Producción microbiana de 1,3-propanodiol a partir de glicerol, mediante Klebsiella oxytoca NRRL B-199

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Marcos Díaz Miranda
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SusChem Plataforma Tecnológica sobre Química Sostenible Madrid, 13 de Mayo de 2009 Producción microbiana de 1,3-propanodiol a partir de glicerol, mediante Klebsiella oxytoca NRRL B-199

1 SusChem Plataforma Tecnológica sobre Química Sostenible Madrid, 13 de Mayo de 2009 Producción microbiana de 1,3-propanodiol a partir de glicerol, mediante Klebsiella oxytoca NRRL B-199 Victoria E. Santos Mazorra Fisicoquímica de Procesos Industriales y ambientales (FQPIMA) Departamento de Ingeniería Química Facultad de Ciencias Químicas Universidad Complutense de Madrid

2 Contenidos Introducción Proceso de producción de 1,3-propanodiol

3 Introducción

Introducción FQPIMA- Desarrollo de Bioprocesos BIOCATALIZADOR - Elección del biocatalizador - Manipulación genética Mantenimiento Modelo cinético del crecimiento - condiciones: medio, condiciones de

físicos (fases) - estrés hidrodinámico (daño) t 1 t 2 Modelo cinético de la producción INÓCULO Composición del medio Condiciones de operación Modelo físico del sistema Cxo (g/l) - de formas de

4 Introducción FQPIMA- Desarrollo de Bioprocesos BIOCATALIZADOR - Elección del biocatalizador - Manipulación genética Mantenimiento Modelo cinético del crecimiento - condiciones: medio, condiciones de operación - Preparación Inóculo: volumen, etapas, condiciones PRE-INÓCULO Composición medio Condiciones de operación PRODUCCIÓN - condiciones: medio, condiciones de operación - importancia fenómenos físicos (fases) - estrés hidrodinámico (daño) t 1 t 2 Modelo cinético de la producción INÓCULO Composición del medio Condiciones de operación Modelo físico del sistema Cxo (g/l) - de formas de operación Biorreactor Composición del medio MODELO Condiciones MACROCINÉTICO de operación Cxo (g/l) CAMBIO de ESCALA Planta Piloto Simulación a mayor escala? NO Experimentación a mayor escala SI Proceso Industrial

5 Introducción PRODUCCIÓN de 1,3-PROPANODIOL Directiva 2003/30/CE, 8 de mayo de 2003 fomento de uso de biocarburantes (bioetanol y biodiesel) en transportes (20%) límite 2020 Producción de Biodiesel CH I CH I CH 2 2 OOC R OOC R OOC R R' OH Catalizador R' OOC R R' OOC R R' OOC R CH I CH I CH 2 2 OH OH OH Triglicérido Alcohol Ésteres Glicerol APROVECHAMIENTO del GLICEROL Biodiesel 10 Kg glicerol por 100 Kg de biodiesel

6 Introducción PRODUCCIÓN de 1,3-PROPANODIOL 1,3-propanodiol (1,3-PD) Aplicaciones estabilizante detergentes componente mezclas anticongelantes componente aceites lubricantes componente tinta impresora humectante cosméticos monómero polímeros: polipropilentereftalato (PPT) (propiedades químicas y mecánicas, biodegradabilidad) Métodos obtención convencionales: Hidratación acroleína (20 y 40 atm., 110 y 115ºC.) Hidrorreformilación óxido de etileno (80 a 100 atm., 125 y 180ºC) Procesos costosos Corrientes residuales con alta carga contaminante

7 Introducción PRODUCCIÓN de 1,3-PROPANODIOL 1,3-propanodiol por vía biotecnológica BIO-REFINERÍA Sustitución proceso químico por bioproceso Metabolismo conocido desde s. XIX Klebsiella Metabolito primario, anaerobiosis Producción asociada a crecimiento Clostridium Citrobacter Enterobacter C j 1,3-PD Biomasa t crecimiento

8 Introducción PRODUCCIÓN de 1,3-PROPANODIOL Klebsiella pneumoniae Clostridium butyricum Patógenos DhaT DhaB DhaD DhaK Búsqueda de no patógenos Klebsiella oxytoca NRRL B199 Producción de GMO

9 Introducción PRODUCCIÓN de 1,3-PROPANODIOL Células en Crecimiento Carbono: GLICEROL Nitrógeno 1,3-PD P, Mg K, Na del crecimiento Menor producción Biomasa Ác. Láctico Ác. Succínico Ác. Acético Etanol 2,3-butanodiol

10 Desarrollo del proceso Protocolo experimental del medio de cultivo de efectos inhibitorios condiciones de operación

11 1. Protocolo de conservación 2.Preparación del inóculo (1ª y 2ª etapa de crecimiento) T = 30 ºC 210 rpm en incubadora orbital 3. Inoculación, Crecimiento y producción (biorreactor) 0,1 g/l 12 h 12 h 12 h Stock Biorreactor 2 L muestra

12 C (g/l) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 Biomasa t(h) C (g/l) 20 Toma de muestra cada hora durante 20 horas Gly 1,3-PD HAc HLac Succ 2,3-BD EtOH t (h) Análisis de biomasa: Espectrofotometría UV/VIS; 600nm Análisis de sustrato/productos: HPLC Aminex HP-87H Detector de IR

Factores Maximizar el rendimiento en la producción de 1,3-PD Concentración de glicerol s 2. Niveles bibliográficos Concentración de fosfato Ensayos 3.

13 METODO TAGUCHI ETAPAS 1. Diseño del sistema DEFINICIÓN DE OBJETIVOS 2. Diseño de parámetros IDENTIFICACIÓN de FACTORES, NIVELES Y RESPUESTAS: Maximizar el crecimiento de biomasa de K. oxytoca 1. Factores Maximizar el rendimiento en la producción de 1,3-PD Concentración de glicerol s 2. Niveles bibliográficos Concentración de fosfato Ensayos 3. Respuestas previos FACTOR Relación nivel 1 K:Na nivel 2 nivel 3 Y 1 : Concentración de biomasa máxima en fase estacionaria C x max Y 2 : Rendimiento de 1,3-PD Y 1,3-PD = Glicerol Concentración 20 g/l de MgCl 40 g/l Biomasa 80 g/l 1,2 1 Fosfato 1,5 g/l 4,5 g/l 9 g/l 0,8 0,6 K:Na 25:75 50:50 0,4 75:25 C t 1,3-PD C (g/l) 0,2 Mg 0,5mM 1mM 0 2mM t(h) C 0 gly- C t gly

14 METODO TAGUCHI 3. Planificación y ejecución del estudio Diseño factorial 3 4 = 81 experimentos Diseño 3 4 Método Taguchi= Arreglo ortogonal L9 = 9 experimentos EXP DESCRIPCION del ARREGLO ORTOGONAL L9 Nivel Factor A Nivel Factor B Nivel Factor C Nivel Factor D /75 1,5 0, /50 4, / /50 1, /25 4,5 0, /75 1, / /75 4, /50 9 0,5

15 4. Interpretación de datos Respuesta Y 1 : C X max T 1 = (2, 3, 2, 2)

16 4. Interpretación de datos Respuesta Y 2 : Y PD COMBINACIONES PREDICHAS POR EL MÉTODO TAGUCHI: T 2 =(3, 3, 2, 2) EXP Glicerol (g/l) PO (g/l) K:Na MgCl (mm) T :50 1 T :50 1

17 EXP Glicerol (g/l) PO 4 3- (g/l) K:Na MgCl (mm) T :50 1 Exp :50 1 Exp :50 1 Exp :50 1 T :50 1 C x max = 1,276 g/l Y PD = 0,719 g/g Compuesto Concentración (g/l) Glicerol 60 NaH(PO 4 ) 12H 2 O 4,5 PO 4 H 2 K 4,5 Cl 2 Ca 1 NH 4 Cl 2 KCl 7 MgSO 4 24,6 Extracto de levadura 1,5

2 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 t(h) C 1,3-PD =11.5 g/l C acetic = 1.

18 Planificación de los experimentos Elección de la concentración de los agentes inhibitorios: ,3-PD Lac Ace Succ 2,3-BD EtOH 8 Cx (g/l) t(h) C 1,3-PD =11.5 g/l C acetic = 1.45 g/l C lactic = 0,125 g/l C succinic = 0,133 g/l C 2,3-BD = 0,51 g/l = 0,098 g/l C EtOH

19 14 Experimentos Exp 1,3-PD (g/l) HAc (g/l) Hlac (g/l) Hsucc (g/l) 2,3-BD (g/l) EtOH (g/l)

20 2 parámetros para evaluar el efecto de la inhibición μ: velocidad específica de crecimiento C x C = C Xo 1 C Xo X, m exp( μ t ) ( 1 exp( μ t )) Y PG : rendimiento en 1,3-PD Y PG = C C max P Go 1,2 C x,m Cx (g/l) C x,0 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 μ Ecuación Logística t(h)

21 Efecto en la velocidad específica de crecimiento, μ. μ (h -1 ) 0,6 0,5 0,4 0,3 0 g/l 8 g/l 16 g/l 20 g/l 0,2 0,1 0 1,3-PD (g/l) Todos los compuestos inhiben el crecimiento de K. oxytoca Ácido Succínico es el agente inhibitorio más importante Concentraciones diferentes de cada compuesto no produce un incremento significativo en el efecto inhibitorio.

Rendimiento de Glicerol en 1,3-PD, Y PG YPG (g/g) 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0 g/l 8 g/l 16 g/l 20 g/l 0,1 0,05 0 1,3-PD g/l Con la concentración inicial más alta de cada compuesto se

22 Rendimiento de Glicerol en 1,3-PD, Y PG YPG (g/g) 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0 g/l 8 g/l 16 g/l 20 g/l 0,1 0,05 0 1,3-PD g/l Con la concentración inicial más alta de cada compuesto se obtiene el menor valor de Y PG La mayor influencia sobre Y PG se observa cuando se estudia EtOH como agente inhibidor Cuando C 1,3-PD > 8 g/l el efecto inhibitorio es muy significativo

(210) 2 50 3 100 4 150 5 210 Microorganismo

23 Variables estudiadas: T, N (rpm) de la Velocidad de agitación Exp N(rpm) 1 Incubadora (210) Microorganismo afectado por la velocidad de agitación Stress hidrodinámico

24 de la Velocidad de agitación 1,2 1, ,8 80 Aumento de agitación: perfil C X ( (g/l) 0,6 0, ,2 perfil de agitación 50 0, incubadora biorreactor 10 C P (g/l) t (h)

de la Temperatura (de 30 a 39 ºC) A 30, 34 y 37 ºC se

0,2 0,0 30 32 34 37 38 39 Temperatura óptima 37 ºC : -

25 de la Temperatura (de 30 a 39 ºC) A 30, 34 y 37 ºC se obtiene mayor rendimiento 1,0 Y XG (g/g) Rdto P (g/g) q p (g 1,3-PD/g biomasa h) A 37 ºC se obtiene mayor velocidad de producción 0,8 Valor del parámetro 0,6 0,4 0,2 0, Temperatura óptima 37 ºC : - Mayor rendimiento - Mayor velocidad de producción Temperatura (ºC)

26 Gracias por su atención

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