Genética de la tembladera o scrapie ovino

Transcripción

1 Genética de la tembladera o scrapie ovino David Parra, Javier Cañón Laboratorio de Genética. Facultad de Veterinaria. UCM. El scrapie, prurito lumbar o tembladera es una enfermedad degenerativa, transmisible, que afecta al sistema nervioso central de óvidos y cápridos, que pertenece al grupo de las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles, y cuyo curso es fatal para el animal que la padece. Esta enfermedad fue ya descrita en 1732 y afecta a la especie ovina de la mayoría de los paises, con la excepción de Australia y Nueva Zelanda. Se caracteriza, al igual que las demás Encefalopatías Espongiformes Transmisibles, por la acumulación de una proteína (PrP o prión) que adquiere una conformación anormal (PrP sc ) en diferentes órganos del animal afectado (Prusiner et al., 1990). Los síntomas clínicos típicos del scrapie en la oveja incluyen incoordinación motora, prurito, excitabilidad, temblores, finalizando con parálisis y la muerte del animal (Dickinson, 1976; Clark y Moar, 1992). En algunas ocasiones no cursa con estos síntomas y sólo las lesiones histopatológicas evidencian la enfermedad (Onodera y Hayashi, 1994). Aunque no ha sido caracterizado ningún agente infeccioso, hay evidencias experimentales de la existencia de diferentes tipos de scrapie (Bruce y Dickinson, 1987). Uno de los elementos centrales de esta dolencia es la proteína PrP, una glicoproteína de la superficie de la neurona que se comporta como un marcador consistente de la enfermedad. A diferencia de la proteína salvaje (PrP C ) cuya función es desconocida, la proteína alterada (PrP Sc ) es un marcador específico de la enfermedad, constituyendo la base de una de las hipótesis sobre la etiología que asigna a la propia PrP Sc como el agente infeccioso o prión catalizando la transformación del PrP C endógeno a PrP Sc, lo que impediría el normal funcionamiento de la proteína desencadenando la enfermedad degenerativa (Prusiner et al., 1990). Un modelo de herencia sencillo (Parry, 1984) se ajusta bastante bien a la hipótesis del prión como causante de la enfermedad. Sin embargo, el hecho de que pueda ser transmitida experimentalmente no encaja con esta hipótesis de enfermedad genética. Una hipótesis alternativa (Hunter, 1998) propone el control genético de la susceptibilidad permitiría solventar las inconsistencias de la hipótesis de enfermedad genética. De esta forma, lo que se

2 plantea es que la proteína salvaje actuaría como un receptor con escasa afinidad para el agente desencadenante del scrapie, mientras que la proteína mutada (PrP Sc ) tendría una mayor afinidad por dicho agente, de tal manera que sólo los portadores del genotipo mutado padecerían la enfermedad. Hoy resulta evidente la existencia de un determinismo genético para la resistencia o la susceptibilidad a la enfermedad en la especie ovina asociado a la combinación de determinados amino-ácidos en las posiciones 136, 154 y 171 de la proteína PrP. En la especie ovina, el gen prp codifica una proteína de 256 aminoácidos. En este gen se han descrito una serie de mutaciones (Figura 1), 7 de ellas en la región codificante que originan cambio amino-acídico, y una en el extremo 3 no traducido (3 -UTR) detectable mediante la enzima EcoR1 (Hunter et al., 1991). Los polimorfismos ubicados en la región codificante y asociados con la susceptibilidad a la enfermedad afectan al codón 136 (Clouscard et al., 1995; Ikeda et al., 1995) y a los codones 154 y 171 (Clouscard et al., 1995; Ikeda et al., 1995; Hunter et al., 1996). En la especie ovina, a diferencia de la especie bovina, se ha encontrado asociación entre determinados haplotipos del gen prp y la aparición de la enfermedad. Así, por ejemplo, se asocia los haplotipos V 136 R 154 Q 171, A 136 R 154 Q 171 y A 136 R 154 H 171, con la susceptibilidad a padecer la enfermedad, y los haplotipos A 136 R 154 R 171 y A 136 H 154 Q 171 con la resistencia a padecer la enfermedad (ver en la tabla 1 el significado de los diferentes símbolos). Tabla 1.- Relación entre aminoácido y su símbolo Aminoácido Alanina Histidina Glutamina Arginina Valina Símbolo A H Q R V Es evidente que, independientemente de la hipótesis correcta, conocer el genotipo de los animales, y sobre todo de los reproductores, puede resultar una información de gran interés, sobre todo si tenemos en cuenta que el comportamiento de los genotipos en relación con la susceptibilidad al scrapie puede ser diferente en las diferentes razas y también en función del origen del scrapie (Clouscard et el., 1995; Ikeda et al., 1995). Así, por ejemplo, el genotipo AA 136 RR 154 QQ 171 que aparentemente confiere resistencia al scrapie en la raza Cheviot (Hunter et al., 1996)

3 está asociado a una elevada susceptibilidad en ovejas de la raza Suffolk (Westaway et al., 1994) y otras razas francesas (Barillet et al., 2002) EcoR Región codificante 3 UTR Figura 1.- Posición de algunas de las mutaciones descritas en el gen prp En prácticamente todos los países europeos, incluido España, se ha llevado a cabo, o se está llevando, un genotipado sistemático de los tres codones mediante diferentes técnicas: PCR-RFLP (Hunter et al., 1994; Yuzbasuyan-Gurkan et al., 1999), PCR alelo-específica (Okayama et al., 1989) o Primer Extension (Syvänen, 1999) con el fin de disponer de información sobre la frecuencia de las diferentes variantes génicas y de los diferentes genotipos. Recientemente, el 14 de febrero se publicó en el DOUE (Diario Oficial de la Unión Europea) una Decisión de la Comisión por la que se fijan los requisitos mínimos para el establecimiento de programas de cría de ovinos resistentes a las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET). De acuerdo con esta Decisión, el primero de enero de 2004 tendrán que estar disponibles programas de mejora en todas las razas ovinas encaminados a incrementar la resistencia a las EET, así como un criterio para el reconocimiento del nivel de resistencia a estas EET. La participación de los rebaños en los programas de mejora podrá ser voluntaria, a criterio del país, hasta el primero de abril de 2005, siendo obligatoria a partir de esa fecha. Los programas de mejora consistirán, básicamente, en el incremento de la frecuencia de los individuos ARR/ARR, genotipo que se considera el de mayor resistencia al scrapie, y la reducción de aquellas variantes genéticas asociadas a la susceptibilidad que son fundamentalmente la VRQ y ARQ. De hecho cualquier reproductor que presente la variante del gen VRQ no sólo no podrá ser

4 utilizado para la reproducción, sino que no podrá salir de la explotación salvo para ser sacrificado. Aunque parece evidente que la susceptibilidad/resistencia al scrapie se mueve en una cierta escala entre los diferentes genotipos cuyos valores, posiblemente con pocas variaciones, pueda ser diferente entre razas (ver tabla 2) el objetivo que parece claramente imponerse es el de disponer de animales homocigotos para el alelo ARR. De hecho, la reciente Decisión publicada considera rebaños de nivel I los formados en su totalidad por animales de genotipo ARR/ARR y los rebaños de nivel II serán aquellos en los que la progenie proviene de moruecos de genotipo también homocigoto ARR/ARR, es decir, se garantiza que la progenie será portadora de al menos un alelo ARR. Tabla 2.- Consideraciones sobre la utilización como reproductores de los diferentes genotipos en la Plan Nacional contra el Scrapie de Gran Bretaña 1 ARR/ARR ARR/AHQ ARR/ARH ARR/ARQ ARQ/ARH ARQ/AHQ AHQ/AHQ ARH/ARH AHQ/ARH ARQ/ARQ * ARR/VRQ AHQ/VRQ ARH/VRQ ARQ/VRQ VRQ/VRQ Genotipo Susceptibilidad/Resistencia Se considera el genotipo más resistente al scrapie Animales considerados genéticamente resistente pero que deben manejarse con cuidado si pretenden ser utilizados como reproductores Animales con escasa resistencia al scrapie que podrán ser utilizados como reproductores libremente sólo hasta finales del año Posteriormente, con la excepción de los señalados con * se utilizarán para reproducción por un período máximo de 3 años o hasta el final de su vida. Animales genéticamente susceptibles al scrapie pero que podrían ocasionalmente ser utilizados como reproductores en el contexto de un programa de mejora aprobado 2. Animales muy susceptibles al scrapie que deberán ser sacrificados o castrados * Este genotipo es cuidadosamente vigilado y curiosamente en España, hasta donde tenemos información, es el que aparece en la mayoría de los animales afectados de scrapie 1 Es posible que algunas de estas consideraciones se vean modificadas después de la publicación de la Decisión de la Comisión 2 En este caso se valora positivamente la posibilidad que tienen estos animales de transmitir el alelo ARR que confiere resistencia al scrapie. En Francia, desde 1999, se ha puesto en marcha un programa experimental con 15 rebaños de ovejas de aptitud lechera en los que la incidencia de scrapie era elevada y que tuvo como objetivo analizar la evolución de la incidencia de la enfermedad al utilizar sistemáticamente moruecos de genotipo ARR/ARR. Los resultados para uno de los rebaños incluidos en el seguimiento aparecen en la tabla

5 3 y puede observarse una drástica reducción de la frecuencia de animales clínicamente enfermos. Esta gran reducción parece explicarse, en gran medida, porque las placentas de las hembras resultaron negativas incluso cuando la oveja era positiva al scrapie si sus corderos eran heterocigotos u homocigotos resistentes. Tabla 3.- Resultados de la utilización sistemática de moruecos ARR/ARR sobre la incidencia y el riesgo relativo al scrapie Año de nacimiento Nº de ovejas % ovejas nacidas de moruecos ARR/ARR ,1 % 5,4 % 100,0 % 100,0 % Incidencia de scrapie Riesgo relativo 1 1,000 0,975 0,856 0,184 1 Se refiere al cociente entre la proporción de afectados en el año 1997 dividido por la proporción de afectados en los otros años. Así, por ejemplo, el riesgo o probabilidad de padecer scrapie es 5,4 veces menor si se ha nacido en el año 2000 que si lo ha hecho en el año En el Laboratorio de Genética de la Facultad de Veterinaria de Madrid hemos analizado (ver protocolo de análisis en cuadro1) durante los últimos 2 años un número aproximado de 300 animales de diferentes razas ovinas autóctonas, incluida la raza Assaf aún no oficialmente reconocida pero con programas de mejora bastante desarrollados. Los resultados de las frecuencias obtenidas se presentan en la tabla 4 y se representan gráficamente en la figura adjunta. Tabla 4.- Frecuencias de las variantes alélicas y genotípicas Variante del gen ARR ARQ ARH AHQ VRQ Frecuencias medias 0,2443 0,7055 0,0388 0,0081 0,0032 Genotipo Frecuencia ARR/ARR 0,049 ARR/AHQ 0,000 ARR/ARH 0,000 0% 4% ARR/ARQ 0,392 ARQ/ARH 0,078 ARQ/AHQ 0,013 AHQ/AHQ 0,000 ARH/ARH 0,000 AHQ/ARH 0,000 ARQ/ARQ 0,463 AHQ/VRQ 0,003 71% ARH/VRQ 0,000 ARQ/VRQ 0,003 VRQ/VRQ 0,000 ARR/VRQ 0,000 24% 1% ARH ARR AHQ ARQ VRQ

6 Algunos comentarios en relación con estos resultados pueden ser de interés. La frecuencia de animales homocigotos para el alelo ARR, los únicos que se proponen como reproductores aceptables en los rebaños del nivel más elevado, es inferior al 5 %. Evidentemente una medida que pretendiera utilizar sólo este 5 % de reproductores podría dar lugar a una drástica reducción de las ganancias genéticas esperadas para los caracteres de interés económico si no se actúa con buen criterio, y esto aunque éstas características no tuvieran ninguna asociación con los diferentes alelos del gen prp. Cuadro 1.- Protocolo de análisis El ADN se extrajo a partir de sangre y de semen siguiendo protocolos estándar. La amplificación de 639 pb de ADN genómico correspondiente al gen prp se realizó en un volumen de 25 µl con la siguiente composición: 5 µl de la lisis alcalina, 0,5 unidades de Taq polimerasa (Biotools), 10 pmol de cada cebador: SCRAPOV-for: (GTGAAAAGCCACATAGGCAGTTGG) y SCRAPOV-rev: (GCTCCACCACTCGCTCCATTATCTTG), 1,5 mm de MgCl2, Buffer 1x y 200 µm de dntps. Después de purificar el producto amplificado por precipitación con etanol (con el objetivo de eliminar los restos de oligonucleótidos y dntps no incorporados) se llevó a cabo una minisecuenciación para la que se emplearon oligonucleótidos específicos diseñados a partir de la secuencia de PrP ovina AJ (Goldmann et al., 1990), con distintas longitudes para evitar el solapamiento entre productos finales (ver Tabla). Esta reacción en múltiplex se llevó a cabo en un volumen final de 10 µl, con la siguiente composición: 5 µl de kit SNaPshot (Applied Biosystem), 1 µl de PCR purificada (0.4 pmol total) y 1 µl de cada cebador a 5 µm. Previo a su carga en el secuenciador automático ABI PRISM 3100 se purificó mediante precipitación con etanol. El análisis de los fragmentos se llevó a cabo mediante el software Genescan El tamaño relativo de los fragmentos se determinó por comparación con el estandar interno de tamaño GeneScan 120-LIZ (Applied Biosystems). En la figura 3 pueden observarse la lectura de dos genotipos correspondientes a dos imágenes obtenidas mediante este método de análisis. Tabla.- Oligonucleótidos diseñados para el análisis del gen PrP ovino. Cebador Secuencia (1) Resultado (2) Prp136 GTGGCTACATGCTGGGAAGTG negro (C:A) / rojo (T:V) Prp154 TATACATTTTGGCAATGACTATGAGGACCGTTACTATC azul (G:R)/ verde (A:H) Prp171.2 TATATCCAAGTGTACTACAGACCAGTGGATC azul (G:R)/ verde (A:H o Q) Prp171.3 GCTACAGACCAGTGGATCA azul (G:H) / rojo (T:Q) 1) Todas las secuencias tienen una orientación 5-3 2) El resultado indica en primer término el color de la señal, y entre paréntesis, el nucleótido detectado (en cursiva) y correspondencia amino-acídica (en negrita). Debemos tener en cuenta que la intensidad de selección en un programa de selección depende del número de animales que se elijen en relación al número de animales disponibles. Si sólo tenemos disponibles el 5 % de la población para elegir los padres de la generación siguiente es como si de pronto el porcentaje de animales en control se redujera al 5 %. Al contrario, imaginemos que tenemos 100 moruecos

7 en evaluación y que necesitamos elegir a los 5 mejores para ser utilizados posteriormente mediante inseminación artificial. Si suponemos una distribución uniforme de los genotipos resistentes entre la clasificación por mérito genético de los 100 moruecos, los 5 machos con genotipo ARR/ARR estarían situados a lo largo de todo el rango de variación de esos 100 moruecos, por lo que la media del valor genético de estos 5 moruecos sería prácticamente igual a la media de los 100 moruecos, es decir, la intensidad de selección sería nula y nulo el progreso genético que se lograría. Figura 3.- Imágenes proporcionadas por un ABI PRISM 3100 de dos genotipos, AA 136 RH 154 HQ 171 en la parte superior y AA 136 RR 154 RQ 171 en la inferior Una posible alternativa estaría en utilizar animales heterocigotos portadores de alelos ARR, que aparacen en un porcentaje próximo al 45 %, y seguir de esta forma progresando en el incremento de la frecuencia de los alelos ARR que, como hemos comentado más arriba, confiere una significativa resistencia a los corderos nacidos incluso cuando la madre fuera positiva al scrapie.

8 Tal vez el resultado más preocupante de los que presentamos pueda ser esa elevada frecuencia de animales homocigotos para el considerado alelo salvaje ARQ (46 %), que ha sido el genotipo de casi todos los animales a los que se ha diagnosticado el scrapie. La frecuencia media de este alelo es de casi el 71 % y en todas las razas analizadas el valor es siempre muy elevado, entre el 60 y el 82 %. Por el contrario, la variante genética VRQ es muy poco frecuente en todas las poblaciones analizadas en nuestro laboratorio, incluso en la mayoría de las razas francesas la frecuencia de este alelo es inferior al 10 %. Tenemos la sensación que desde Bruselas se han precipitado decisiones que, aunque podrían tener una justificación en algunos paises, no estamos convencidos de que el coste de un programa de estas características tenga la prioridad que necesariamente tendrá que imponer nuestra administración. Necesitaremos algún tiempo para conocer con suficiente precisión cual es la frecuencia de la enfermedad, con que genotipos se asocia en las diferentes razas, y si la selección basada en estos genotipos es, como debiera, para resistencia a la enfermedad o para retrasar la aparición de la misma. Existe otra faceta de gran impacto sobre la estrategia de gestión de estos genotipos que es la que se refiere a los aspectos de sanidad, de hecho, desde el 1 de abril de 2002 la UE extendió el análisis de la encefalopatía espogiforme bovina a ovinos y caprinos a través de encuestas. Existe algún riesgo por el consumo de animales susceptibles al scrapie?. El hábito de consumo de animales muy jóvenes (< 2 meses) parece reducir, si existiera, el riesgo, aunque en algunos países recomiendan la eliminación del sistema nervioso central y aparato digestivo de los animales portadores de algún alelo VRQ. En cualquier caso, parece probable una tendencia hacia la necesidad de genotipar cualquier animal, ya sea porque va a ser utilizado como reproductor, ya sea porque va destinado a consumo. Evidentemente, aunque después de pocos años el gen será prácticamente monomórfico y la necesidad de llevar a cabo estos análisis será marginal, hasta que lleguemos a esa situación serán necesarios grandes esfuerzos para el manejo de tan elevado número de muestras en las que es necesario practicar un análisis, el genotipado, que todavía requiere un importante grado de especialización.