Métodos de Descalcificación

Transcripción

1 Métodos de Descalcificación Dimitrius Leonardo Pitol. PhD Técnico de Laboratorio IV FORP/USP

2 2 En primer lugar, me gustaría recapitular conceptos básicos, sobre huesos y dientes. CORONA La corona esta formada por esmalte (que es la parte que contiene mas calcio en el diente) PULPA Hueso Trabeculado o Esponjoso Medula ósea roja DENTINA Hueso Cortical, Compacto o Denso

3 3 Tejido Mineralizado El tejido mineralizado contiene 33% de matriz orgánica siendo que el 28% corresponde al colágeno tipo I y los otros 5% son: Osteonectina. Osteocalcina. Proteglicanos. Sialoproteina. Proteina morfogenética ósea.

4 4 Tejido mineralizado El otro 67% corresponde a la matriz inorgánica conteniendo: fosfato, magnesio, potasio, sodio y citrato. De estos elementos, el calcio es el que se encuentra en mayor cantidad, y para estudiar los contituyentes celulares, tenemos que retirarlo del tejido.

5 5 Métodos de descalcificación Existen básicamente 3 métodos para hacer la descalcificación de tejidos: Soluciones ácidas diluidas: ejemplos (ácido clorhidrico, acido nítrico a 5 o 7%, ácido fórmico a 5%). Soluciones quelantes: ejemplo (EDTA 10%). Mezcla de soluciones ácidas + soluciones quelantes. Por ejemplo el ETDA, descalcificador Americano. también conocido como

6 Mecanismo de acción de los agentes descalcificadores Los mecanismos de acción de los agentes descalcificadores son diferentes. Cuando colocamos una muestra de hueso o diente en una solución descalcificadora como el ácido nítrico, ocurre una salida de calcio de ese tejido, hacia el líquido de la solución descalcificadora, y esto provoca una reacción química en el liquido descalcificador, dejando su solución tamponada, con esto el descalcificador pierde su capacidad de retirar cálcio del tejido. XXII CONGRESO ARGENTINO DE 6

7 7 Solución descalcificadora Ca ++ Ca ++ Ca ++ Ácido (H+) Ca ++ (PO 4 ) 6 (OH) 2 H 3 PO 4 (ácido fosfórico) + cloreto de calcio + agua

8 Mecanismo de acción de los agentes descalcificadores 8 Cuando Trabajamos con soluciones ácidas tnemos que saber la hora exacta para retirar las muestra de los descalcificadores para continuar el con la técnica histológica. Ahora, si la muestra ya es encuentra sin cálcio, y colocamos la solución ácida descacificadora, tendremos una corrosión del tejido.

9 Mecanismo de acción de los agentes descalcificadores 9 Cuando utilizamos soluciones quelantes (EDTA al 10%), la remoción de calcio ocurre de forma mas lenta, y cuando el tejido no tenga mas calcio, la solución de EDTA detendrá la corrosión sobre el tejido. En general el ph de la solución de EDTA está en torno de 7.

10 10 Descalcificadores mas utilizados Acido nítrico 5%. Acido fórmico + citrato de sódio. EDTA (ácido etileno-diamino-tetracético). ETDA (tartarato de sódio e potássio, tartarato de sódio, Acido clorídrico e H20

11 11 Acido Nítrico Aqui tenemos una imagen de un diente descalcificado con ácido nítrico 7% con coloración de tricrómica de Masson con una optima preservación, podemos ver las fibras del ligamento periodontal.

12 EDTA 10% XXII CONGRESO ARGENTINO DE 12 Esto hace que el EDTA 10 % sea un descalcificador de óptima calidad para la morfologia del tejido, y muy bueno cuando trabajamos con microscopia electrónica, inmunohistoquímica, y también para las técnicas de biologia molecular. Y la mejor decalcificador promueve la descalcificación lenta. muy lento.

13 13 EDTA 10% En esta imagen de microsopía electrónica de transmisión, tenemos a un osteocito, con las organela visibles: mitocondrias, reticulo endoplasmático, complejo de golgi. Si ese non fuese descalcificado con EDTA 10%, dificilmente observariamos las organelas. Pitol et al Braz Dent J (2007) 18(2):

14 ETDA XXII CONGRESO ARGENTINO DE 14 El ETDA quelantes y ácidas. és un descalcificador con substancias És un excelente descalcificador, permite buenos resultados en la inmunohistoquímica Promueve una descalcificación más rápida

15 15 ETDA Este es el protocolo para preparar la solución: EDTA. 0,7g Tartrato de sodio e potasio. 8g Tartrato de sodio. 0.14g HCl (Acido clorídrico) 120ml H2O destilada. 900ml

16 FEMUR ETDA DESCALCIFICADO EN 24 HORAS 16 Observen esta imagen radiográfica de un femur de rata descalcificado con ETDA. En 24 horas el hueso ya esta listo para el proceso histológico

17 17 ETDA X EDTA 10% En nuestro laboratorio realizamos este test comparativo, para evaluar la calidad de preservación del descalcificador ETDA, y lo comparamos con el EDTA 10%, utilizamos para este analisis (calvarias de ratas) hicimos la misma tinción para los dos descalcificadores.

18 18 ETDA EDTA10% Percibimos que no habia diferencias signficantes, en cuanto a la calidad de las muestras, con una ventaja para el ETDA, el tiempo de descalcificación fue de 24h, El EDTA 10% lleva de 25 a 30 dias.

19 19 Cuidados con la descalcificación El material debe ser fijado adecuadamente Debemos utilziar la concentración establecida en los protocolos. El aumento de la concentración para acelerar el procedimiento, puede dañar la muestra

20 20 Cuidados con la descalcificación Cuando utilizamos descalcificadores a base de ácido, los cambios deben ser constantes. Saber el punto ideal para parar la descalcificación.

21 21 Tiempo para cambio de descalcificador Cuando trabajamos con descacificador ácido, debemos hacer el cambio de ese descalcificador, todos los dias. Entretanto cuando usamos EDTA 10%, ese cambio debe ser realizado a cada 5 dias.

22 22 Tiempo para cambio de descalcificador EDTA Tenemos aquí espectrofotometría de absorción. Como podemos observar en esta tabla, de un artículo sobre descalcificación. Si cambiamos la solución cada día estamos gastando por nada. Pitol et al.; Int.J.Morphol 25(2): , 2007

23 23 Como saber el punto ideal de descalcificación? Saber el punto ideal para parar el proceso de descalcificación es un factor determinante, para obtener un buen resultado.

24 Métodos mas utilizados 24 Método radiográfico: es muy bueno, pero en la práctica se torna dificil, pues tendriamos que tener un Rayo X. Método cuantitativo: optima alterantiva para quien tien poca experiencia con el procesamiento de tejido óseo. Utilización de alfileres e agujas: puncionar con una aguja o alfiler en el local del espécimen que no comprometa el análisis, puede ser una buena alternativa. La Flexibilidad y el método más apropiado evaluar muestras.

25 25 Método Cuantitativo Colectar 5ml de Descalcificador del fondo del Frasco. Aumentar 1 ml de Amonio concentrado (Mezclar). Aumentar 0,1mL de Oxalato de amonio. Dejar por 10 minutos para verificar la presencia de calcio. Si no se forma precipitado aumentar 0,1mL, con un intervalo de 10 minutos. Hasta el máximo de 0,6 ml. Si no se forma precipitado, el tejido es considerado descalcificado.

26 26 Vídeo La Flexibilidad El objetivo de este video es mostrar el punto ideal de descalcificación del hueso. El hueso y el femur de una rata. Dejamos descalcificando por 24 horas ETDA

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28 Métodos para agilizar la descalcificación 28 Horno Microondas domestico: da para acelerar la descalcificación, sólo que el técnico precisa estar atento a algunas reglas para su uso. Saber donde incide el mayor número de microondas dentro del horno, trabajar con el plato fijo, colocar un becker en el forno para robar calor etc.

29 Métodos para agilizar la descalcificación 29 Pero existen también hornos microondas produciodos espcificamente para ser utilizados en el laboratorio e son mucho mas seguros.

30 30 Métodos para agilizar la descalcificación La descalcificación también puede ser acelerada por estímulos eléctricos (funciona mejor para descalcificadores ácidos) Colocamos nuestras muestra en la solución descalcificadora y dejamos los electrodos pasando corriente eléctrica.

31 Adesión de cortes en la Lámina 31 Láminas de diente o Huesos pueden soltarse de la lámina en el momento de la coloración, para que esto no ocurra lo ideal es tener cortes de 5 a 3µm de espesor y utilizar láminas tratadas con silano, polisina o láminas con carga.

32 Hematoxilina Eosina XXII CONGRESO ARGENTINO DE 32 La tinción con HE, es una de nuestras tinciones de rutina. Podemos observar una lámina de un diente, el área del cemento, área del ligamento periodontal y hueso alveolar.

33 Hematoxilina Eosina XXII CONGRESO ARGENTINO DE 33 Mandibula de camundongo o raton, podemos observar un diente, primer molar y sus raizes.

34 Tricrómica de Masson 34 La tinción com Tricómica de Masson, es una de nuestras tinciones de rutina En azul claro la dentina. DENTINA En rojo, el área con los odontoblastos. ODONTOBLASTOS Aquí en la parte mas clara con vairas células tenemos a la pulpa POLPA DENTÁRIA dentaria.

35 Tricrómico de Masson 35 Calvaria de rata corte con historesina Articulación de rodilla de raton ( Verde Luz)

36 Picro-Sirus XXII CONGRESO ARGENTINO DE 36 En la coloración de picro sirus, podemos utilizar microscopía de polarización para evidencias fibras colágenas.

37 TRAP XXII CONGRESO ARGENTINO DE 37 La coloración de TRAP (fosfatasa ácida resistente al tartrato) permite que identifiquemos los osteoclastos, como una reacción de color rojo. Aquí tenemos un corte de mandibula de rata en historesina, osteoclastos. marcando Pitol et al : Int. J. Morphol., 25(4): , 2007

38 38 Inmunohistoquímica Fijación con formol tamponado 10%. Láminas sinalizadas. Cortes 3 a 2 µm.

39 39 Protocolo del tejido óseo Dilución de anticuerpo primario em BSA. Incubación de anticuerpo por 2 horas. Un lavado de 5 minutos em PBS. Incubar con anticuerpo secundario conjugado por 40 minutos. Un lavado de 5 minutos. Aplicación de DAB (Cromógeno) por 5 minutos. Un lavado em PBS por 5 minutos. Pasar un minuto en hematoxilina, deshidratar y montar con lámina.

40 40 Anticuerpos MMP-9 Ab (CHEMICON) CD 34 Sc 9095 (SANTA CRUZ) CD 31 Ab (ABCAM) FGF BASIC Ab (ABCAM) VEGF R2 Ab2349 (ABCAM) VEGF Ab44714 (ABCAM) OSTEOCALCINA Sc (SANTA CRUZ) SIALOPROTEINA Ab 1851 (CHEMICON)

41 41 Que tiene que ver la Histotecnología aplicada al tejido óseo con las escamas de peces?

42 42 Las escamas también son estructuras rigidas, con origen en la capa mas profunda de la demis desde el tejido óseo. Colocado 12 horas en el EDTA, permite que cortes fuesen realizados sin dificultades, y identificamos las estructuras presentes. Mostrando las capas de colagenos con luz polarizada. Coloración de Orceina mostrando las fibras elásticas en el tejido epitelial.

43 43 Coloración de Alcian Blue, mostrando depósitos de polisacaridos ácidos Coloración de PAS, mostrando polisacaridos neutros

44 44 Aqui tenemos algunos de los trabajos científicos, publicados por nuestro grupo de pesquisa. Estas relevantes publicaciones se tornan posibles gracias, a la histotecnologia de calidad. La histotecnología es una herramienta indispensable para diagnósticos e investigación científica.

45 45 Agradecimientos