Análisis de flujos metabólicos basado en marcación con 13 C

Transcripción

1 Análisis de flujos metabólicos basado en marcación con 13 C Pablo Iván Nikel Microbiología General Universidad Nacional de San Martín 2010 Técnicas tradicionales para análisis global Los estudios de análisis global son aquellos cuyo objetivo es la cuantificación de varios procesos subcelulares en forma conjunta. Uno de los ejemplos más difundidos es el análisis del transcriptoma por RT-PCR y/o microarreglos de ADN. Otro ejemplo es el análisis de proteómica, el cual estudia todas las proteínas presentes en la célula en una dada condición. 1

2 Análisis de flujos metabólicos (AFM) Es una de las herramientas más importantes de la Ingeniería Metabólica. El objetivo principal del AFM es la cuantificación detallada de todos los flujos en el metabolismo central de un organismo. Los resultados de AFMs corresponden a un mapa metabólico en el cual se muestran todos los flujos anabólicos y catabólicos de la célula. Algunas definiciones básicas Reacciones A B Vías metabólicas A B C D Flujos de intercambio Redes metabólicas A B C E Se define flujo como la producción o el consumo de un metabolito por unidad de tiempo y de biomasa Límites del sistema D Flujos internos 2

3 Metodologías para AFM: AFM estequiométrico En los años 70-80s se desarrolló el AFM basado en consideraciones puramente estequiométricas. Se basa en el conocimiento de la estequiometría de cada una de las reacciones bioquímicas que interesa estudiar. No depende de isótopos. El único requisito importante es que el sistema en estudio se encuentre en condiciones estacionarias (la concentración intracelular de los metabolitos no cambia en el tiempo). AFM estequiométrico (cont.) Las condiciones de estado estacionario se alcanzan en cultivos li continuos (quimióstatos) i o, bj bajo ciertas condiciones, en la fase exponencial de un cultivo batch o fed-batch (en este último caso, con variaciones mínimas en la tasa de alimentación del biorreactor). Se basa en ecuaciones lineales. 3

4 Condiciones de cultivo Cultivo continuo en quimióstato Mezcla de gases Efluente Velocidad de dilución D = Reservorio Medio mínimo con glucosa como único sustrato carbonado Luego de alcanzar el estado estacionario (normalmente, alrededor de 7 tiempos de residencia), la solución de alimentación se cambia por el mismo medio mínimo, pero conteniendo una mezcla de glucosa sin marcar, 13 C 1 -glucosa, y 13 C U -glucosa. Los porcentajes y tipos de sustratos marcados dependen del experimento. Control de temperatura, ph, oxígeno disuelto AFM estequiométrico (cont.) En condiciones de estado estacionario, la velocidad de conversión entre los metabolitos (en mmol h -1 g peso seco celular -1 ) debe estar balanceada en cada nodo de la red (es decir, en cada metabolito). Las ecuaciones lineales que pueden escribirse para este sistema son: v = u r w = u r p = u r q = r 4

5 AFM estequiométrico (cont.) En el ejemplo, tenemos cuatro relaciones para seis variables de flujo. El sistema puede resolverse si al menos dos flujos pueden determinarse directamente. Normalmente, se puede determinar la velocidad de consumo del sustrato, formación de un producto o subproductos (como metabolitos de excreción), evolución de CO 2,etc. Limitaciones del AFM estequiométrico No se pueden resolver sistemas como los ejemplificados a continuación: Vías paralelas en las que no se pueden medir flujos intermedios (síntesis de lisina en Corynebacterium glutamicum) Ciclos metabólicos Reacciones bidireccionales (vía de las pentosas fosfato) Balance redox y energético cerrado 5

6 Experimentos de marcación de carbono (EMC) Las células utilizan un sustrato carbonado marcado (por ejemplo, 13 C-glucosa) como única fuente de carbono. Luego de un tiempo que varía según las condiciones del experimento, cada metabolito en la red estará enriquecido en 13 C en cierta proporción, y esa abundancia isotópica podrá cuantificarse con técnicas de RMN (resonancia magnética nuclear) o EM (espectrometría de masas). Esta metodología resuelve los problemas mencionados para AFM estequiométrico. Esquema básico de un experimento de AFM Pregunta biológica Conocimiento biológico y bioquímico Especificación de la red Simplificaciones Patrón de marcación del sustrato Experimentos de marcación Conocimiento analítico Simulación de los resultados de marcación Análisis estadístico Resultados biológicos basados en los flujos intracelulares 6

7 Elección de una red metabólica adecuada E. coli MG1655 Requisitos Condiciones estacionarias. Se debe conocer el destino de cada uno de los átomos de carbono en los distintos t intermediarios i de la red metabólica. 7

8 Conceptos importantes Llamamos isotopómero (isótopo e isómero) a cada una de las formas isotópicamente marcadas de un dado metabolito. Dado que un metabolito de n átomos de carbono puede o no estar marcado isotópicamente en cada una de las posiciones, el número de isotopómeros posicionales será 2 n. Para una molécula de tres átomos de carbono, 2 3 = 8 Experimentos de marcación con 13 C-glucosa Sustrato marcado 20% glucosa sin marcar, 50% 13 C 1 -glucosa y 30% 13 C U -glucosa E. coli Suma = 100% Estado estacionario Medio extracelular + Flujos extracelulares Datos de marcación = Flujos intracelulares 8

9 Determinación de la abundancia de isotopómeros 1 H-RMN: Cada átomo de C unido a H puede ser identificado separadamente, permitiendo la cuantificación del enriquecimiento isotópico. 13 C-RMN 13 C-RMN: La señal que produce cada átomo de C unido a H depende del estado de marcación de los átomos vecinos en la molécula. Normalmente, si los átomos vecinos no están marcados, se detecta un singulete. Si uno de los átomos vecinos está marcado se detecta un doblete, y si hay más de dos átomos vecinos marcados, se produce un doblete de dobletes, etc. Determinación de la abundancia de isotopómeros (cont.) La metodología de EM es más sensible que RMN, y se acopla a la separación de los compuestos por cromatografía gaseosa (CG) o HPLC. Los compuestos eluídos se fragmentan en iones que se separan por su relación m/z. Para la separación por CG, las moléculas deben derivatizarse. Aquellos isotopómeros del metabolito con igual número de átomos marcados generan una única señal. Los compuestos no marcados también generan una señal. 9

10 Evaluación in silico de los EMCs Se establece una serie de ecuaciones que relacionan la conversión entre metabolitos en la red bioquímica. Se requiere de programas computacionales complejos que utilizan matrices para resolver dichas ecuaciones (algunos metabolitos poseen 1000 isotopómeros). La solución debe respetar las restricciones estequiométricas de las reacciones en la red. Pueden establecerse algunas restricciones matemáticas. Normalmente se basa en programas iterativos. Evaluación de los FMs 1) Se fijan ciertos valores para algunos flujos a partir de mediciones externas. 2) Se simula computacionalmente una distribución de los flujos libres siguiendo las restricciones estequiométricas, y los patrones de marcación del sustrato y los metabolitos. 3) El proceso se repite iterativamente comparando en cada ciclo la distribución isotopomérica experimental con la predicha por el modelo. Se busca minimizar dicha diferencia. 4) Con base a dichas diferencias, se pueden reajustar los valores fijados para los flujos del paso 1). 10

11 Diagrama de flujo para la evaluación de FMs Análisis estadístico de los FMs 1) Se debe analizar cuál es la sensibilidad de la distribución ib ió de FMs respecto a cambios en el valor de los flujos iniciales. 2) Para establecer comparaciones entre diversos flujos, la significancia de las diferencias se estima a través de análisis de la varianza (ANOVA) y/o test 2. 3) De ser necesario, se procede a re-calcular l las distribuciones de flujos si los resultados analizados son sospechosos (desde el punto de vista estadístico y/o biológico). 11

12 Ejemplo: AFM en E. coli Crecimiento en diversas condiciones ambientales Flexibilidad metabólica Capacidad de respuesta rápida (regulación) Regulación transcripcional jerárquica: reguladores globales Red regulatoria global en E. coli Martínez-Antonio, A., and J. Collado-Vides Curr. Opin. Microbiol. 6:

13 Hipótesis y objetivo Existe una superposición en el control del metabolismo central mediada por CreBC y ArcAB en condiciones microaeróbicas Cómo se modifican los flujos catabólicos centrales en respuesta a mutaciones en creb y(o) arca? Diseño experimental Análisis de flujos metabólicos en mutantes creb y arca de E. coli Construcción de las cepas mutantes (reemplazo alélico mediado por las funciones -Red) Cultivos de cada cepa en quimióstato (D = 0.1 h -1 ) en medio mínimo, bajo condiciones de limitación en carbono y oxígeno Marcación utilizando una mezcla de glucosa no marcada, 13 C 1 -glucosa y 13 C U -glucosa Análisis de aminoácidos marcados por GC/MS y metabolitos extracelulares por HPLC Integración in silico de las mediciones de marcación y flujos extracelulares (MATLAB TM ), y análisis estadístico Distribución de flujos metabólicos 13

14 Elección de una red metabólica adecuada Se consideraron aquellas vías metabólicas activas en condiciones de limitación en carbono y oxígeno: Glicólisis (vía de Embden-Meyerhoff-Parnas) Vía de las pentosas fosfato (rama oxidativa y no oxidativa) Ciclo de ácidos tricarboxílicos y ciclo de glioxilato Vías fermentativas Vía de Entner-Doudoroff Ciclo del metilglioxal Principales vías fermentativas Cepa parental Formato Lactato creb Pfl AckA/Pta 0,2 ± 0,0 arca 155,3 ± 0,2 91,1 ± 0,1 0,0 ± 0,0 LdhA NAD + 132,6 ± 0,0 59,6 ± 0,0 creb arca 1,3 ± 0,0 NADH 114,9 ± 00 0,0 83,4 ± 09 0,9 0,0 ± 0,0 101,3 ± 0,1 48,1 ± 0,0 Fosfoenolpiruvato Piruvato Acetil-CoA Acetato ADP ATP ADP ATP PDHc 86,5 ± 0,2 2NADH 65,3 ± 0,6 77,9 ± 0,1 CO 43,0 ± 0,2 2 47,9 ± 0,4 2NAD + 37,9 ± 0,0 89,8 ± 1,2 22,2 ± 0,0 53,4 ± 0,0 79,4 ± 0,2 15,3 ± 0,2 Etanol 38,6 ± 0,0 Cepa Velocidad específica de producción (mmol g CDW -1 h -1 ) Lactato Succinato Formato Acetato Etanol Balance de carbono (%) Parental 0,01 ± 0,00 0,49 ± 0,02 9,39 ± 0,47 6,21 ± 0,19 2,94 ± 0,16 96 ± 3 creb 0,00 ± 0,00 0,03 ± 0,01 5,86 ± 0,18 4,12 ± 0,13 1,39 ± 0,08 92 ± 6 arca 0,41 ± 0,03 0,32 ± 0,02 9,01 ± 0,37 5,16 ± 0,13 4,64 ± 0,17 98 ± 4 creb arca 0,09 ± 0,01 0,02 ± 0,01 6,63 ± 0,39 4,11 ± 0,16 2,51 ± 0,15 93 ± 7 14

15 Vista de la red metabólica completa Cepa parental creb arca creb arca Conclusiones Existe una importante regulación ejercida por los sistemas de dos componentes CreBC y ArcAB en el metabolismo central. Dicha regulación no fue evidenciada en experimentos de transcriptoma. Un punto clave de esta regulación se encuentra en los flujos a partir de piruvato. Bajo condiciones microaeróbicas, el ciclo de ácidos tricarboxílicos continúa operando en forma cíclica. 15

16 Conclusiones (cont.) El particionamiento de carbono está regulado por el tipo y disponibilidad de fuente carbonada (mediado por Cre) y el estado redox intracelular (modulado por Arc). La modulación de flujos intracelulares por manipulación de reguladores globales (en contraste con la manipulación de genes directamente involucrados en la vía de interés) ofrece una alternativa interesante para posibles aplicaciones biotecnológicas. Distintos enfoques en AFMs I) Análisis de flujos metabólicos clásico II) Redireccionamiento de flujos metabólicos 16

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