Investiga acerca del origen genético de la obesidad

Transcripción

1 Investiga acerca del origen genético de la obesidad Extrae tu propio ADN Taller de experimentación PROTOCOLO

2 Introducción En general, la incidencia de la obesidad es cada vez mayor en todo el mundo. Los científicos y los médicos, preocupados por la amenaza que conlleva para la salud, intentan comprender por qué la gente se vuelve obesa y así ser capaces de diseñar estrategias de tratamiento y prevención. En algunos casos, la obesidad puede conducir al desarrollo de Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2). La diabetes es una enfermedad que provoca unos niveles elevados de glucosa en la sangre. Las personas con sobrepeso tienen más grasa alrededor de las células, lo que hace que el cuerpo tenga más dificultades para utilizar correctamente la insulina. La insulina es una hormona que hace que las células del hígado, los músculos y el tejido adiposo tomen la glucosa de la sangre, que esta glucosa se almacene en el hígado y en los músculos en forma de glucógeno y que se detenga el uso de grasa como fuente de energía. Datos clave sobre la obesidad y el sobrepeso: La obesidad se ha más que duplicado en todo el mundo desde En 2008, millones de adultos de 20 años en adelante tenían sobrepeso. El 65% de la población mundial vive en países donde el sobrepeso y la obesidad son una de las causas principales de mortalidad. Alrededor de 43 millones de niños menores de cinco años tenían sobrepeso en (Datos de la ONU, marzo de 2011.) Los antecedentes familiares son un factor importante desde el punto de vista de la predisposición a la obesidad y a la diabetes tipo 2. Tener familiares con obesidad y con este tipo de diabetes aumenta de forma considerable el riesgo de desarrollar la enfermedad. 2

3 La investigación del origen genético de la obesidad Para estudiar el riesgo potencial asociado a los factores hereditarios en el caso de la diabetes mellitus tipo 2, los científicos basan su investigación en el ADN. Estudian muestras de ADN de individuos obesos y diabéticos y las comparan con muestras de individuos normales en busca de diferencias. La investigación se lleva a cabo primero en ratas, de las que se extrae ADN de las células musculares y del tejido adiposo. Se secuencia el ADN de las ratas para obtener el orden lineal de los nucleótidos. Esta línea de investigación ya ha permitido identificar un gen, al que se ha denominado DOR (Diabetes and Obesity Regulated, regulado por obesidad y diabetes), que actúa de manera diferente en ratas obesas y diabéticas que en ratas normales (en las que el gen se expresa en menor grado). Para secuenciar estos genes, los científicos primero tienen que extraer el ADN. Cromátida Telómero Célula Centrómero Núcleo Telómero Histonas Pares de bases ADN (doble hélice) 3

4 Qué es el ADN? El ADN, o ácido desoxirribonucleico, es una molécula orgánica responsable de almacenar la información genética necesaria para el desarrollo y el funcionamiento de todos los seres vivos, a excepción de algunos virus. Dónde se encuentra? Se encuentra en todos los seres vivos. En las bacterias, el ADN se encuentra en el citoplasma, mientras que en organismos más complejos, como las plantas, los animales y otros organismos multicelulares, la mayor parte se encuentra en el núcleo. El ADN está compactado en cromosomas en los que se encuentran codificadas las instrucciones esenciales para que un organismo se desarrolle y sea capaz de vivir. Estas instrucciones son los genes, las unidades que almacenan la información y la transmiten a los descendientes. De qué está hecho? El ADN es una molécula compuesta de repeticiones de tres tipos de moléculas: una base nitrogenada, un grupo fosfato y una pentosa. Cada unidad formada por tres tipos de moléculas se llama monómero y, dado que el ADN presenta muchas repeticiones de monómeros, decimos que se trata de un polímero. Cada uno de esos monómeros es lo que conocemos como nucleótido. Los nucleótidos contienen diferentes bases (conocidas como A, C, G y T) ordenadas en secuencia para formar una especie de código de barras. Timina Adenina Extremo 5 Extremo 3 Fosfato Esqueleto de desoxirribosa-fosfato Extremo 3 Guanina Citosina Extremo 5 Desoxirribosa (pentosa) 4

5 Objetivos Nuestro objetivo es extraer el ADN de nuestras propias células de manera rápida y fácil. Alguna vez te has preguntado cómo extrae la policía el ADN de las muestras que encuentra en la escena de un crimen? Cómo consiguen los científicos separar el ADN de las células y aislarlo de los lípidos, proteínas, glúcidos y sales? Metodología 1 Obtener la muestra El primer paso es obtener las células de las cuales extraeremos el ADN. Estas células se obtienen muy fácilmente rascando la lengua y las paredes interiores de la boca. a su vez también se degradan otras moléculas orgánicas de nuestra muestra, como las DNasas, unas enzimas cuya función es seccionar el ADN. 3. Neutralizar la carga del ADN: este proceso se realiza utilizando una sal con muchos usos diferentes: el acetato de sodio (NaAc). Los iones Na+ se unen a los grupos fosfato del ADN, que tienen una fuerte carga negativa. 2 Liberar el contenido de las células Inmediatamente, empezamos a procesar nuestra muestra en el siguiente orden: 1. Lisis: este es el proceso mediante el cual se rompen las membranas celulares y nucleares. Esto se consigue con detergentes, que permiten liberar el ADN en la solución. 2. Descompactar el ADN: utilizamos la proteinasa K, una enzima que degrada proteínas que estaban ligadas al ADN y que lo mantenían compactado. Así que cuando actúa, el ADN se descompacta y 3 Precipitar el ADN Antes de añadir etanol Después El paso final es la precipitación del ADN, que nos permitirá hacer visible lo invisible. Para esto utilizamos el etanol. El ADN es soluble en agua, pero cuando añadimos etanol, se desenrolla y precipita. Tras añadir el etanol, observamos hebras blancas que empiezan a aparecer en suspensión. Es nuestro ADN. ADN precipitado 5

6 Equipo y material necesario Instrumentos y utensilios de laboratorio micropipeta de 20 a 200 μl micropipeta de 1 a 5 ml Temporizador Material fungible Asa para rascar el interior de la boca Pipetas Pasteur de plástico Puntas para micropipeta Puntas para micropipeta más grande Tubo Falcon de 15 ml Rotulador permanente Guantes, gafas y bata 6

7 Reactivos y disolventes NaAc Proteinasa K Solución de proteinasa K -20ºC Solución de lisis hecha con sales y detergentes Solución de acetato de sodio (NaAc) Etanol frío (en congelador a -20ºC) 7

8 Procedimiento A Extraer las células epiteliales El primer paso siempre es obtener una buena muestra. Esto se consigue obteniendo muestras de la boca, donde encontramos muchas células muertas que se desprenden con facilidad y que contienen gran cantidad de ADN. 1 Prepara un tubo Falcon con 1 ml de solución de lisis. Deja el tubo abierto para facilitar los siguientes pasos. 2 Rasca con fuerza el interior de tu boca durante dos minutos, arrastrando la punta del asa a lo largo del interior de las mejillas y especialmente a lo largo de la superficie de la lengua. De esta manera, conseguirás suficientes células. 1 ml de solución de lisis Coloca el rascador en el tubo Falcon con la solución de lisis y mézclalo ligeramente. 3 Segrega saliva para ayudar a arrastrar las células que se han desprendido del epitelio. Recoge la saliva con una pipeta Pasteur y coloca todo el contenido en el tubo con la primera muestra. 4 Saca el rascador del tubo y tíralo inmediatamente (es importante no volver a metérselo en la boca). Tapa bien el tubo y mezcla su contenido por inversión. Cuanta más saliva, más ADN tendremos! 8

9 B Liberar el contenido de las células 1 Añade 20 µl de proteinasa K para romper las proteínas: apoya la pipeta en la pared del tubo y deja que el líquido resbale. 2 Tapa bien el tubo y mezcla por inversión. Déjalo incubar durante 10 minutos. C Precipitar el ADN 1 Calcula la cantidad de volumen (V) recogido aproximado mediante la gradación del tubo. Escribe el volumen aquí: V= ml 9

10 2 Añade una décima parte del volumen (V/10) de la solución de NaAc a la muestra. Por ejemplo, si tienes 1 ml de volumen inicial, añade 100 µl de acetato de sodio: 1 ml=1000 µl 1000 µl/10= 100 µl que se tienen que añadir. Haz los cálculos aquí: Cierra bien el tubo y agítalo bien por inversión. 3 4 Añade tres veces el volumen inicial (Vx3) de etanol frío. Por ejemplo, si el volumen inicial de la muestra era de 1 ml, tienes que añadir 3 ml de etanol. 1 ml x 3 = 3 ml de etanol Mézclalo muy lentamente por inversión. Tu ADN aparecerá en forma de precipitado blanquecino. Haz los cálculos aquí: ADN precipitado 10

11 Resultados y conclusiones 1 Al final de la práctica, qué has visto? Qué es lo que ha causado el resultado al final? Por qué? 2 Qué habría pasado si hubieras llevado a cabo el último paso de la precipitación con agua fría en lugar de etanol? 3 Si no hubieras llevado a cabo el primer paso de lisis, qué crees que habría pasado? 4 Por qué crees que es importante añadir la proteinasa K? Haz un dibujo de lo que crees que ha pasado cuando la añadiste. 11

12 5. Qué componente realiza la neutralización de las cargas? Por qué crees que es importante este paso? 6. Crees que este protocolo funcionaría con un cabello? Y con células vegetales? 7. Existe un protocolo de extracción de ADN parecido que utiliza agua con sal, jabón para platos y etanol. Relaciona estos componentes con los que has usado en esta práctica. 12

13 Anexo 1 Precauciones de seguridad Infórmate Localiza los elementos de seguridad del laboratorio o el espacio habilitado para experimentar (extintores, duchas o baño, salidas, etc.). Lee atentamente las instrucciones antes de realizar un experimento. No olvides leer las etiquetas de seguridad de reactivos y aparatos. Utiliza la vestimenta adecuada Guantes, bata y gafas de protección. Normas generales Está prohibido fumar, comer y beber en el laboratorio o en el lugar acondicionado para realizar experimentos. Trabaja de manera ordenada, limpia y sin prisas. Si se derrama un producto, recógelo inmediatamente. Deja siempre el material ordenado y limpio. Nunca uses equipos o aparatos sin saber cómo funcionan exactamente. Lávate las manos antes de abandonar el laboratorio. Manipulación de vidrio Protege tus manos cuando manipules materiales de vidrio y ten presente la temperatura, ya que no se puede distinguir si está caliente o frío a simple vista. No uses vidrio agrietado. Productos químicos No utilices ningún frasco de reactivos que no tenga etiqueta o que no esté debidamente identificado. No huelas, inhales, pruebes ni toques los productos químicos. Nunca pipetees con la boca. Usa guantes y lávate las manos con frecuencia cuando utilices productos tóxicos o corrosivos. Si estos productos entran en contacto con tus ojos, lávalos inmediatamente con abundante agua. No coloques envases de reactivos cerca de una llama. No calientes líquidos inflamables. Transporta las botellas sujetándolas siempre por la base, y no por la boca. Eliminación de residuos Desecha en contenedores especiales debidamente identificados los residuos sólidos y líquidos que así lo requieran. Si tienes dudas, pregunta al educador. Nunca eches residuos sólidos por el fregadero. Recuerda Si ocurre un accidente, informa de inmediato al educador. PRECAUCIONES ESPECÍFICAS PARA ESTE TALLER SDS: tóxico por ingestión, inhalación y contacto con la piel. Tris-Base: tóxico por ingestión, inhalación y contacto con la piel. Irritante. HCl: tóxico por ingestión, inhalación y contacto con la piel. Irritante y corrosivo. Acetato de sodio: tóxico por ingestión, inhalación y contacto con la piel. Proteinasa K: tóxico por ingestión, inhalación y contacto con la piel. Etanol: inflamable. 13

14 Anexo 2 Procedimientos para preparar las soluciones Receta para la solución de lisis (dada la toxicidad de algunos de los componentes a concentraciones altas, recomendamos que el educador prepare la solución previamente. Usa una mascarilla mientras preparas la solución. Una vez la solución se disuelva, ya no es necesario llevar mascarilla). Para 50 ml: - NaCl = 0,292 g - SDS = 5 ml SDS 10% - Tris HCl = 2,5 ml ph 8 Receta para NaAc Para 40 ml: - 9,84 g de NaAc. Añade HCl hasta conseguir un ph de 5,2 Receta para proteinasa K μg/ml (mantenerla congelada) Anexo 3 Referencias para adquirir los reactivos y algunos de los materiales necesarios NOMBRE REFERENCIA FABRICANTE NaCl Fluka-Sigma SDS Fluka-Sigma Tris-Base Fluka-Sigma HCl Sigma-Aldrich NaAc S G Sigma-Aldrich Proteinasa K P mg Sigma Etanol Panreac Asa de siembra estéril Sanilabo 14

15 Sigue investigando en Xplore Health! Investigadores que han contribuido con contenidos: Lorena Valverde, investigadora en la Universitat de Barcelona DESARROLLADO POR FINANCIADO POR Esta obra está bajo una licencia Reconocimiento-NoComercial- SinObraDerivada 3.0 de Creative Commons. Para ver una copia de la licencia, visita 15