión. f). Se efectuó también un análisis cualitativo y cuantitativo de los microorganismos en suelo bajo influencia del frijol Embrapa 5.1. Los análisis del perfil de alfaproteobacterias en la rizósfera de plantas de frijol, se realizaron en parcelas experimentales en las localidades referidas de Paraná, Goiás y Minas Gerais. A través de los dendrogramas generados utilizando DDGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), fue posible observar que no hay cambios importantes en los agrupamientos de secuencias formados entre ambas comunidades microbianas. g). En la medición de actividades enzimáticas en el suelo cultivado con ambos genotipos en distintas regiones de Brasil, no se detectaron diferencias estadísticas entre las muestras de rizósfera asociadas con el frijol transgénico Embrapa 5.1 y el convencional (Olathe) con respecto a las actividades de las enzimas: arilsulfatasa (conjunto de enzimas del ciclo del azufre), fosfatasa ácida y β-glucosidasa. La rizósfera es la 14

15 porción del suelo que sufre influencia directa de la planta ocasionada por los exudados que produce. Las alteraciones en el patrón de actividad enzimática del suelo representada por un grupo de enzimas determinadas (i.e., fosfatasa ácida, beta-glucosidasa y aril-sulfatasa), podrían ocurrir como consecuencia de la influencia de la planta sobre la actividad biológica de la rizósfera. Las actividades de las enzimas claves del suelo, han sido utilizadas para investigar una posible integración ente los procesos bioquímicos y la calidad del suelo, reflejada en el estatus biológico del mismo. Las enzimas del grupo de las beta-glucosidasas son producidas por una variedad de organismos, entre ellos, animales, plantas, hongos y bacterias. La betaglucosidasa es una enzima que actúa en la etapa final del proceso de descomposición de celulosa, por la hidrólisis de los residuos de celobiosa, y las alteraciones en su actividad pueden tener, por tanto, influencia sobre la calidad del suelo. Por los resultados encontrados, en los estudios con las variedades de frijol, se puede concluir que la modificación genética que confiere resistencia al mosaico dorado, no implican una alteración sensible y consistente capaces de influenciar las actividades enzimáticas claves en la dinámica del C, S y P, en la rizósfera de frijol. DISPONIBILIDAD GENÉRICA DE DATOS SOBRE EXPOSICIÓIN Por la condición autógama del frijol no se ha considerado aún muy relevante llevar a cabo estudios de flujo de polen. En el caso de la difusión de proteínas, este evento no implica la producción de proteínas translocables a la superficie de la planta o difisibles al suelo; se ha demostrado que las enzimas responsables de la resistencia contra herbicidas de selección experimental, se producen y actúan a niveles insignificantes y que aún así, son inocuas. REFERENCIAS SOBRE OTRAS EVALUACIONES DE RIESGO LLEVADAS A CABO EN OTROS PAÍSES Como se observa en el presente reporte, el estudio de evaluación de riesgo sanitario, alimentario y ambiental más extenso y completo, se ha llevado a cabo en Brasil por parte de las unidades de Recursos Genéticos y de Arroz y Frijol de Embrapa. 15