INFORME FINAL Convenio: Asesoría Integral para la toma de decisiones en pesca y acuicultura, 2012

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1 INFORME FINAL Convenio: Asesoría Integral para la toma de decisiones en pesca y acuicultura, 2012 Evaluación y seguimiento de la situación sanitaria de especies silvestres en agua dulce y mar SUBPESCA / Octubre 2013

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3 I N S T I T U T O D E F O M E N T O P E S Q U E R O INFORME FINAL Convenio: Asesoría Integral para la toma de decisiones en pesca y acuicultura, 2012 Evaluación y seguimiento de la situación sanitaria de especies silvestres en agua dulce y mar SUBPESCA / Octubre 2013 REQUIRENTE SUBSECRETARÍA DE PESCA Y ACUICULTURA Subsecretario de Pesca y Acuicultura Pablo Galilea Carrillo EJECUTOR INSTITUTO DE FOMENTO PESQUERO, IFOP Director Ejecutivo José Luis Blanco García Jefe División Investigación en Acuicultura Leonardo Guzmán Méndez JEFE DE PROYECTO Paola Olmos Iturrieta AUTORES Paola Olmos Iturrieta Fernando Schulze Barrientos

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5 RESUMEN EJECUTIVO El presente proyecto de investigación tuvo por objetivo establecer una vigilancia de las Enfermedades de Alto Riesgo (EAR) en peces silvestres de cuerpos de agua lacustres, estuarinos y marinos de las regiones donde se han establecido las producciones de peces salmonídeos a nivel industrial (La Araucanía, Los Ríos, Los Lagos, Aysén y Magallanes). La iniciativa consideró la evaluación de especies tanto salmonídeas como no salmonídeas, respecto de la detección de agentes patógenos virales y bacterianos, tanto exóticos como endémicos de nuestro país. La metodología diagnóstica para desarrollar la vigilancia fue a través de la técnica molecular de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en tiempo real, seleccionada debido a la rapidez, sensibilidad y especificidad de la misma, permitiendo entregar un mayor número y más confiables resultados en un menor tiempo. Dichas técnicas fueron implementadas y estandarizadas para las metodologías diagnósticas moleculares específicas para patógenos de interés, que no habían sido considerados en iniciativas previas ejecutadas por RT-PCR tiempo real para Piscine reovirus (PRV) y PCR tiempo real para Renibacterium salmoninarum (BKD). Para el caso de PRV, se diseñó un control positivo in silico y se procedió a su síntesis. Ambas técnicas fueron montadas y estandarizadas para PCR tiempo real mediante el uso de sondas, en el Laboratorio de Biología Molecular (LBM) de IFOP. Se ejecutaron dos campañas de muestreo en las 29 zonas de muestreo distribuidas en las regiones de La Araucanía, Los Ríos, Los Lagos, Aysén y Magallanes, obteniéndose un total de individuos capturados y un promedio de 155 peces por zona geográfica. De la totalidad de los peces capturados, un 44,6% (2006 ejemplares), correspondieron a especies salmonídeas. Los resultados de los diagnósticos indican que, de la totalidad de los peces muestreados, existe prevalencia de un 0% para los patógenos IHNv, VHSv, EHNv, SAv, ISAv, IPNv, F. psychrophilum, R. salmoninarum, Y. ruckerii, V. ordalii, S. phocae y A. salmonicida. Solo se obtuvo positividad para el patógeno Piscirickettsia salmonis. Las zonas de Chiloé Sur (15,54%) y Fiordo Aysén (12,5%), fueron las de más alta prevalencia para P. salmonis. Mientras que las Macrozonas 5, 6, 7 y 8 y las zonas de Capitán Aracena y Puerto Natales, no tuvieron positividad a este patógeno. Los resultados positivos se enviaron a secuenciación, confirmándose su identidad por medio de alineamiento con las secuencias disponibles en la base de datos de NCBI. Se realizó un análisis de factores de riesgo, mediante un modelo de regresión logística, resultando que las variables independientes que condicionan como factores de riesgo la aparición de peces silvestres positivos a P.salmonis, corresponden a la zona de captura, la especie capturada, el factor de condición del ejemplar capturado, la estación del año en que se efectúan las capturas, lesiones i

6 en los ejemplares capturados y la presencia de brotes de Piscirickettsiosis en los centros de cultivo del área muestreada previo y durante el muestreo de peces. La Macrozona 4, fue la que presentó la probabilidad más alta respecto de las demás zonas, con un valor de odds ratio de 2,245, siendo la única que presentó riesgo en la región de Los Lagos. Por otro lado se realizó un análisis de riesgo utilizando la opinión de un panel de expertos para definir las probabilidades de transmisión para las zonas con que no se cuenta con información a la fecha, en este caso los resultados indican que, las áreas de Caleta Tortel y Río Cochrane (Control Negativo) con un 2,78% (1,14% - 4,79%), Macrozona 3 con 3,41% (1,45% 5,77%), Macrozona 4 con 1,41% (0,25% 2,35%) y Fiordo Aysén con 1,15% (0,40% - 2,21%), fueron las zonas de mayor riesgo de transmisión de P. salmonis entre poblaciones silvestres y de cultivo. La probabilidad de incrementar el riesgo de transmisión de P. salmonis entre peces silvestres y de cultivo se asocia principalmente con la mortalidad, con cifras que variaron entre 0,59 a 0,74%. La liberación del agente al medio fue el factor que presentó los valores más bajos de correlación. El bajo impacto que tendría la infección con P. salmonis en peces silvestres, así como las consecuencias generadas a partir de ésta sobre las poblaciones cultivadas, se puede asociar con los bajos niveles de probabilidad asignados por el panel de expertos a los eventos relativos al riesgo de transmisión del agente desde los peces silvestres. Por esta razón es relevante la realización de estudios que permitan determinar de manera concreta, los niveles de probabilidad de estos eventos, y así tener estimaciones de riesgo con menores niveles de incertidumbre. ii

7 ÍNDICE GENERAL RESUMEN EJECUTIVO... ÍNDICE GENERAL... ÍNDICE DE FIGURAS... ÍNDICE DE TABLAS... ÍNDICE DE ANEXOS... Página i iii v vii ix 1. INTRODUCCIÓN OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS METODOLOGÍA Especies Objetivo Zonificación Puntos de Muestreo Artes y aparejos de pesca a utilizar para extraer los recursos Obtención de Muestras Análisis de las muestras Análisis estadístico de los resultados Organización de la información y elaboración de matriz de interacción de variables en base a estadística multivariada Conformación de panel de expertos ad hoc multidisciplinario Diseño y Aplicación de encuesta Análisis de Riesgo de la transmisión de EAR entre peces asilvestrados/silvestres/cultivo Zonificación en base al riesgo Estudios de Desafío de Eleginops maclovinus RESULTADOS Especies Objetivo Zonificación Puntos de Muestreo Artes y aparejos de pesca a utilizar para extraer los recursos Obtención de Muestras iii

8 5.6. Análisis de las muestras Análisis estadístico de los resultados Organización de la información y elaboración de matriz de interacción de variables en base a estadística multivariada Conformación de panel de expertos ad hoc multidisciplinario Diseño y Aplicación de encuesta Análisis de Riesgo de la transmisión de EAR entre peces asilvestrados/silvestres/cultivo Zonificación en base al riesgo Estudios de Desafío de Eleginops maclovinus CONCLUSIONES REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS ANEXO 1. Protocolo toma de muestras. ANEXO 2. Protocolo Q-PCR PRV tiempo real. ANEXO 3. Protocolo Q-PCR BKD tiempo real. ANEXO 4. Informe de secuenciación y alineamientos. ANEXO 5. Presentación panel de expertos. ANEXO 6. Encuesta a expertos y árbol de decisión. ANEXO 7. Protocolo estudio desafío por cohabitación. ANEXO 8. Resultados del estudio (documento borrador). ANEXO 9. Base de datos hallazgos necropsia de peces salmonídeos (CD). iv

9 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6. Figura 7. Figura 8. Figura 9. Número total de peces capturados dentro de las cinco regiones estipuladas en el proyecto según especie. Número de Peces capturados en Región de La Araucanía según especie. Número de peces capturados en Región de Los Ríos según especie. Número de peces capturados en Región de Los Lagos según especie. Número de peces capturados en Región de Aysén según especie. Número de peces capturados en Región de Magallanes según especie. Número de peces capturados por zona geográfica y especie para la región de La Araucanía. Número de peces capturados por zona geográfica y especie para la región de Los Ríos. Número de peces capturados por zona geográfica y especie para la región de Los Lagos. Figura 10. Número de peces capturados por zona geográfica y especie en la Región de Aysén. Figura 11. Número de peces capturados por zona geográfica y especie en la Región de Magallanes. Figura 12. Macrozonas SUBPESCA Región de Los Lagos y Región de Aysén. Figura 13. Curva de amplificación corrida de prueba RT-PCR PRV. Figura 14. Curvas de amplificación obtenidas para cada una de las diluciones del control positivo PRV. Figura 15. Curvas de amplificación corrida de prueba PCR BKD. Figura 16. Curvas de amplificación obtenidas para cada una de las diluciones seriadas en triplicado del control positivo BKD. Figura 17. Porcentaje de tipo de contenido gástrico encontrado en la totalidad de los peces capturados durante el periodo de la Pesca de Investigación. Figura 18. Boxplot del factor de condición en relación al tipo de agua donde se realizó la pesca de investigación. v

10 Figura 19. Boxplot del factor de condición en relación a zona geográfica de la Región de La Araucanía y Región de Los Ríos. Figura 20. Boxplot del factor de condición en relación a zona geográfica de la Región de Los Lagos. Figura 21. Boxplot del factor de condición en relación a zona geográfica de la Región de Aysén y Región de Magallanes. Figura 22. Boxplot del factor de condición respecto de la especie de pez capturada en la pesca de investigación. Figura 23. Boxplot de factor de condición en relación a la región de muestreo. Figura 24. Estado de madurez gonadal en ejemplares de especies salmonídeas capturadas. Figura 25. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de transmisión de P. salmonis en Control Negativo (Caleta Tortel y río Cochrane). Figura 26. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de transmisión de P. salmonis en Estuario de Valdivia. Figura 27. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de transmisión de P. salmonis en Fiordo Aysén. Figura 28. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de transmisión de P. salmonis en Macrozona 1. Figura 29. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de transmisión de P. salmonis en Macrozona 3. Figura 30. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de transmisión de P. salmonis en Macrozona 4. Figura 31. Análisis de factores de riesgo de las zonas vigiladas en agua de mar y estuario, dada la positividad a P.salmonis. Figura 32. Sistema de control de alimentación por cámara (Fuente Skretting S.A.). Figura 33. Sensores de conteo de pellets (1) Cono + liftup + equipo contador (2) Sensor doppler (3) Sensor infrarrojo (Fuente: Akvagroup S.A.). vi

11 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Tabla 2. Tabla 3. Tabla 4. Tabla 5. Tabla 6. Tabla 7. Tabla 8. Tabla 9. Tabla 10. Tabla 11. Tabla 12. Tabla 13. Especies a capturar en muestreos en agua de mar, según nombre común y científico. Especies a capturar en muestreos de agua dulce, por nombre común y científico. Detalle de zonas a muestrear en mar, según Agrupación de Concesiones Salmoneras (ACS). Listado de lagos a muestrear por región. Zonas de muestreo y código asignado. Agentes patógenos a analizar en el presente estudio, por tipo de ambiente. Agentes patógenos a analizar en el presente estudio, por especie susceptible. Estados de madurez gonadal de machos y hembras de salmonídeos, de acuerdo a escala macroscópica internacional. Variables analizadas en el estudio de factores de riesgo y su respectiva descripción. Número total de peces capturados y porcentaje, por zona geográfica, región y tipo de peces. Macrozonas Subpesca por región y ACS. Zonas de muestreo definidas. Partidores y sonda utilizados para el análisis de qrt-pcr PRV. Tabla 14. Volúmenes de reacción recomendados por el fabricante para el Kit LightCycler 480 RNA Master Hydrolysis Probe, Roche. Tabla 15. Tabla 16. Tabla 17. Programa utilizado para el qrt-pcr PRV en el equipo LightCycler 480 (Roche). Datos de Cp obtenidos para cada una de las diluciones del control positivo PRV. Partidores y sonda utilizados para el análisis de qpcr BKD. Tabla 18. Volúmenes de reacción recomendados por el fabricante para el Kit LightCycler 480 Master Probes (Roche). Tabla 19. Tabla 20. Programa utilizado para el Q-PCR BKD en el equipo LightCycler 480 (Roche). Datos de Cp obtenidos para cada una de las diluciones del control positivo BKD. vii

12 Tabla 21. Tabla 22. Tabla 23. Tabla 24. Tabla 25. Tabla 26. Tabla 27. Prevalencia de P. salmonis por zona de captura. Prevalencia de P. salmonis por especie. Prevalencia de P. salmonis por especie y por zona de captura. Tipo de contenido gástrico por especie capturada. Tipo de contenido gástrico por zona de captura. Valores promedio de longitud, peso y factor de condición de Fulton de las especies capturadas en las pescas de investigación. Valores promedio de longitud, peso y factor de condición de Fulton de los peces capturados respecto de la zona de obtención de la pesca de investigación. Tabla 28. Resultados prueba de Mann-Whitney con corrección de Bonferroni (p< 0,05 estadísticamente significativo) para factor de condición zona en la región de la Araucanía y región de Los Ríos. Tabla 29. Resultados prueba de Mann-Whitney con corrección de Bonferroni (p< 0,05 estadísticamente significativo) para factor de condición zona en la región de Los Lagos. Tabla 30. Resultados prueba de Mann-Whitney con corrección de Bonferroni (p< 0,05 estadísticamente significativo) para factor de condición zona en la región de Aysén y región de Magallanes. Tabla 31. Resultados prueba de Mann-Whitney con corrección de Bonferroni (p< 0,05 estadísticamente significativo) para factor de condición especie. Tabla 32. Tabla 33. Tabla 34. Tabla 35. Tabla 36. Tabla 37. Tabla 38. Porcentaje del estado de madurez gonadal en especies salmonídeas. Diseño conceptual de la matriz de interacción entre variables del centro de cultivo muestreado y resultados de la pesca de captura. Distribuciones ajustadas y sus parámetros para cada etapa del análisis de riesgo. Probabilidad de transmisión y estimación de la mortalidad a nivel de centro de cultivo producto de la transmisión de P. salmonis desde peces silvestres. Variables retenidas del análisis univariado y sus respectivos estadísticos. Variables retenidas en el modelo final (análisis multivariado) y sus respectivos estadísticos. Zonas propuestas para muestreo en el contexto del Programa de Vigilancia Específico de EAR en peces silvestres. viii

13 ÍNDICE ANEXOS Anexo 1. Anexo 2. Anexo 3. Anexo 4. Anexo 5. Anexo 6. Anexo 7. Anexo 8. Anexo 9. Protocolo toma de muestras. Protocolo Q-PCR PRV tiempo real. Protocolo Q-PCR BKD tiempo real. Informe de secuenciación y alineamientos. Presentación panel de expertos. Encuesta a expertos y árbol de decisión. Protocolo estudio desafío por cohabitación. Resultados del estudio (documento borrador). Base de datos hallazgos necropsia de peces salmonídeos (CD). ix

14 1. INTRODUCCIÓN En el ambiente acuático donde se desarrolla la actividad acuicultora, existe una fauna de ejemplares silvestres de gran diversidad, compuesta por peces nativos y especies introducidas, dentro de las que se encuentran especies salmonídeas que se adaptaron a los ecosistemas marinos y dulce acuícolas, provenientes de proyectos de cultivo con sistema de ranching, o por efecto de escapes accidentales desde centros de cultivo (Soto et al. 2001, 2004), conjunto que interactúa con especies salmonídeas en confinamiento en los centros de cultivo. Es en este entorno cercano a las balsas jaulas, donde cohabitan todos estos grupos, permitiendo que exista un grado de asociación e interacción con un mismo ambiente, en forma recíproca y dinámica (Intesal, 2000). El crecimiento explosivo del cultivo de cualquier especie animal involucra un aumento en el riesgo de introducir y/o diseminar enfermedades que afectan directamente la salud de los mismos organismos cultivados e indirectamente a la biota local. En este contexto, el desarrollo a gran escala de la salmonicultura en nuestro país no ha estado exento a dicha realidad y ha debido enfrentar la aparición y diseminación de varias enfermedades que, en algunos casos, han llegado a transformarse en patologías endémicas en los salmones cultivados en el sur de Chile, como por ejemplo, la Piscirickettsiosis y la Necrosis Pancreática Infecciosa (IPN) (Campalans et al. 1995). Sumado a lo anterior, en los últimos años se han presentado otras enfermedades de carácter emergente que han afectado directamente el estatus sanitario nacional, entre ellas se encuentran la Vibriosis, Estreptococosis, Furunculosis atípica y finalmente, la Anemia Infecciosa del Salmón, cuyo primer brote fue reportado oficialmente el 25 de julio de 2007 (SERNAPESCA, 2007) para balsas flotantes en aguas marinas. Para el caso de las aguas continentales de Chile, las enfermedades infectocontagiosas se limitan principalmente a enfermedades micóticas y otras tales como la enfermedad entérica de la boca roja (ERM) causada por Yersinia ruckerii, la enfermedad del pedúnculo producida por Flavobacterium psychrophilum, que origina desde necrosis ulcerativa de la piel hasta una infección sistémica en los peces afectados (León et al. 2009), y la furunculosis atípica, causada por Aeromonas salmonicida atípica, entre otras, cuya ocurrencia está muy relacionada con factores de manejo (Campalans et al. 1995). Frente a este panorama, a nivel internacional, países con sectores acuicultores de importancia han desarrollado numerosas investigaciones a objeto de poder determinar el riesgo de transmisión horizontal de enfermedades entre peces cultivados, peces de cultivo escapados y otros peces silvestres. La probabilidad de que los patógenos de peces silvestres interactúen con salmones de cultivo, es un hecho real y que debe ser evaluado a través del tiempo, sin embargo, se desconoce cuáles de éstos agentes podrían ser patógenos para ambas poblaciones, y que significancia o importancia podría tener este fenómeno en las dinámicas poblacionales en el medio acuático (Intesal, 2000). Es así como existen trabajos que han descrito la presencia de agentes patógenos para las poblaciones en cultivo, tanto en peces silvestres como en moluscos y crustáceos, como es el caso de Piscirickettsia salmonis (Garcés et al. 1991). En relación a los agentes virales, destaca el 1

15 virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa, el que también ha sido registrado en especies nativas (Murray et al. 2003). En consecuencia, se ha considerado de gran valor epidemiológico iniciar estudios que permitan ir despejando incógnitas y especulaciones para finalmente poder establecer cuál es la relación existente entre las especies salmonídeas de confinamiento y los peces nativos circundantes a las estructuras flotantes que los contienen, pertenecientes a la fauna íctica de estos sistemas (Intesal, 2000). Al respecto, estudios previos desarrollados demuestran que tanto la trucha café (Salmo trutta) como la trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) pueden actuar como reservorios silvestres del ISAv (Nylund et al. 1995) En cuanto a otras especies no salmonídeas, no ha sido posible demostrar que existan estados infectivos o portadores, así como tampoco el demostrar la existencia de transmisión horizontal entre peces no salmonídeos y peces salmonídeos, a través de estudios de cohabitación. En consecuencia, los resultados anteriores nos indican que a la fecha faltan evidencias científicas para establecer que otras especies, distintas de las salmonídeas, sean reservorios del agente viral o se vean afectados por la enfermedad (Joint Goverment/Industry Working Group, 2000). Para el caso del virus de la Anemia Infecciosa del Salmón en particular, no se han reportado resultados positivos a la búsqueda del patógeno o signología clínica de la enfermedad (Stagg et al. 1999). En términos de avances en materia diagnóstica, cabe destacar los métodos moleculares, los que se han transformado en importantes herramientas en el diagnóstico y el estudio de la diversidad, mantenimiento y diseminación de agentes patógenos, principalmente los de carácter viral (Hungnes et al. 2000). Actualmente se encuentran descritas las técnicas de PCR para todos los patógenos presentes en la lista 1 de enfermedades de alto riesgo (EAR), definida por el Servicio Nacional de Pesca, como a su vez del virus de la Anemia Infecciosa del Salmón (ISAv), Vibrio ordalii, Piscirickettsia salmonis y Aeromonas salmonicida atípica. Las técnicas inclusive se encuentran adaptadas en algunos casos, para mejorar su sensibilidad de detección en peces silvestres, como es el caso del RT-PCR ISAv descrito por Cunningham & Snow (2000). En función de lo descrito anteriormente, países del hemisferio norte como Escocia y Noruega han realizado una serie de investigaciones para determinar el rol que pueden jugar los peces silvestres y asilvestrados, como un factor de riesgo en la diseminación de enfermedades tanto a peces de cultivo como entre las poblaciones silvestres/asilvestradas (Raynard et al. 2001; Plarre et al. 2005, Johansen, 2011). En este contexto, es necesaria una aproximación a la evaluación del riesgo asociado a la transmisión de EAR entre poblaciones de peces silvestres/asilvestrados/cultivo por medio de técnicas moleculares que permitan la detección, cuantificación y caracterización de estos patógenos en las regiones donde existe cultivo intensivo de especies salmonídeas, dirigiendo el estudio a sectores representativos de las regiones de La Araucanía, Los Ríos, Los Lagos, Aysén y Magallanes, tanto en cuerpos de agua marina, dulce y estuarinas. En consideración a lo planteado, el Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) asumiendo su rol de garante técnico y unidad encargada de entregar las bases científicas para la elaboración de la normativa y regulación del sector acuicultor, aparece como la entidad con la natural competencia para asumir dicha iniciativa. 2

16 2. OBJETIVO GENERAL Efectuar una evaluación y seguimiento del estatus sanitario de las especies silvestres en cuerpos de agua dulce y salada, donde existan concesiones de acuicultura destinadas al cultivo de especies salmonídeas o se consideren epidemiológicamente relevantes, por parte de la autoridad 3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Continuar con la ejecución del programa de vigilancia y monitoreo que permita conocer la evolución del estatus sanitario de las especies silvestres, en relación con las enfermedades de alto riesgo (EAR). 2. Actualizar la propuesta de zonificación desarrollada en proyectos anteriores en base a los resultados del análisis de riesgo de transmisión de una EAR entre peces silvestres/escapados /cultivos. 3. Identificar puntos de muestreo considerando la zonificación propuesta por la Subpesca y Sernapesca 4. Identificar si los peces salmonídeos capturados que resulten positivos a una EAR corresponden a peces escapados y asilvestrados. 5. Obtener información en relación a la dieta de los peces capturados y relacionarla con los resultados de diagnósticos obtenidos 6. Identificar el tamaño y etapa del ciclo de vida de los peces capturados. 7. Caracterizar y cuantificar el riesgo de transmisión de una EAR entre peces silvestres/escapados/cultivo. 8. Relacionar epidemiológicamente los brotes de EAR en peces de cultivo con el estatus sanitario de las especies silvestres muestreadas. 9. Identificar y evaluar la capacidad de que especies no salmonídeas puedan actuar como reservorio de una EAR. 10. Proponer políticas públicas relacionadas con la mitigación de los riesgos de transmisión previamente identificados. 3

17 4. METODOLOGÍA La metodología utilizada en la presente iniciativa se detalla de acuerdo a los objetivos específicos establecidos: Objetivo 1: Continuar con la ejecución del programa de vigilancia y monitoreo que permita conocer la evolución del estatus sanitario de las especies silvestres, en relación con las enfermedades de alto riesgo (EAR). Objetivo 2: Actualizar la propuesta de zonificación desarrollada en proyectos anteriores, en base a los resultados del análisis de riesgo de transmisión de una EAR entre peces silvestres/escapados/cultivo. Objetivo 3: Identificar Puntos de Muestreo considerando la zonificación propuesta por la Subpesca y Sernapesca Especies Objetivo Mediante las actividades de pesca en agua de mar, se pretendió capturar salmonídeos asilvestrados como: O.mykiss, O. kisutch, S. salar, O. tshawytscha y Salmo trutta fario, como también, las especies de peces nativos de mayor incidencia descritos en estudios previos (ASIPA 2011, IFOP) tales como róbalo (Eleginops maclovinus) y pejerrey (Odonthestes regia) (Tabla 1). En el caso de la pesca en agua dulce, las especies a capturar se detallan en la Tabla 2. Tabla 1. Especies a capturar en muestreos en agua de mar según nombre común y científico. Nombre común Salmón del Atlántico Salmón Coho Trucha Arcoiris Salmón Chinook Trucha fario Pejerrey Róbalo Nombre Científico Salmo salar O. kisutch O.mykiss O. tshawytscha Salmo trutta fario Odonthestes regia Eleginops maclovinus 4

18 Tabla 2. Especies a capturar en muestreos de agua dulce por nombre común y científico. Nombre común Salmón del Atlántico Salmón Coho Salmón Chinook Trucha Arcoiris Trucha fario Pejerrey Perca Trucha Peladilla Puye Grande Nombre Científico Salmo salar O. kisutch O. tshawytscha O.mykiss Salmo trutta fario Basilichthys australis Percichthys trucha Aplochiton taenniatus Galaxias maculatus 4.2. Zonificación Se definieron 32 zonas de muestreo en mar y lagos de la Región de La Araucanía, Región de Los Ríos, Región de Los Lagos, Región de Aysén y Región de Magallanes, las que se detallan en las Tablas 3 y 4. Cada zona fue caracterizada por medio de un ranking de riesgo establecido en proyectos anteriores ejecutados por IFOP, en el marco de la Asesoría Integral en Pesca y Acuicultura (ASIPA) desarrollada para la Subsecretaría de Pesca y Acuicultura. A su vez, se consideró una zona blanco sin historial de presencia de centros de cultivo de especies salmonídeas. La orientación de los muestreos a su vez contempló la zonificación epidemiológica establecida por SERNAPESCA en las resoluciones Nº 1577 y la resolución Nº 2117, que establecen la condición epidemiológica de las Agrupaciones de Concesiones Salmoneras (ACS), en función de su condición sanitaria para ISAv y Caligidosis respectivamente. Debido a que la condición epidemiológica de estas áreas es dinámica en el tiempo, se mantuvo directa comunicación del director de proyecto con los responsables de los respectivos programas en el Servicio Nacional de Pesca y Acuicultura, para identificar zonas consideradas prioritarias en el desarrollo de los muestreos, dada su condición de infectada por detección de variantes patogénicas de ISAv o debido a que presenta cargas de Caligus superiores a los límites superiores establecidos por la normativa. A su vez, la zonificación consideró los resultados de vigilancia derivados de proyectos anteriores, tomando en cuenta el diagnóstico o emergencia de enfermedades señaladas en la Tabla 7. La información epidemiológica de las respectivas zonas, a su vez se actualizó en forma mensual mediante la recepción de un informe consolidado entregado por una empresa subcontratada, que contempla un 85% de representatividad de la industria para las ACS, y que entregó la siguiente información: 5

19 - Agrupaciones de Concesiones de Salmonicultura, ACS a) Programa Descansos. - Disponibilidad de Ovas b) Disponibilidad Histórica. c) Origen Ovas Importadas. - Ingresos Smolt por ACS d) Número de smolts Ingresados. e) Distribución de Ingresos Smolt por ACS. f) Peso Ingreso Smolt. g) Origen Smolts. - Cosechas h) Toneladas Cosechadas y Peso Promedio Cosecha por ACS. i) Distribución Cosechas por Área Geográfica. - Biomasas: j) Distribución biomasa viva por Área Geográfica. k) Biomasa por especie y por ACS. - Mortalidades l) Mortalidades Mensuales Generales, Región y ACS. m) Mortalidades por Causa, Generales, Región y ACS. - Uso Vacunas n) Representatividad BD vacunas. o) Número smolt sembrados según vacuna. p) Evolución Número Antígenos Utilizados. q) Pesos vacunación. 6

20 Tabla 3. Detalle de zonas muestreadas en mar según Agrupación de Concesiones Salmoneras (ACS). ZONA AGRUPACIÓN DE CONCESIONES SALMONERAS Estuario de Valdivia (Valdivia) Estuario de Reloncaví 1 Seno de Reloncaví 2,3 Hornopirén 17 Chiloé Norte 6,7 Chiloé Central 8,9,10 Chiloé Sur 11,12 Fiordos Norte 1 33,34,35 Fiordos Norte 2 30,31,32 Fiordos Sur 1 26,27,28 Fiordos Sur 2 25 Guaitecas 1 19,22,23 Guaitecas 2 21,29 Melinka 18 Magallanes 1 (Puerto Natales) Magallanes 2 (Punta Arenas) Tabla 4. Listado de lagos muestreados por Región. Región Nº Detalle Araucanía 4 Caburga Calafquén Colico Villarrica Los Ríos 3 Ranco Panguipulli Riñihue Los Lagos 7 Chapo Yelcho Llanquihue Rupanco Puyehue Natri Huillinco Aysén 1 Riesco Magallanes 1 Sofía TOTAL 16 7

21 4.3. Puntos de muestreo Se realizaron dos campañas de muestreo para cada zona, las que fueron ejecutadas a contar de noviembre de 2012 y hasta junio de Cada campaña de muestreo contempló la captura de un mínimo de 80 ejemplares por zona considerando al menos un 15% de ejemplares pertenecientes a especies salmonídeas. Los ejemplares fueron capturados por medio de pesca de investigación en las concesiones de mar, estuario y lago, autorizada por la Resolución Exenta N 2549, de la Subsecretaría de Pesca y Acuicultura. En cada campaña de muestreo se consideró dar cumplimiento a las medidas de bioseguridad impuestas por SERNAPESCA mediante la resolución Nº 332 de 2011 para el control de la diatomea Dydimosphenia geminata. Cada zona geográfica consideró un total de 3 puntos de muestreo georreferenciados. Los puntos fueron definidos considerando los siguientes factores para cada una de las zonas previamente señaladas: Proximidad a centros de cultivo. Cuencas de ríos aledañas. Cercanía a afluentes de pisciculturas y/o plantas de proceso. Condiciones oceanográficas. Antecedentes de retorno de reproductores de especies salmonídeas. Antecedentes de salida de crías de especies salmonídeas Artes y aparejos de pesca a utilizar para extraer los recursos Los recursos hidrobiológicos fueron capturados mediante el uso de artes y aparejos de pesca, según las características de cada especie y zona de interés. De esta forma, se utilizaron redes de trasmallo de monofilamento de distintas tramas considerando como mínimo una disponibilidad de 14 redes por zona de muestreo de al menos tres tramas (2, 4 y 6 pulgadas), con largo de relinga distribuido en un rango de 20 a 60 metros y una altura de red de 3 a 15 metros. Los lances fueron ejecutados con caladas perpendiculares cercanas a la costa en base a la información descrita en estudios anteriores (Soto, 2002). En la pesca en lagos, a su vez, se utilizaron artes de pesca complementarios para el cumplimiento de los objetivos, como cañas de pescar para realizar principalmente pesca de arrastre con señuelos tipo rapala y spiner en los puntos de muestreo donde por profundidad y topografía permitan su utilización tales como cuencas de ríos, puntos próximos al desagüe de cada lago o zonas someras con transición de vegetación terrestre de cada lago. Las operaciones de calado y virado de los artes y/o aparejos de pesca, estuvieron a cargo de terceros, subcontratados para estos fines, definidos mediante licitaciones privadas en las que se indicaron las exigencias impuestas por IFOP para la ejecución de la actividad y los montos involucrados. A su vez, cada una de las actividades de pesca fue supervisada por personal de IFOP. La captura de cada punto de muestreo fue dispuesta en bolsas etiquetadas y transportadas al laboratorio en cajas de material termoaislante, conteniendo hielo en escamas o gel pack para su conservación. 8

22 Los códigos establecidos para cada una de las zonas de estudio se presentan en la Tabla 5. Tabla 5. Zonas de muestreo y código asignado. Zona de muestreo Estuario de Valdivia Estuario de Reloncaví Seno de Reloncaví Hornopirén Chiloé Norte Chiloé Sur Chiloé Central Melinka Guaitecas 1 Guaitecas 2 Fiordo Norte 1 Fiordo Norte 2 Fiordo Sur 1 Magallanes 1 Magallanes 2 Fiordo Sur 2 Lago Llanquihue Lago Chapo Lago Riesco Lago Huillinco Lago Natri Lago Sofía Lago Caburga Lago Calafquén Lago Colico Lago Villarrica Lago Ranco Lago Panguipulli Lago Riñihue Lago Yelcho Lago Rupanco Lago Puyehue Código EV E S H ChN ChS ChC M G1 G2 FN1 FN2 FS1 PN PA FS2 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 L11 L12 L13 L14 L15 L Obtención de muestras Los ejemplares capturados en cada una de las zonas y puntos de muestreo previamente definidos, fueron clasificados por fecha de muestreo, coordenada y especie. A cada uno de los ejemplares se les efectuó un muestreo biológico registrando los pesos y longitudes de los peces. 9

23 A partir de estos registros se calculó el factor de condición de los ejemplares y se elaboraron curvas para establecer la distribución de las tallas de los ejemplares en cada uno de los puntos de muestreo. Para cada ejemplar se registró sexo y estado macroscópico de madurez gonadal equivalente a la empleada por Niklitschek y Aedo 2002, con el objetivo de establecer la etapa del ciclo de vida de los peces capturados. Una vez efectuado el muestreo biológico se realizó la necropsia enfocada a describir anomalías en base a comparación de los ejemplares observados en cada muestreo. De cada pez se extrajeron por separado una muestra de aproximadamente 0,5 centímetros cúbicos de cada uno de los órganos: riñón, corazón, branquias y bazo, los cuales en conjunto constituyeron un pool de órganos. Los análisis, fueron distribuidos en conformidad a la proporción de las especies capturadas y la susceptibilidad o estado de portadores indicadas en el Manual de Diagnóstico de Enfermedades Acuáticas de la OIE (OIE, 2009) para cada uno de los agentes en estudio y antecedentes científicos disponibles. Las muestras obtenidas fueron procesadas en instalaciones dispuestas en terreno en las dependencias de IFOP en la zona de Aysén, Magallanes y Chiloé y/o enviadas al laboratorio de IFOP Puerto Montt en el caso de las muestras provenientes de la Región de La Araucanía, Región de Los Ríos y Región de Los Lagos continente, manteniendo una temperatura inferior a los 10 C con hielo y fijadas en etanol absoluto para biología molecular Análisis de las muestras Los análisis de las muestras se llevaron a cabo en las instalaciones de la División de Investigación en Acuicultura del Instituto de Fomento Pesquero. Las muestras fueron analizadas en forma individual por medio de la metodología de PCR tiempo real en función del patógeno en cuestión, de acuerdo a los protocolos montados en el Laboratorio de Biología Molecular de IFOP. Para el caso de Piscine reovirus (PRV) y Renibacterium salmoninarum (técnicas comprometidas para el presente proyecto), se implementaron las técnicas de RT-PCR y PCR tiempo real mediante sondas Taqman, considerando los respectivos controles positivos. Las metodologías fueron homologadas para el tipo de muestra y las condiciones del laboratorio para los patógenos de interés en este estudio. Para PRV se utilizó la metodología sugerida por Haugland et. al, 2011, mientras que para BKD la referencia corresponde al trabajo de Chase et. al, Los patógenos de interés en este estudio se señalan clasificados por tipo de ambiente, en la Tabla 6 y según especie susceptible en la Tabla 7. En el caso de Alfavirus y virus ISA, se utilizaron las técnicas oficiales definidas por SERNAPESCA, las que se encuentran montadas en el Laboratorio de Biología Molecular de IFOP. Para el caso de P.salmonis se incorporó el monitoreo en peces silvestres provenientes de cuerpos de agua con influencia marina tales como el lago Huillinco, donde se encontraron peces positivos a este patógeno en estudios anteriores. En el caso de cuerpos de agua dulce se consideraron los antecedentes de presencia de reproductores en pisciculturas cuyos afluentes tengan influencia en el 10

24 cuerpo de agua (Gaggero et al, 1995) en base a información entregada por el Sernapesca y Subpesca, previo a la elaboración del calendario y propuesta de muestreos. La extracción de DNA o RNA se realizó mediante la utilización de kits comerciales. Tabla 6. Agentes patógenos analizados en el presente estudio, por tipo de ambiente. Patógenos Muestreos Agua Muestreo Muestreo Agua Dulce Estuario Mar Virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (IPNV) X X X Virus de la Septicemia Hemorrágica Viral (VHS) X X X Virus del Oncorhynchus massou (OMV) X X X Virus de la Necrosis Hematopoyética Infecciosa (IHNV) X X X Virus de la Necrosis Hematopoyética Epizoótica (EHNV) X X X Piscine reovirus (PRV) X X X Alfavirus de los salmonídeos (SAV) X X X Virus de la Anemia Infecciosa del Salmón (ISAV) X X X Piscirickettsia salmonis No aplica X X Renibacterium salmoninarum X X X Flavobacterium psychrophilum X No aplica No aplica Aeromonas salmonicida*, Vibrio ordalii, Yersinia ruckerii*, Streptococcus phocae, (solo en caso de brote, * solo agua dulce) X X X Tabla 7. Agentes patógenos analizados en el presente estudio, por especie susceptible. Tipo de Agente Análisis en Salmonídeos Análisis en no salmonídeos PRV PRV (30%) VHS VHS (30%) OMV EHNV (30%) Virus IHNV Alfavirus (30%) EHNV IPNV Alfavirus ISAV IPNV ISAV P.salmonis P.salmonis R. salmoninarum R. salmoninarum Bacterias F. psychrophilum F. psychrophilum TOTAL 9 7 En caso de Brote Tipo de Agente Análisis en Salmonídeos Análisis en no salmonídeos S. phocae S. phocae Y. ruckeri Y. ruckeri A. salmonicida A. salmonicida Bacterias Vibrio ordalii Vibrio ordalii 11

25 Para las muestras positivas, se realizó la secuenciación de los productos de PCR previamente purificados utilizando columnas comerciales de purificación (Qia-quick PCR purification, Quiagen). Los resultados de las secuencias fueron contrastados con los productos de PCR esperados, y a su vez, comparados con las secuencias disponibles en el banco de Genes de NCBI para corroborar que sean un indicador del patógeno pesquisado. El resultado positivo fue inmediatamente notificado a la Subsecretaría de Pesca y Acuicultura, y las contramuestras respectivas quedaron a disposición de esta entidad, para la verificación del resultado bajo los protocolos que la autoridad estimó apropiados Análisis estadístico de los resultados Se utilizó estadística descriptiva utilizando el software STATISTICA v.7.1. StatSoft, Inc. (2005) para analizar los datos y análisis de varianza para identificar diferencias intra e inter grupos. Objetivo 4: Identificar si los peces salmonídeos capturados que resulten positivos a una EAR corresponden a peces escapados o asilvestrados. Para lograr diferenciar salmones silvestres de escapados se utilizaron principalmente criterios morfológicos. Los ejemplares de salmonídeos capturados en sectores donde existan centros de cultivo activos en los tiempos de muestreo (salmón coho, trucha arcoiris y salmón del Atlántico,) se diferenciaron utilizando criterios morfológicos basados en el deterioro dado por las condiciones de cultivo. Estos efectos aparecen en las aletas pectoral, dorsal y anal, en el opérculo y la nariz entre otras, aspectos descritos en la literatura (Soto et al. 1997; Cadrin et al. 2005). Objetivo 5: Obtener información en relación a la dieta de los peces capturados y relacionarla con los resultados de diagnóstico obtenidos. Para caracterizar la dieta de los ejemplares capturados, durante la necropsia se describió el contenido estomacal de cada uno de los peces de especies salmonídeas, indicando la presencia de alimento natural o pellet. Esta información estuvo principalmente enfocada a establecer relaciones epidemiológicas con los resultados de diagnóstico positivos obtenidos, y orientada a la pesquisa de alimento comercial en los ejemplares capturados fuera de las concesiones salmoneras. El dato capturado en este punto del muestreo fue un dato de categoría, indicándose presencia o ausencia de contenido gástrico, como a su vez presencia o ausencia de alimento comercial. Los resultados fueron entregados en términos de frecuencia porcentual de ocurrencia (%F), número de estómagos que contienen alimento comercial, expresado como porcentaje del total de estómagos con contenido estomacal (Hyslop, 1980). 12

26 Objetivo 6: Identificar el tamaño y etapa del ciclo de vida de los peces capturados. Para determinar el tamaño de los peces, se identificaron los pesos y longitudes de horquilla de cada uno de los ejemplares capturados. En función de los datos obtenidos se calculó el factor de condición de Fulton (Ricker, 1975), el que ha sido considerado como un método estándar para medir la condición de un pez (Carlander, 1969). En la determinación del ciclo de vida de los peces salmonídeos capturados, se utilizó la escala macroscópica de madurez gonadal para especies salmonídeas (Tabla 8). Los peces fueron categorizados dentro las 7 categorías indicadas y los datos fueron expresados en términos de frecuencia relativa al total de ejemplares capturados en un punto de muestreo y fecha. Los resultados de este objetivo fueron incorporados en el análisis epidemiológico con el objetivo de establecer asociaciones entre los tamaños y etapas del ciclo de vida de los peces y los resultados positivos a las EAR consideradas en este estudio. Tabla 8. Estados de madurez gonadal de machos y hembras de salmonídeos, de acuerdo a escala macroscópica internacional. Adaptada por Niklitschek & Aedo (2002). Estado Denominación Característica 1 Virginal Gónadas delgadas, color pálido, no se diferencia el testículo de los ovarios. Peces muy jóvenes. 2 Inmaduro Ovarios y testículos delgados, se alcanza a ver el contorno de las ovas a través de la membrana ovárica 3 En maduración 4 Premaduros 5 Maduros 6 Desovantes 7 En regresión Ovarios más gruesos, ovas de color anaranjado, de diferentes tamaños; los ovarios ocupan más o menos la mitad de la cavidad visceral. Testículos también más grandes y de color blanquecino. Los ovarios ocupan más de la mitad de la cavidad visceral, los testículos son de color lechoso y los ovarios de color naranja más acentuado, hay un aumento marcado en el volumen de las gónadas. Los ovarios y testículos ocupan casi toda la cavidad visceral. Ovocitos traslúcidos los peces están próximos al desove. Estadio en que los ovarios y los testículos expulsan con facilidad productos sexuales. Las ovas salen sin sangre e independiente una de otra, la madurez de la ova y espermatozoide es óptima para realizar la fecundación. Estadio en que las gónadas se encuentran ya vacías y flácidas. 13

27 Objetivo 7: Caracterizar y cuantificar el riesgo de transmisión de una EAR entre peces silvestres/escapados/cultivo Organización de la información y elaboración de matriz de interacción de variables en base a estadística multivariada Las variables que caracterizan a cada unidad (Región, ACS, estuarios no incorporados en ACS o lago), son analizadas aplicando un modelo estadístico de multivarianza, que permite considerar la relevancia estadística de cada uno de los factores. Dicho modelo en particular, es definido de acuerdo al tipo de variables. A partir de este análisis, las variables con relevancia estadística son incorporadas en una matriz considerando las posibles correlaciones entre las filas y las columnas y la influencia que estas podrían tener en la transmisión entre poblaciones asilvestradas/silvestres/cultivo para cada una de las enfermedades del estudio, en base a consulta a un panel de expertos ad hoc multidisciplinario, y antecedentes identificados en revisiones bibliográficas. Las variables consideradas involucraron tanto la caracterización de las especies salmonídeas en cultivo, como a su vez, los resultados de las poblaciones silvestres/asilvestradas. Ejemplos de estas variables son: distribución de las especies capturadas en la pesca de investigación, N de brotes en los centros de cultivo del área, proporción de especies cultivadas, abundancias de Caligus en los centros como posibles vectores, biomasas promedio del área, origen de los smolts sembrados, información disponible respecto a la susceptibilidad de las especies capturadas a las EAR consideradas en este estudio, pesos promedio, longitud y factor de condición de las especies cultivadas y capturadas en la pesca de investigación, presencia o ausencia de signología clínica de enfermedad de los peces capturados Conformación de panel de expertos ad hoc multidisciplinario Se realizó una búsqueda de expertos nacionales e internacionales que poseen publicaciones en relación a la problemática del estudio. Una vez validados por el comité técnico de la SUBPESCA responsable de este proyecto, se cursaron las invitaciones respectivas para participar de la consulta por medio de una carta inductora señalando el contexto de la encuesta y los objetivos, que se llevó a cabo en reunión presencial dada la disponibilidad de tiempo de los expertos que conformaron el Panel. Las opiniones de los expertos tuvieron el mismo peso específico en la decisión final. El panel estuvo formado por 3 investigadores nacionales con experiencia en el área de consulta. 14

28 4.10. Diseño y Aplicación de encuesta El diseño de la encuesta contempló la validación y priorización (asignar importancia relativa) de los eventos elementales del flujo de proceso de ocurrencia de la transmisión de EAR entre peces asilvestrados/silvestres/cultivo, validación de las escalas cualitativas de probabilidad y de los impactos que fueron utilizadas en el modelo de análisis de riesgo y el ajuste en la apreciación de riesgo (riesgo aceptable) para aplicación en el modelo como a su vez la estimación de las probabilidades de ocurrencia de ciertos eventos elementales del flujo de transmisión de EAR en peces asilvestrados/silvestres/cultivo y la estimación de la magnitud de impactos producidos por la transmisión de EAR en peces asilvestrados/silvestres/cultivo. Una vez aplicada la encuesta, los expertos tuvieron un plazo máximo de respuesta de 6 días corridos para enviar su respuesta. IFOP elaboró el documento final consolidado que fue utilizado como base en el análisis de riesgo, en un periodo de 5 días corridos a partir de la recepción de la última encuesta Análisis de Riesgo de la transmisión de EAR entre peces asilvestrados/silvestres/cultivo Se diseñó el modelo de análisis de riesgo a implementar en base a la metodología establecida por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE, 2009). Esta etapa corresponde a la conceptualización del modelo en cuanto al objetivo, escenarios y eventos que participan de los procesos involucrados. La información crítica o base requerida para realizar el desarrollo del modelo de análisis de riesgo incluyó entre otras: -Identificación y ubicación espacial de las poblaciones muestreadas. -Registros de monitoreo de parámetros biológicos, productivos, ambientales y sanitarios de las poblaciones en estudio. La estructura del Análisis de Riesgo incluyó las siguientes etapas: I) Identificación del peligro. II) Evaluación de riesgo. III) Gestión de riesgo. IV) Comunicación de riesgo. Etapa I: Identificación del peligro Se identificaron posibles eventos y efectos de la presencia de P.salmonis en función del análisis espacial y temporal de la información proveniente de las distintas fuentes consideradas en el presente estudio. La evaluación de riesgo logró identificar peligros potenciales asociados por lo que se prosiguió con las otras etapas de la metodología. 15

29 Etapa II: Evaluación del riesgo Se estimó la probabilidad de ocurrencia de los peligros identificados en la etapa I y las consecuencias ligadas al mismo. Lo que se desarrolló en cuatro etapas: a. Evaluación de la difusión. b. Evaluación de la exposición. c. Evaluación de las consecuencias. d. Estimación del riesgo. a. Evaluación de la difusión Se describió el o los procesos necesarios para que se produzca la difusión del peligro, en este caso se evaluó la probabilidad de introducción del peligro a una población de peces en condiciones de cultivo, dado que sólo en esta población era posible establecer una consecuencia del peligro señalado. b. Evaluación de la exposición Se describió el o los procesos necesarios para que los peces en condiciones de cultivo se vean expuestos al o los peligros identificados en la etapa I, y se estimó la probabilidad de advenimiento de esa exposición y de propagación o radicación de los peligros en esta población. c. Evaluación de las consecuencias Se elaboró un flujo general de procesos que competan al riesgo de transmisión de enfermedades entre peces asilvestrados/silvestres/cultivo que considere todos los eventos descritos en literatura y la opinión de los expertos que constituyan el panel ad-hoc. Los eventos fueron clasificados en cuanto a su importancia o correlación a través de la asignación de un valor de probabilidad basado en la información bibliográfica, matriz de interacción de variables en base a estadística multivariada y los resultados de la consulta al panel de expertos ad-hoc. d. Estimación del riesgo Los resultados cuantitativos de la evaluación de probabilidades de difusión y exposición y además de la evaluación de consecuencias se evaluaron por medio de la ejecución del modelo de análisis de riesgo, lo anterior se realizó en función de las poblaciones resultado de los muestreos (pesca de investigación) y análisis de antecedentes, se ejecutaron los modelos de riesgo para cada población, ACS, estuario no incorporado dentro de las ACS. El resultado de esta etapa permitió clasificar las poblaciones, ACS, estuario no incorporado dentro de las ACS, lagos y regiones según la función de riesgo estimado. 16

30 La ejecución del modelo y sus resultados están sustentados por publicaciones científicas, resultados del análisis de información en el marco del estudio, información de las poblaciones de cultivo y el análisis de los expertos que conformaron el Panel. Etapa III: Gestión de riesgo En base a los resultados del análisis de riesgo se estableció un ranking de riesgo en base al cual se enmarcaron las ACS y otras áreas en mar y estuarios no incorporados dentro de las ACS. El resultado del análisis de riesgo permitió destacar los cuerpos de agua en las que las prevalencias detectadas en peces silvestres se relacionan con consecuencias de mortalidades atribuibles a P.salmonis en las poblaciones en cultivo. En base a esta información se elaboró un listado de medidas que apuntan a minimizar el riesgo de la ocurrencia de mortalidades en poblaciones en cultivo asociado a la presencia de peces silvestres positivos a P.salmonis en la zona vigilada y a su vez a mejorar la calidad de la información requerida para efectuar el análisis de riesgo con datos cuantitativos de calidad. Etapa IV: Comunicación de riesgo Los resultados del análisis de riesgo y el plan de trabajo de manejo del riesgo, fueron discutidos con el panel de expertos ad-hoc Zonificación en base al riesgo En base a los resultados del análisis de factores de riesgo se estableció un ranking de riesgo en base al cual se enmarcaron las ACS y estuarios no incorporados en ACS, dado que el análisis se ejecutó utilizando la información de diagnósticos positivos a P.salmonis, patógeno que para el presente proyecto no fue monitoreado en cuerpos de agua dulce (excepto los lagos Huillinco y Natri, por poseer influencia marina). Las zonas con resultados positivos a EAR fueron caracterizadas a su vez en función del análisis estadístico de los diagnósticos (prevalencias), la distribución de los positivos en las poblaciones en estudio (prevalencias por especie y época del año) y genotipificación de los agentes patógenos (filogenética respecto a secuencias disponibles en base de datos NCBI). En este punto cabe mencionar que dado que actualmente la vigilancia se efectúa por medio de PCR en tiempo real, los segmentos de material genético amplificados son de un menor tamaño que los obtenidos por el PCR convencional, el segmento amplificado corresponde a un tamaño de 150 pares de bases. Dado lo anterior el alineamiento indica que corresponde efectivamente a P.salmonis, sin embargo es necesario secuenciar un segmento de mayor tamaño para poder establecer relaciones filogenéticas de calidad, lo anterior fue ejecutado a través de una tesis de pregrado de la carrera de Bioquímica en conjunto con la Universidad Austral de Chile. Para establecer las escalas del mapa de factores de riesgo, se consideraron los siguientes criterios: 17

31 Se utilizó una clasificación de tres colores, verde, amarillo y rojo. El rojo señala las zonas que son de riesgo dado que el análisis de factores de riesgo indica valores de OR > 1. El amarillo señala las zonas que son de menor riesgo dado que el análisis de factores de riesgo indica valores de OR < 1. El color verde señala las zonas que no son de riesgo dado que el análisis de factores de riesgo el valor de p no fue significativo, por lo que se descartaron del modelo. Considerando la información resultante del análisis de factores de riesgo, se establecieron las variables que son relevantes en el mayor riesgo de una zona determinada, la información desarrollada permitirá monitorear de forma continua las variables que son factores críticos de éxito y las variables que exigen control. Objetivo 8: Relacionar epidemiológicamente los brotes de EAR en peces de cultivo con el estatus sanitario de las especies silvestres muestreadas. Para la determinación de los factores de riesgo que determinan la positividad a Piscirickettsia salmonis de pooles de órganos obtenidos de peces silvestres/asilvestrados capturados en cercanías a centros de cultivo, se procedió a realizar un análisis de regresión logística. El primer paso para llevar a cabo la construcción del modelo de regresión logística fue determinar la variable respuesta, la cual estuvo dada por la positividad de la muestra analizada de los peces capturados, o sea PCR positivo o PCR negativo (dicotómica) y luego de esto poder conocer la influencia que pudiesen tener una serie de variables (independientes o predictivas) sobre la variable respuesta (dependiente) descrita previamente. La variables predictivas incluidas dentro de este modelo pertenecieron a factores provenientes de los centros de cultivo, tales como la presencia de brotes de SRS en centros dentro de zonas donde se capturo el pez silvestre/asilvestrado del cual la muestra fue extraída, la especie de salmonídeos que cultivaban en el momento de la captura y la zona geográfica donde estaba situado el centro. En lo que respecta a factores propios de los individuos silvestres/asilvestrados, se utilizaron como variables la especie de pez, el factor de condición de Fulton, presencia de lesiones, época del año que se capturó el pez, además de la presencia de pellet en el contenido estomacal. A continuación en la Tabla 9 se detallan las variables incluidas para su análisis y su respectiva descripción. 18

32 Tabla 9. Variables analizadas en el estudio de factores de riesgo y su respectiva descripción. Variable Zona Especie Estación Primavera- Verano Lesión Factor de condición Brote Piscirickettsiosis Ingreso de smolt Especie de cultivo Contenido gástrico Descripción Lugar geográfico donde el pez silvestre/asilvestrado se capturó. Especie de pez silvestre/asilvestrado capturado. La muestra se tomó en primavera-verano o no. Presencia de alguna lesión anatomopatólogica en el pez capturado. Valor del factor condición. Existencia de algún brote de SRS de centros dentro de la zona de captura del pez silvestre/asilvestrado. Número de smolt ingresados por ACS presentes en los lugares de captura de peces. Tipo de especie cultivada en centros de cultivo aledaños al lugar de muestreo. Presencia o ausencia de pellet en el estómago. En primera instancia se realizaron análisis univariados para detectar asociaciones incondicionales (p 0,25) de las variables independientes o predictivas con la variable respuesta (dependiente), posteriormente las variables que presentaron una asociación de este tipo fueron incorporadas en un modelo de regresión logística multivariado (modelo condicional). Las variables que resultaron ser no significativas en este modelo condicional fueron eliminadas de forma secuencial mediante un procedimiento hacia adelante (forward elimination), reteniendo aquellas variables con un valor de p menor a 0,05 y comparando por medio de LRT (Likelihood ratio test) los modelos, incluyendo las posibles interacciones entre una variable y otra (Dohoo et al., 2003). Este procedimiento se llevó a cabo mediante el uso de software R versión ( ). Objetivo 9: Identificar y evaluar la capacidad de que especies no salmonídeas puedan actuar como reservorio de una EAR. En este punto, es relevante el evaluar la direccionalidad de la transmisión de enfermedades que en proyectos ASIPA anteriores han sido motivo de diagnósticos positivos, tal es el caso de Piscirickettsia salmonis, diagnosticada en róbalos y pejerreyes en distintas ACS. Para determinar esto e identificar el efecto de este patógeno sobre estas poblaciones, como a su vez el posible rol de reservorios de este agente patógeno, se desarrollaron estudios de desafío en condiciones controladas en las instalaciones de IFOP ubicadas en el Centro de Maricultura Hueihue, en Chiloé. 19

33 4.13. Estudios de Desafío de Eleginops maclovinus Se ejecutó una pesca de investigación en el sector de Manao Norte, próximo al Centro de Maricultura Hueihue de IFOP, por medio de redes de enmalle, las que fueron viradas cada 30 minutos, obteniendo un total de 188 ejemplares vivos de Róbalos (Eleginops maclovinus). Los ejemplares fueron dispuestos en estanques contenedores de fibra de vidrio con difusores de oxígeno, para su traslado al modulo experimental en Hueihue. Los peces fueron dispuestos en 10 estanques de 15 ejemplares cada uno, y mantenidos en aclimatación alimentados inicialmente con pellet de 2 mm para salmonídeos durante 7 días. Adicionalmente, se adquirieron 300 truchas (Oncorhynchus mykiss) para el estudio de desafío las que fueron donadas por la empresa Trusal S.A. y trasladadas al centro experimental de IFOP, previo chequeo sanitario. Luego de la aclimatación de los peces, se dio inicio al estudio de desafío utilizando un modelo bidireccional, que consideró la incorporación de 15 ejemplares de la especie que corresponda como troyano, inoculados con una DL50 de P.salmonis de patogenicidad conocida previamente titulada en un volumen de 0,2 ml de inóculo y un segundo estanque control de cada especie, al que se incorporarán 15 ejemplares de la especie según corresponda inoculados con el mismo volumen de suero fisiológico. Los desafíos a ejecutados fueron los siguientes: Troyano Trucha Róbalo sin inóculo Troyano Róbalo Trucha sin inóculo Los peces fueron mantenidos en los estanques por 30 días. Los resultados permitirían establecer la probabilidad de la consecuencia de transmisión de P. salmonis a poblaciones de peces silvestres desde peces en cultivo y si éstos al ser infectados con el agente, desarrollan un cuadro clínico de la enfermedad o juegan un rol de portadores. Objetivo 10: Proponer políticas públicas relacionadas con la mitigación de los riesgos de transmisión previamente identificados Se consolidaron los resultados derivados de los programas de vigilancia ejecutados en los proyectos precedentes ejecutados por el propio IFOP (2010, 2011 y 2012). En función de los resultados consolidados se presentó el nuevo modelo de zonificación en base al riesgo de transmisión de EAR entre peces silvestres/escapados/cultivo que será incluido en la nueva propuesta del programa de Vigilancia Específico. El programa de Vigilancia considerará un catastro anual del estatus sanitario de las poblaciones silvestres en torno a los centros de cultivo para las zonas propuestas. Los muestreos se desarrollarán durante los meses de Julio a Abril de cada año y los resultados derivados de este programa de Vigilancia serán entregados a la Subsecretaría de Pesca y Acuicultura en el mes de Mayo de cada año. Durante el mes de Junio se presentará el nuevo programa de muestreos del 20

34 Programa de Vigilancia específico de EAR para peces silvestres, el que deberá ser presentado al comité técnico definido por SUBPESCA para ser validado e implementado a contar del mes de Julio. Como resultado de la ejecución del programa de vigilancia de EAR en peces silvestres, se efectuará una difusión de los resultados en publicaciones científicas, previa aprobación del comité técnico establecido por la Subsecretaría de Pesca y Acuicultura. 21

35 5. RESULTADOS Objetivo 1: Continuar con la ejecución del programa de vigilancia y monitoreo que permita conocer la evolución del estatus sanitario de las especies silvestres, en relación con las enfermedades de alto riesgo (EAR). Objetivo 2: Actualizar la propuesta de zonificación desarrollada en proyectos anteriores, en base a los resultados del análisis de riesgo de transmisión de una EAR entre peces silvestres/escapados/cultivo. Objetivo 3: Identificar Puntos de Muestreo considerando la zonificación propuesta por la Subpesca y Sernapesca Especies objetivo La pesca de investigación llevada a cabo con ambas campañas de muestreo logró abarcar la totalidad de las zonas geográficas estipuladas dentro del proyecto, para las regiones de La Araucanía, Los Ríos, Los Lagos, Aysén y Magallanes, con un total de 4488 individuos capturados y un promedio de 155 peces por zona geográfica. Del total de peces muestreados en las cinco regiones estipuladas dentro del marco de estudio (Región de La Araucanía, Región de Los Ríos, Región de Los Lagos, Región de Aysén y Región de Magallanes), el 31% (1301) de ellos corresponden a la especie trucha arcoiris, seguido del róbalo con un 25% (1131), siendo O. regia (pejerrey de mar) con 15% (667) y B. australis con 9% (389) la tercera y cuarta especie más capturada respectivamente. Aquellas con el menor número de capturas, que representaron valores inferiores al 1% del total de individuos muestreados, fueron salmón coho y peladilla (Figura 1). Figura 1. Número total de peces capturados dentro de las cinco regiones estipuladas en el proyecto, según especie. 22

36 Figura 2. Número de Peces capturados en Región de la Araucanía, según especie. Para la Región de La Araucanía la trucha arcoiris fue la especie con mayor proporción de capturas con un 48% (293) del total, seguido en segundo lugar por B. australis con 34% (205) y la perca aportando un 14% (83). La especie capturada en menor cantidad es salmón coho y la peladilla con menos del 1% del total (Figura 2). Figura 3. Número de peces capturados en Región de Los Ríos, según especie. La especie trucha arcoiris fue la más capturada en la Región de Los Ríos, aportando con una gran proporción a la totalidad de ellos 45% (278), seguido de B. australis con un 17% (106) y en tercer lugar el róbalo con 15% (94), distinto del 4% (25) para la trucha café y <1% de lo observado en el caso de la peladilla (Figura 3). 23

37 Para el caso de la Región de Los Lagos un 37% (618) de las especies capturadas correspondió a trucha arcoiris, siendo O. regia la segunda más capturada con un 22% (373), seguido del róbalo con 20%(337) y la perca con 7% (124). Las de menor frecuencia de captura lo experimentaron la peladilla y trucha fario con cifras menores al 1% del total para esta región, tal como se muestra en la Figura 4. Figura 4. Número de peces capturados en Región de Los Lagos, según especie. En la Región de Aysén la especie con mayor frecuencia de captura fue el róbalo con un 45% (547) del total, seguido de O. regia con un 18% (213), encontrándose en tercer lugar en cuanto a número de capturas a la trucha arcoiris con un 13% (163). El salmón coho y peladilla representaron un 1% y 3% de los peces capturados para esta zona respectivamente, como se aprecia en la Figura 5. Figura 5. Número de peces capturados en la Región de Aysén según especie. 24

38 En la Figura 6 se aprecia la frecuencia en el número de capturas para la Región de Magallanes, donde el róbalo representó el mayor porcentaje con un 40% (153), en segundo lugar el salmón Atlántico con un 30% (116), seguido la trucha fario y trucha arcoiris con un 17% (63) y 10% (36) respectivamente. La especie de menor presentación para esta zona fue salmón coho con menos del 1%. Figura 6. Número de peces capturados en la Región de Magallanes según especie. La distribución del número de peces capturados por cada zona geográfica para las cinco regiones en estudio y el porcentaje correspondiente a especies salmonídeas y silvestres, se presenta en la Tabla 10. Los lugares que presentaron el más alto número de peces capturados fueron en primer lugar la zona geográfica Macrozona 8 con 185 peces, seguido de Macrozona 7 y Macrozona 5, ambos con 181 individuos capturados, luego aparece la zonas de Fiordo Aysén, Macrozona 6, y Lago Riesco con 172, 171 y 171 peces respectivamente. Aquellas zonas de muestreo donde se obtuvo la menor cantidad de capturas fueron Lago Sofía con 114 individuos y Capitán Aracena con 115 peces muestreados. En las zonas de Lago Natri y Lago Sofía el 100% de los peces capturados correspondieron a especies salmonídeas. En contraste, en las zonas de Estuario Valdivia y Macrozonas 2, 3 y 4, solo se capturaron especies silvestres, con 0% de captura de salmones. 25

39 Tabla 10. Número total de peces capturados y porcentaje, por zona geográfica, región y tipo de peces. Zona Región Nº Total Peces capturados N Salmones N Silvestres % Salmones % Silvestres Lago Villarica La Araucanía Lago Calafquen La Araucanía Lago Caburga La Araucanía Lago Colico La Araucanía Estuario Valdivia Los Ríos Lago Riñihue Los Ríos Lago Panguipulli Los Ríos Lago Ranco Los Ríos Macrozona 1 Los Lagos Macrozona 2 Los Lagos Macrozona 3 Los Lagos Macrozona 4 Los Lagos Macrozona 5 Los Lagos Lago Puyehue Los Lagos Lago Chapo Los Lagos Lago Huillinco Los Lagos Lago Rupanco Los Lagos Lago Yelcho Los Lagos Lago Llanquihue Los Lagos Lago Natri Los Lagos Macrozona 6 Aysén Macrozona 7 Aysén Macrozona 8 Aysén Control Negativo Aysén Fiordo Aysén Aysén Lago Riesco Aysén Puerto Natales Magallanes Capitan Aracena Magallanes Lago Sofía Magallanes TOTALES

40 A continuación se presenta la distribución del número de cada una de las especies capturadas por zona geográfica y la proporción que representan del total de individuos muestreados en las distintas regiones. Para el caso de las especies capturadas en cada zona de la región de La Araucanía, la especie B. australis es el que aporta en mayor proporción al número final de captura para el caso del Lago Calafquén. En el caso de los otros lagos (Caburga, Colico y Villarrica) la trucha arcoiris fue la que más aportó en cantidad, seguida de B. australis y la perca (Figura 7). Figura 7. Número de peces capturados por zona geográfica y especie para la región de La Araucanía. Para el caso de la región de Los Ríos la especie B. australis y trucha arcoiris se presentaron en proporciones similares para la zona geográfica del Lago Panguipulli. En el Lago Ranco y Lago Riñihue la especia de mayor número de captura fue trucha arcoiris. Esto es distinto a lo observado en la zona del Estuario de Valdivia donde el róbalo es la especie con más alta captura, seguida de O. regia (Figura 8). Figura 8. Número de peces capturados por zona geográfica y especie para la región de Los Ríos. 27

41 La distribución del número de especies para cada zona geográfica de la región de Los Lagos se observa en la Figura 9. En las áreas de agua dulce, en general la especie que se capturó con mayor frecuencia fue trucha arcoiris, con excepción del Lago Huillinco (róbalo) y Lago Llanquihue (B. australis). Para los lugares de agua de mar (Macrozonas) se capturaron en proporciones similares róbalo y O. regia, la excepción la muestra Macrozona 2, donde la totalidad es aportada por O. regia. Figura 9. Número de peces capturados por zona geográfica y especie para la región de Los Lagos. En la Región de Aysén la especie de mayor frecuencia de presentación para Macrozona 6, 7 y 8 fue róbalo, seguido de salmón Atlántico. Fiordo Aysén fue el róbalo, seguido del salmón Atlántico. En la zona del Lago Riesco la trucha arcoiris fue la de mayor frecuencia, seguido de trucha fario con una proporción muy similar (Figura 10). Figura 10. Número de peces capturados por zona geográfica y especie en la Región de Aysén. 28

42 Figura 11. Número de peces capturados por zona geográfica y especie en la Región de Magallanes. En la región de Magallanes la especie róbalo fue la capturada en mayor proporción para el caso de la zona de Puerto Natales. Para Capitán Aracena salmón del Atlántico se encontró en proporciones similares con el róbalo y en el Lago Sofía la trucha fario fue la especie capturada con mayor frecuencia, seguida de trucha arcoiris (Figura 11) Zonificación Para el presente proyecto, inicialmente se propusieron originalmente 32 zonas de muestreo en mar y lagos de la Región de La Araucanía, Los Ríos, Los Lagos, Aysén y Magallanes. Las zonas propuestas correspondían a aquellas muestreadas en proyectos anteriores utilizando el modelo de ACS. Sin embargo, y considerando el requerimiento del mandante, finalmente la zonificación de muestreo se efectuó considerando las nuevas macrozonas identificadas por la SUBPESCA, las que se presentan en la Figura

43 Figura 12. Macrozonas SUBPESCA región de Los Lagos y región de Aysén. Las Macrozonas que definió la Subsecretaría de Pesca y Acuicultura, para las regiones de los Lagos y de Aysén, agrupan a las ACS según se detalla en la Tabla

44 Tabla 11. Macrozonas Subpesca por Región y ACS. Región Macrozonas ACS Los Lagos Los Lagos 21 Los Lagos 1 3A Los Lagos 3B Los Lagos 4 Los Lagos 5 2 Los Lagos 6 Los Lagos 7 Los Lagos 8 Los Lagos 9A Los Lagos 3 9B Los Lagos 9C Los Lagos 10A Los Lagos 10B Los Lagos 11 Los Lagos 12A 4 Los Lagos 12B Los Lagos 12C Los Lagos 13 Los Lagos 14 Los Lagos 5 16 Los Lagos 17A Los Lagos 17B Aysén 18A Aysén 18B Aysén 18C Aysén 18D Aysén 18E 6 Aysén 19A Aysén 19B Aysén 20 Aysén 21A Aysén 21B Aysén 21C Aysén 22A Aysén 22B Aysén 22C Aysén 22D Aysén 23A Aysén 23B Aysén 23C Aysén 7 24 Aysén 25A Aysén 25B Aysén 26A Aysén 26B Aysén 27 Aysén 28A Aysén 28B Aysén 29 Aysén 30A Aysén 30B Aysén 31A Aysén 31B 8 Aysén 32 Aysén 33 Aysén 34 Aysén 35 31

45 Las áreas denominadas macrozonas no fueron divididas por criterio productivo, sino puramente oceanográfico, por lo cual, no se tomó en cuenta si un límite quedaba encima de un barrio, debido a que el objetivo final de la macrozonificación es determinar los lugares más seguros de nuevas localizaciones de barrios. En cuanto a los lugares que se encuentran fuera de las demarcaciones para cada macrozona, estas determinan una zona de barrera o cortafuego, lugar en el cual, no debiesen existir centros de cultivo, ya que se encuentra en una zona oceanográfica que es límite entre macrozonas Puntos de muestreo Conforme a la aprobación de la propuesta de zonificación indicada en el informe de avance N 1 del presente proyecto, se definieron 28 zonas de muestreo en mar y lagos de la Región de La Araucanía, Región de Los Ríos, Región de Los Lagos, Región de Aysén y Región de Magallanes, más una zona como control negativo, las cuales se mencionan en la Tabla 12: Tabla 12. Zonas de muestreo definidas. Zona de muestreo Fiordo Aysén Estuario de Valdivia y Río Valdivia Macrozona 1 (Estuario y Seno de Reloncaví) Macrozona 5 (Hornopirén y Fiordo Comau) Macrozona 2 (Chiloé Norte) Macrozona 4 (Chiloé Sur) Macrozona 3 (Chiloé Central) Macrozona 6 (Melinka y Guaitecas norte) Macrozona 7 (Guaitecas Sur, Fiordo Cupquelan y Estero Quitralco) Macrozona 8 (Fiordo Puyuhuapi y Raúl Marín Balmaceda) Control Negativo (Caleta Tortel y Río Cochrane) Puerto Natales Capitán Aracena Lago Llanquihue Lago Chapo Lago Riesco Lago Huillinco Lago Natri Lago Sofía Lago Caburga Lago Calafquén Lago Colico Lago Villarrica Lago Ranco Lago Panguipulli Lago Riñihue Lago Yelcho Lago Rupanco Lago Puyehue Código FA EV M1 M5 M2 M4 M3 M6 M7 M8 CN PN PA L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 L11 L12 L13 L14 L15 L16 32

46 El inicio de las actividades de pesca de investigación y la programación de muestreos, comenzó a ejecutarse una vez aprobado el primer informe de avance del presente proyecto y las estaciones de muestreo propuestas Artes y aparejos de pesca utilizados para extraer los recursos La Resolución de Pesca de Investigación, que permitió dar comienzo a las actividades de pesca para el presente proyecto, fue entregada con fecha 25 de septiembre del La primera campaña de muestreo se comenzó a ejecutar en Noviembre del año 2012 y la última campaña se ejecutó en junio del año Los aparejos de pesca utilizados durante toda la campaña de pesca correspondieron a aquellos indicados en el punto 4.4. Una vez finalizada la actividad de pesca, los ejemplares obtenidos fueron trasladados al Laboratorio de Necropsia del Instituto de Fomento Pesquero en Puerto Montt, en cajas isotérmicas con hielo o gel pack. Cada caja contenía en su interior, bolsas transparentes rotuladas con la cantidad de peces, coordenada y especie extraída Obtención de muestras En la sala de necropsia, del Instituto de Fomento Pesquero, Puerto Montt, se ejecutó la toma de muestras de cada uno de los ejemplares obtenidos en las zonas de la Región de Los Lagos, mientras que para el resto de las zonas, las muestras fueron procesadas en terreno. Para dicho efecto, todos los peces fueron pesados, medidos y luego dispuestos sobre el mesón de trabajo, para realizar el análisis anatomopatológico externo e interno. Una vez concluido en análisis anatomopatológico, con ayuda de pinzas y bisturí se tomaron dos pequeños trozos (máximo 5 mm 3 ) de riñón, bazo, branquias y corazón de cada pez. Se depositó uno de los trozos de cada órgano en un tubo tipo Eppendorf con etanol, para usarlo como muestra y el otro trozo de cada órgano en otro tubo con etanol absoluto para guardarlo como contramuestra. Los tubos (previamente rotulados con el código de la zona y N de pez), fueron dispuestos en cajas y guardados a -80 C hasta el análisis de laboratorio. El Protocolo de Toma de Muestras se encuentra descrito detalladamente en el ANEXO Análisis de las muestras Los análisis de laboratorio, estuvieron enfocados a la detección de aquellos agentes patógenos indicados en la Tabla 6. Todos los análisis correspondieron a PCR y RT-PCR tiempo real, mediante Sybrgreen y Sondas, utilizando los mismos protocolos implementados y validados en los proyectos 33

47 ASIPA anteriores (2010 y 2011), a excepción de las técnicas de RT-PCR Piscine reovirus (PRV) y PCR Renibacterium salmoninarum, las que fueron estandarizadas al inicio de este proyecto y que se describen a continuación: Piscine reovirus (PRV) Sonda y Partidores: En la Tabla 13 se detallan las secuencias utilizadas para nuestros análisis, cuya referencia corresponde a lo descrito por Haugland et al, Tabla 13. Partidores y sonda utilizados para el análisis de qrt-pcr PRV. PRV Sonda Primer F Primer R Secuencia FAM-5 -ATGTCCAGGTATTTACC-3 -MGB 5'-CCCCATCCCTCACATATGGATA-3' 5 -GGTGAAATCATCGCCAACTCA-3 Protocolo Preparación Master Mix: Se probaron 2 volúmenes de reacción del kit de amplificación, de acuerdo a las recomendaciones del fabricante (Roche), siendo éstos para un volumen final de reacción de 10 y 20 µl (Tabla 14). Los resultados obtenidos con ambos volúmenes no varían (datos nos mostrados), por lo que el volumen final de reacción a utilizar será de 10 µl. Tabla 14. Volúmenes de reacción recomendados por el fabricante para el Kit LightCycler 480 RNA Master Hydrolysis Probe, Roche. Reactivo Volumen para una reacción 20 ul 10 ul H 20, grado PCR 7,0 ul 3,5 ul Primer F 0,5 ul 0,25 ul Primer R 0,5 ul 0,25 ul Sonda TM 0,3 ul 0,15 ul LightCycler 480 RNA Master Hydrolysis (vial 1) 7,4 ul 3,7 ul Activator 1,3 ul 0,65 ul Enhancer 1,0 ul 0,5 ul TOTAL 18,0 ul 9 ul 34

48 Programa RT-PCR PRV: El perfil térmico utilizado para la detección de este virus es el siguiente: Tabla 15. Programa utilizado para el qrt-pcr PRV en el equipo LightCycler 480 (Roche). Proceso Tiempo Temperatura Rampla Tº Modo Adquisición Ciclos Transcripción reversa 3 min 60 C 20º/seg (4.4*) none none 1 Denaturación 30 seg 95ºC 20º/seg (4.4*) none none 1 Denaturación 5 seg 95ºC 20º/seg (4.4*) none Annealing 1 min 60ºC 20º/seg (2.2*) Quantification none Extensión 10 seg 72ºC 20º/seg (4.4*) single Enfriamiento 30 seg 40ºC 20º/seg (1.5*) none none 1 45 Corrida de Prueba qrt-pcr PRV: Como control positivo se diseñó un fragmento in silico de 180 pb que incluye el segmento específico y los partidores en la secuencia GU Este fragmento sintético será el utilizado como control positivo. Para validar la integridad del diseño del control positivo, además del montaje de la técnica, es decir del protocolo de detección del virus (toma de muestra, medio de mantenimiento o transporte de la muestra, temperaturas, kits extracción de Ácidos Nucleídos, mantenimiento del RNA), se realizó una corrida de prueba de qrt-pcr antes de iniciar el análisis de las muestras que involucran el proyecto, con RNA de tejido de muestras de prueba. La figura 13 corresponde a una corrida de qrt- PCR de prueba para Virus PRV, en la cual se puede observar la amplificación del control positivo, el control negativo de PCR (agua de PCR) y muestras negativas para virus PRV, sin curvas de amplificación. 35

49 Figura 13. Curva de Amplificación Corrida de Prueba qrt-pcr PRV: Se observa una clara amplificación del control positivo a partir del ciclo 14. No se observa ningún tipo de amplificación en el control negativo ni en la muestra prueba. Dilución control Positivo: Con el objetivo de conocer la concentración mínima a detectar del virus PRV en el tejido infectado, se realizaron 10 diluciones seriadas por triplicado a partir del stock original que se utiliza como control positivo. Se pudo observar que el protocolo de detección del virus detecta concentraciones de hasta 10-6 copias del genoma viral, ya a partir de la dilución número 10-7,no se observó una curva de amplificación clara, en la Tabla 16 se detalla el ciclo de amplificación para cada dilución realizada. Tabla 16. Datos de Cp obtenidos para cada una de las diluciones del control positivo PRV. Dilución Cp , , , , , , No Ct 10-8 No Ct 10-9 No Ct No Ct 36

50 Figura 14. Curvas de Amplificación obtenidas para cada una de las diluciones del control positivo PRV Renibacterium salmoninarum (BKD) Sonda y Partidores: Los partidores y sonda utilizados para la detección del agente Renibacterium salmoninarum, causal de la Enfermedad Bacteriana del Riñón (BKD, por sus siglas en inglés), son los descritos por Chase et al., 2006 (Tabla 17). Tabla 17. Partidores y sonda utilizados para el análisis de qpcr BKD. BKD Sonda Primer F Primer R Secuencia FAM-5'-CACCAGATGGAGCAAC-3' -MGB 5'- GTGACCAACACCCAGATATCCA -3' 5'- TCGCCAGACCACCATTTACC -3' Protocolo Preparación Master Mix qpcr BKD: Se probaron 2 volúmenes de reacción del kit de amplificación, de acuerdo a las recomendaciones del fabricante (Roche), siendo estos para un volumen final de reacción de 10 y 20 ul (Tabla 18). Los resultados obtenidos con ambos volúmenes no varían (datos no mostrados), por lo que el volumen final de reacción a utilizar será de 10 ul. 37

51 Tabla 18. Volúmenes de reacción recomendados por el fabricante para el Kit LightCycler 480 Master Probes (Roche). Reactivo Volumen para una reacción 20 ul 10 ul H 20, grado PCR (vial 1) 7,8 ul 3,4 ul Primer F 0,5 ul 0,25 ul Primer R 0,5uL 0,25 ul Sonda TM 0,3 ul 0,15 ul LightCycler 480 Master Probes (vial 2) 10 ul 5,0 ul TOTAL 18,0 ul 9,0 ul Programa Q-PCR BKD: Tabla 19. Programa utilizado para el Q-PCR BKD en el equipo LightCycler 480 (Roche). Proceso Tiempo Temperatura Rampla Tº Modo Adquisición Ciclos DENATURACIÓN 10 min 95ºC 20º/seg (4.4*) none none 1 Denaturación 10 seg 95ºC 20º/seg (4.4*) none Annealing 30 seg 60ºC 20º/seg (2.2*) Quantification none 45 Extensión 0,1 seg 72ºC 20º/seg (4.4*) single ENFRIAMIENTO 30 seg 40ºC 20º/seg (1.5*) none none 1 Corrida de Prueba qpcr BKD: El DNA de BKD utilizado como control positivo fue facilitado por el Laboratorio Aquainnovo, correspondiendo éste a un DNA genómico bacteriano, y que se utilizará como stock para realizar diluciones y ser utilizado como control positivo en las posteriores corridas de qpcr. Con el objetivo de validar el montaje de la técnica de qpcr y la integridad del control positivo, se realizó una corrida de prueba (Figura 15). 38

52 Figura 15. Curvas de amplificación corrida de prueba PCR BKD: Se observa una clara amplificación del control positivo. No se observa ningún tipo de amplificación en el control negativo ni la muestra negativa. Dilución Control Positivo: Con el objetivo de conocer la concentración mínima a detectar de la bacteria BKD en el tejido infectado, se realizaron 10 diluciones seriadas por triplicado a partir de nuestro stock original que se utilizara como control positivo. Se pudo observar que el protocolo de detección de la bacteria detecta concentración de hasta 10-6 copias del genoma bacteriano, ya a partir de la dilución número 7 no se observó curva de amplificación, en la Tabla 20 se detalla el ciclo de amplificación para cada dilución. Tabla 20. Datos de Cp obtenidos para cada una de las diluciones del control positivo BKD. Dilución Cp , , , , , , No Ct 10-8 No Ct 10-9 No Ct No Ct 39

53 Figura 16. Curvas de Amplificación obtenidas para cada una de las diluciones seriadas en triplicado del control positivo BKD. Los protocolos estandarizados para las técnicas de RT PCR tiempo real para la detección de PRV y PCR tiempo real para la detección de Renibacterium salmoninarum, se presentan en el ANEXO 2 y 3 respectivamente. De la totalidad de los análisis realizados, solo se obtuvieron muestras positivas para el patógeno Piscirickettsia salmonis. Las muestras positivas de cada zona fueron enviadas a secuenciar. Los resultados de los alineamientos de las secuencias de estas muestras se pueden observar en el ANEXO Análisis estadístico de los resultados Utilizando la base de datos de los resultados obtenidos de las muestras analizadas en el laboratorio para la búsqueda de enfermedades de alto riesgo (EARS) en peces silvestres y asilvestrados, se procedió a estimar: 1.- Prevalencia general por zona geográfica de captura. 2.- Prevalencia por especie capturada. 3.- Prevalencia por especie y zona geográfica de captura. Para determinar este valor se utilizó la siguiente fórmula de proporción de prevalencia: Prevalencia= (nº de muestras PCR positivos/nº total de muestras analizadas)*100 40

54 Además se estimó el intervalo de confianza para la prevalencia muestral con un 95% de confianza (z=1,96). p=p±1,96 (p(1 p)/n) En relación a las muestras analizadas, se encontraron resultados negativos para la detección de ISAV, Alfavirus, IHNv, VHSv, OMv, EHNv, F. psychrophilum e IPNv, independiente de la zona geográfica de captura y especie a la que pertenecían. Los resultados positivos correspondieron únicamente a P. salmonis. Tabla 21. Prevalencia de P. salmonis por zona de captura. Prevalencia P. salmonis Intervalo de Confianza Zona % +/n Lim Inferior Lim Superior Control Negativo 7,25% 10/138 3,07% 11,42% Estuario Valdivia 3,95% 6/152 0,83% 7,06% Fiordo Aysén 12,50% 18/144 7,10% 17,90% Macrozona 1 2,00% 3/150 2,05% 6,05% Macrozona 2 0,00% 0/145 0,00% 0,00% Macrozona 3 2,05% 3/146 0,22% 4,33% Macrozona 4 15,54% 23/148 8,58% 22,50% Macrozona 5 0,00% 0/137 0,00% 0,00% Macrozona 6 0,00% 0/160 0,00% 0,00% Macrozona 7 0,00% 0/172 0,00% 0,00% Macrozona 8 0,00% 0/170 0,00% 0,00% Capitán Aracena 0,00% 0/111 0,00% 0,00% Puerto Natales 0,00% 0/153 0,00% 0,00% Lago Huillinco 0,00% 0/146 0,00% 0,00% Lago Natri 0,00% 0/149 0,00% 0,00% Como se observa en la Tabla 21 la zona de Macrozona 4 (Chiloé Sur) es la que presentó la mayor prevalencia de pooles positivos para P. salmonis con un 15,54%, encontrándose la prevalencia poblacional con un nivel de confianza de 95%, entre 8,58% y 22,50%. La segunda zona que presentó el más alto nivel de prevalencia fue Fiordo Aysén con un 12,50% (IC7,10% - 17,90%) y la zona de Caleta Tortel y Río Cochrane (Control Negativo) con 7,25% (IC3,07 11,42%). Aquellas zonas donde se obtuvieron los niveles de prevalencia más baja fueron en el Estuario de Valdivia con un 3,95% (IC 0,83% - 7,06%) y Macrozona 1 (Estuario y Seno de Reloncaví) con 1,97% (IC2,05% 5,99%). Siendo las áreas geográficas mencionadas anteriormente las únicas que resultaron con 41

55 positividad a P. salmonis, las restantes no presentaron ningún pool de órganos positivos a este agente. En la Tabla 22 se aprecia la distribución de frecuencias para P. salmonis por especies. Las únicas especies que resultaron positivos a la presencia de P. salmonis fueron el pejerrey de mar (O. regia) y róbalo. En el caso de la primera especie esta presentó una prevalencia de 0,70% (4/575) con una prevalencia ponderada de 0.18%. Respecto a la proporción de pooles positivos encontrados en la especie róbalo, fueron del orden del 5,37% (59/1098), obteniéndose una prevalencia ponderada de 2,66%. El número total de muestras analizadas para este patógeno fue 2221, con una prevalencia para P. salmonis de 2,84%. Especie Positivos (+) P. salmonis Tabla 22. Prevalencia de P. salmonis por especie. Negativos (-) P. salmonis Prevalencia P. salmonis Prevalencia ponderada P. salmonis* Número de Muestras Analizadas O. regia ,70% 0,18% 575 Peladilla ,00% 0,00% 26 Robalo ,37% 2,66% 1098 Salmón Atlántico ,00% 0,00% 210 Salmón coho ,00% 0,00% 11 Trucha arcoíris ,00% 0,00% 230 Trucha fario ,00% 0,00% 71 Total general ,84% 2,84% 2221 *: Valor ponderado con respecto al total de pooles de peces analizados. Si observamos la tabla 23 en promedio se capturaron entre dos y cuatro especies distintas de peces por zona de captura, presentándose una muy baja variedad de muestras positivas para cada una de ellas. En general las especies pejerrey de mar (O. regia) y róbalo son las de mayor frecuencia de captura, coincidiendo también con que sólo en estas especies de peces se obtuvieron prevalencias. La positividad se distribuyó en muy pocas zonas, obteniéndose valores de frecuencia algo significativos en tan solo dos lugares, tal como se aprecia por ejemplo en el pejerrey de mar en la Macrozona 3 con un 4,11% y el róbalo en Control Negativo (Caleta Tortel y Río Cochrane) con un 22,22%, Fiordo Aysén con 22,5% y Macrozona 4 con 25,84%. Para las demás especies de peces y sus zonas correspondientes, no se encontraron pooles positivos a P. salmonis, evidenciándose que de igual forma el número de captura fue relativamente bajo si lo comparamos con las dos especies mencionadas en el párrafo anterior. 42

56 Tabla 23. Prevalencia de P. salmonis por especie y por zona de captura. Control Negativo Estuario Valdivia Fiordo Aysén Macrozona 1 Macrozona 2 Macrozona 3 Macrozona 4 P. salmonis P. salmonis Especies % +/n % +/n % +/n % +/n % +/n % +/n % +/n O. regia 0% 0/35 1,64% 1/61 0% 0/5 0% 0/84 0% 0/145 4,11% 3/73 0% 0/59 Peladilla 0% 0/ Robalo 22,22% 10/45 5,43% 5/91 22,50% 18/80 4,62% 3/ % 0/73 25,84% 23/89 Salmón Atlántico % 0/ Salmón coho Trucha arcoíris 0% 0/ % 0/4 0 0/ Trucha fario 0% 0/ % 0/ Macrozona 5 Macrozona 6 Macrozona 7 Macrozona 8 Capitán Aracena Puerto Natales Lago Huillinco Lago Natri P. salmonis P. salmonis Especies % +/n % +/n % +/n % +/n % +/n % +/n % +/n % +/n O. regia 0% 0/51 0% 0/ % 0/42 0% 0/7 0% 0/2 0% 0/9 Peladilla Robalo 0% 0/84 0% 0/109 0% 0/123 0% 0/81 0% 0/44 0% 0/110 0% 0/104 Salmón Atlántico - 0% 0/35 0% 0/25 0% 0/36 0% 0/56 0% 0/ Salmón coho % 0/ % 0/1 - - Trucha arcoíris 0% 0/1 0% 0/11 0% 0/19 0% 0/7 0% 0/3 0% 0/2 0% 0/2 0% 0/149 Trucha fario 0% 0/1 0% 0/3 0% 0/3 0% 0/4 0% 0/1 0% 0/10 0% 0/31 43

57 Objetivo 4: Identificar si los peces salmonídeos capturados que resulten positivos a una EAR corresponden a peces escapados o asilvestrados. Durante el análisis anatomopatológico de los peces correspondientes a las especies de salmones, se describieron los hallazgos externos de importancia, con el objetivo de lograr diferenciar salmones silvestres de escapados. De acuerdo a la metodología anteriormente descrita. Sin embargo, los análisis de laboratorio realizados, resultaron negativos en un 100% para las especies salmonídeas, por lo que no fue posible relacionar la positividad con características morfológicas que indiquen si corresponden a peces escapados o asilvestrados. Objetivo 5: Obtener información en relación a la dieta de los peces capturados y relacionarla con los resultados de diagnóstico obtenidos. Al momento de llevar a cabo la necropsia de los peces capturados para la toma de muestras, se realizó una incisión en el estómago con el objetivo de inspeccionar su contenido. El porcentaje del tipo de contenido gástrico de la totalidad de los peces capturados se presenta en la Figura 17. Figura 17. Porcentaje de tipo de contenido gástrico encontrado en la totalidad de los peces capturados durante el periodo de la Pesca de Investigación. En la Figura 17 se aprecia que moluscos fue el contenido estomacal que se encontró con mayor frecuencia con un 20%, seguido muy de cerca por aquellos individuos en los cuales hubo una ausencia de contenido gástrico. En tercer lugar aparecen las algas con un 12%, al igual el contenido seromucoso, seguido de alimento natural (9%) y materia orgánica degradada (8%). 44

58 En cuanto al pellet o alimento comercial que se pudo obtener de las especies capturadas, este representa tan sólo un 5% (199), lo cual indica, el posible contacto que pudiese haber entre especies de peces silvestres/asilvestradas con especies de centros de cultivo. La baja frecuencia existente en relación a este tipo de alimento, hace pensar que el contacto entre ambos tipos de especies es bajo, lo que indicaría que las posibilidades de transmisión de alguna enfermedad en esta dirección seria igualmente bajas. A pesar de lo descrito anteriormente, no se puede dar por hecho esta situación, ya que aún restan otro tipo de estudios para complementar la información, como el estudio de cohabitación que busca conocer el rol específico que cumplen las especies silvestres/asilvestradas en la transmisión de enfermedades a centros de cultivo y/o viceversa. En la Tabla 24 se detalla el tipo de contenido gástrico por especie capturada. Mientras que en la Tabla 25, se detalla el tipo de contenido gástrico por zona de captura. 45

59 Tabla 24. Tipo de contenido gástrico por especie capturada Especie capturada B. australis O. regia Peladilla Perca Robalo Contenido gástrico Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Algas 6 1,5% 35 5,2% 2 4,9% 4 1,6% ,5% Ausencia 33 8,5% ,5% 21 51,2% 40 15,9% ,4% Crustaceos 73 18,8% 5 0,7% 1 2,4% ,4% 107 9,5% Insectos 1 0,3% ,3% 3 1,2% 3 0,3% Krill ,8% Liquido ,8% ,4% 32 2,8% Materia orgánica ,8% ,1% 2 4,9% 57 22,6% ,2% Moluscos 52 13,4% 0,0% 1 2,4% ,6% Peces 1 0,3% 12 1,8% 2 4,9% ,9% Pellet 2 0,5% 9 1,3% ,8% Seromucoso 66 17,0% 96 14,4% 9 22,0% 35 13,9% ,4% Total % % % % % Especie capturada S. Atlántico S. coho T. arco T. café T. fario Contenido gástrico Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Algas 26 8,6% ,3% 1 1,1% 12 6,8% Ausencia 93 30,6% 14 28,0% 75 5,4% 14 16,1% 53 29,9% Crustaceos 13 4,3% 5 10,0% ,5% 37 42,5% 10 5,6% Insectos ,2% 1 1,1% - - Krill 20 6,6% ,2% Liquido 64 21,1% 4 8,0% 55 4,0% ,3% Materia orgánica 20 6,6% 5 10,0% ,4% 22 25,3% 24 13,6% Moluscos 6 2,0% ,3% 3 3,4% 6 3,4% Peces 29 9,5% 5 10,0% 32 2,3% 3 3,4% 14 7,9% Pellet 1 0,3% ,9% Seromucoso 32 10,5% 17 34,0% 104 7,5% 6 6,9% 15 8,5% Total % % % % % 46

60 Agua Estuarina-Mar Tabla 25. Tipo de contenido gástrico por zona de captura Contenido Gástrico Algas Ausencia Crustaceos Insectos Krill Liquido M. orgánica Moluscos Peces Pellet Seromucoso Total Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Estuario Valdivia 0 0,0% 28 17,3% 6 3,7% 0 0,0% 0 0,0% 2 1,2% ,4% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 20 12,3% % Macrozona ,1% 33 21,7% 20 13,2% 1 0,7% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 2 1,3% 11 7,2% 9 5,9% 44 28,9% % Macrozona 2 0 0,0% 55 37,4% 3 2,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 85 57,8% 0 0,0% 1 0,7% 0 0,0% 3 2,0% % Macrozona ,9% 69 44,2% 1 0,6% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,6% 35 22,4% 3 1,9% 0 0,0% 6 3,8% 24 15,4% % Macrozona 4 0 0,0% 45 29,4% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% ,9% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,7% 0 0,0% % Macrozona ,1% 71 39,4% 18 10,0% 0 0,0% 4 2,2% 1 0,6% 16 8,9% 4 2,2% 2 1,1% 0 0,0% 35 19,4% % Macrozona ,4% 44 25,7% 20 11,7% 0 0,0% 13 7,6% 37 21,6% 0 0,0% 3 1,8% 3 1,8% 0 0,0% 11 6,4% % Macrozona ,2% 30 16,6% 3 1,7% 1 0,6% 0 0,0% 32 17,7% 9 5,0% 6 3,3% 1 0,6% 0 0,0% 19 10,5% % Macrozona ,4% 32 17,3% 25 13,5% 0 0,0% 1 0,5% 36 19,5% 0 0,0% 5 2,7% 7 3,8% 0 0,0% 21 11,4% % Control Negativo 2 1,3% 55 35,5% 0 0,0% 1 0,6% 0 0,0% 35 22,6% 25 16,1% 25 16,1% 0 0,0% 0 0,0% 12 7,7% % Fiordo Aysén 58 33,7% 26 15,1% 0 0,0% 0 0,0% 1 0,6% 26 15,1% 6 3,5% 10 5,8% 15 8,7% 2 1,2% 28 16,3% % Puerto Natales 67 43,8% 32 20,9% 2 1,3% 0 0,0% 12 7,8% 6 3,9% 3 2,0% 0 0,0% 31 20,3% 0 0,0% 0 0,0% % Capitan Aracena 53 46,1% 19 16,5% 1 0,9% 0 0,0% 23 20,0% 16 13,9% 0 0,0% 2 1,7% 1 0,9% 0 0,0% 0 0,0% % Agua Dulce Lago Villarica 0 0,0% 1 0,7% ,4% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 3 2,1% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 11 7,7% % Lago Calafquen 1 0,6% 2 1,3% 49 31,8% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 78 50,6% 4 2,6% 0 0,0% 1 0,6% 19 12,3% % Lago Caburga 0 0,0% 2 1,3% 91 58,7% 2 1,3% 0 0,0% 0 0,0% 26 16,8% 31 20,0% 0 0,0% 0 0,0% 3 1,9% % Lago Colico 2 1,3% 2 1,3% 42 27,5% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 99 64,7% 6 3,9% 0 0,0% 0 0,0% 2 1,3% % Lago Riñihue 0 0,0% 13 8,7% 37 24,8% 3 2,0% 0 0,0% 0 0,0% 67 45,0% 5 3,4% 15 10,1% 0 0,0% 9 6,0% % Lago Panguipulli 1 0,7% 10 6,6% 55 36,4% 6 4,0% 0 0,0% 0 0,0% 46 30,5% 2 1,3% 1 0,7% 0 0,0% 30 19,9% % Lago Ranco 0 0,0% 9 5,8% ,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 12 7,7% 1 0,6% 0 0,0% 0 0,0% 9 5,8% % Lago Puyehue 12 7,9% 0 0,0% ,7% 0 0,0% 0 0,0% 2 1,3% 21 13,8% 0 0,0% 0 0,0% 3 2,0% 5 3,3% % Lago Chapo 0 0,0% 18 12,4% 52 35,9% 3 2,1% 0 0,0% 2 1,4% 34 23,4% 0 0,0% 0 0,0% 6 4,1% 30 20,7% % Lago Huillinco 5 3,3% 11 7,2% 38 25,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 15 9,9% 3 2,0% 3 2,0% 0 0,0% 77 50,7% % Lago Rupanco 4 2,5% 24 15,2% 15 9,5% 4 2,5% 0 0,0% 6 3,8% 5 3,2% 0 0,0% 8 5,1% 44 27,8% 48 30,4% % Lago Yelcho 6 4,0% 10 6,7% 97 64,7% 1 0,7% 0 0,0% 0 0,0% 5 3,3% 16 10,7% 11 7,3% 0 0,0% 4 2,7% % Lago Llanquihue 3 2,0% 55 36,2% 9 5,9% 0 0,0% 0 0,0% 2 1,3% 35 23,0% 5 3,3% 2 1,3% 2 1,3% 39 25,7% % Lago Natri 0 0,0% 1 0,7% 13 8,6% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 13 8,6% 0 0,0% 0 0,0% ,1% 0 0,0% % Lago Riesco 27 15,8% 19 11,1% 12 7,0% 3 1,8% 1 0,6% 37 21,6% 31 18,1% 7 4,1% 4 2,3% 2 1,2% 28 16,4% % Lago Sofía 12 10,5% 43 37,7% 26 22,8% 0 0,0% 14 12,3% 0 0,0% 9 7,9% 7 6,1% 3 2,6% 0 0,0% 0 0,0% % 47

61 Objetivo 6: Identificar el tamaño y etapa del ciclo de vida de los peces capturados. Características Morfométricas: Desde el punto de vista de las características morfométricas de las especies capturadas, la Tabla 26 muestra los valores promedio de longitud, peso y factor de condición de Fulton, donde se puede observar que las especies que presentaron mayores longitudes y pesos fueron el salmón del Atlántico, salmón coho, trucha fario y trucha café, mientras que las especies con los valores medios más bajos se observaron en O. regia y peladilla. En cuanto al factor de condición de Fulton, los más altos valores se observan en la perca, trucha café y trucha arcoiris, en tanto que los más bajos están presentes en O. regia, salmón coho y peladilla. Tabla 26. Valores promedio de longitud, peso y factor de condición de Fulton de las especies capturadas en las pescas de investigación. Especie Longitud (cm) Peso (g) Factor de condición de Fulton Agua Promedio Promedio Media Min Max DE B. australis 43,91 415,76 1,058 0,466 2,389 0,303 Dulce O. regia 23,07 102,50 0,784 0,215 2,697 0,185 Mar Peladilla 29,69 297,76 1,095 0,711 2,232 0,405 Dulce 27,42 173,75 0,837 0,64 1,069 0,097 Mar Perca 31,53 462,20 1,337 0,495 3,218 0,346 Dulce Robalo 27,33 259,16 1,257 0,531 3,969 0,589 Dulce 32,23 421,1 1,059 0,372 1,772 0,167 Est-Mar Salmón Atlántico 35,17 578,86 1,308 0,391 3,264 0,377 Dulce 37,71 857,3 1,139 0,583 4,182 0,282 Mar Salmón coho 38,34 636,02 0,976 0,61 1,348 0,169 Dulce 57, ,45 1,017 0,568 1,443 0,281 Mar Trucha arcoíris 35,18 581,26 1,248 0,453 4,501 0,365 Dulce 42,7 1118,92 1,175 0,501 1,834 0,211 Mar Trucha café ,65 1,290 0,542 3,968 0,407 Dulce Trucha fario 41,96 927,56 1,075 0,725 2,194 0,188 Dulce 38,11 739,45 1,131 0,772 1,721 0,204 Mar 48

62 A continuación se detalla el valor promedio del factor de condición del pez capturado en cada zona para las cinco regiones en estudio (Tabla 27). De esta tabla se puede extraer que aquellas zonas que presentaron los mayores promedios del factor de condición de Fulton fueron Lago Puyehue con un valor de 1,403, Lago Caburga con 1,371, seguido de Lago Villarrica con 1,368, Lago Colico con 1,304, además de Lago Sofía y Lago Yelcho con 1,348 y 1,259 respectivamente. Se destaca que los valores expuestos anteriormente son principalmente de la región de La Araucanía y Los Ríos, siendo todas ellas en cursos de agua dulce, lo cual esta relacionado con el tipo de especie que se captura en mayor medida en estos lugares (truchas, salmón Atlántico, etc.), que por lo general tienden a presentar mejores condiciones que otras especies de peces. Los menores valores promedio calculados para esta variable (FC) se observan en las zonas de la Macrozona 1 con un valor de 0,771, Macrozona 2 con 0,779, Macrozona 5 con 0,803 y Macrozona 4 con 0,904. De la misma forma que lo expresado en el párrafo anterior, el hecho de que en estos lugares se capturen en mayor medida especies como pejerrey (O. regia), condicionan el valor promedio de factor de condición entregado para este lugar geográfico, ya que esta especie tiende a tener valores de FC menor a 1. 49

63 Tabla 27. Valores promedio de longitud, peso y factor de condición de Fulton de los peces capturados respecto de la zona de obtención de la pesca de investigación. Zona Longitud (cm) Promedio Peso (g) Promedio FC de Fulton Media Min Max DE Agua Lago Villarica 35,74 625,99 1,368 0,501 2,378 0,333 Dulce Lago Calafquen 34,80 506,56 1,080 0,573 1,913 0,272 Dulce Lago Caburga 34,72 719,17 1,371 0,656 3,937 0,437 Dulce Lago Colico 34,12 546,21 1,304 0,513 3,041 0,385 Dulce Estuario Valdivia 28,38 247,35 0,957 0,222 2,697 0,267 Estuarina Lago Riñihue 34,78 549,28 1,146 0,453 4,501 0,385 Dulce Lago Panguipulli 35,94 555,50 1,168 0,466 3,968 0,383 Dulce Lago Ranco 36,37 620,42 1,217 0,459 2,478 0,270 Dulce Macrozona 1 24,78 141,51 0,771 0,215 1,656 0,281 Mar Macrozona 2 22,52 90,72 0,779 0,377 1,304 0,082 Mar Macrozona 3 26,18 196,25 0,987 0,680 1,380 0,188 Mar Macrozona 4 25,42 184,40 0,912 0,371 1,737 0,194 Mar Macrozona 5 26,14 164,41 0,803 0,289 1,466 0,214 Mar Lago Puyehue 33,04 511,37 1,403 0,536 2,787 0,406 Dulce Lago Chapo 32,02 431,38 1,218 0,455 2,591 0,398 Dulce Lago Huillinco 30,48 437,21 1,208 0,531 3,969 0,510 Dulce Lago Rupanco 35,74 547,94 1,134 0,539 2,434 0,383 Dulce Lago Yelcho 38,40 747,09 1,259 0,531 3,077 0,324 Dulce Lago Llanquihue 32,35 404,67 1,155 0,391 3,264 0,406 Dulce Lago Natri 31,09 362,49 1,151 0,732 1,925 0,201 Dulce Macrozona 6 37,88 725,57 1,162 0,796 4,182 0,287 Mar Macrozona 7 36,25 658,16 1,105 0,372 1,721 0,174 Mar Macrozona 8 36,18 696,06 1,022 0,593 1,512 0,163 Mar Control Negativo 29,54 375,85 0,960 0,548 1,772 0,195 Dulce-Mar Fiordo Aysén 32,23 580,43 1,045 0,674 1,783 0,188 Mar Lago Riesco 36,78 656,68 1,078 0,742 3,540 0,259 Dulce Puerto Natales 37,62 711,14 1,192 0,830 2,002 0,155 Mar Capitan Aracena 30,64 353,57 0,999 0,631 1,418 0,148 Mar Lago Sofía 43, ,10 1,246 0,725 2,194 0,199 Dulce 50

64 En la Figura 18 se presenta el comportamiento y distribución el factor de condición en relación al tipo de agua donde se capturaron las especies de peces. Figura 18. Boxplot del factor de condición en relación al tipo de agua donde se realizó la Pesca de Investigación. Para el caso de los individuos capturados en las zonas de agua dulce, estos generaron un valor de la mediana mayor respecto de lo observado para las muestras procedentes de los estuarios y del mar, siendo en esta última levemente superior a la estuarina. Se aprecia una simetría del factor de condición para los tres tipos de agua (línea central de la caja), sin dispersión de los valores, con la premisa de que hay una elevada cantidad de datos atípicos (círculos) y datos atípicos extremos (asteriscos), más notoriamente en el tipo de agua dulce. Figura 19. Boxplot del factor de condición en relación a zona geográfica de la Región de La Araucanía y Región de Los Ríos. 51

65 En relación a como se distribuye el factor de condición respecto del lugar geográfico en la región de La Araucanía y región de Los Ríos (Figura 19), se puede apreciar que la distribución de los valores es simétrica respecto de la mediana, con un escasa dispersión, excepto Lago Caburga (caja grande). Se observa también en el caso de Lago Panguipulli, Lago Colico y Lago Ranco una gran cantidad de datos atípicos, es decir muchos individuos presentan valores fuera de los límites inferiores y superiores. En general se estima que las medianas para las distintas zonas en estas dos regiones son bastante similares, siendo en el Lago Villarrica donde se eleva más que en las restantes, mientras que en el Estuario de Valdivia se presenta la mediana del factor de condición de menor valor para estas regiones. Figura 20. Boxplot del factor de condición en relación a zona geográfica de la Región de Los Lagos. En las zonas de captura para la región de Los Lagos (Figura 20) se aprecia una elevada variabilidad de la mediana del factor de condición entre una zona y otra. Las zonas que muestran las dispersiones de datos más notorias son Lago Puyehue, Lago Chapo, Lago Rupanco y Macrozona 3 muestran una elevada dispersión de los datos, presentándose en este último una asimetría negativa, o sea los valores tienden a concentrarse más hacia la parte superior de la distribución o percentil 75 (línea superior de la caja). En cuanto al resto de los puntos de muestreo, en general hay una simetría de los datos en relación a la mediana (línea central de la caja), siendo Macrozona 2, Lago Natri, Lago Yelcho y Macrozona 4 los lugares con menor dispersión (caja más comprimida). Las medianas más elevadas se pueden apreciar en el Lago Puyehue y Lago Chapo, probablemente asociado al tipo de especie capturado, puesto que en su mayoría correspondían a peces asilvestrados como trucha arcoiris y salmón coho. Los valores mas bajos pertenecen a Macrozona 1 y Macrozona 2. 52

66 Figura 21. Boxplot del factor de condición en relación a zona geográfica de la Región de Aysén y Región de Magallanes. En la región de Aysén y Magallanes se observa una simetría de los valores de factor de condición respecto de la mediana para todas las zonas de estudio, con una dispersión muy baja (cajas compactas, Figura 21). Se evidencia una clara diferencia en cuanto a la mediana para las distintas zonas, puesto que por ejemplo Lago Sofía es la más elevada y también el lugar que posee una mayor dispersión de sus datos. Se destaca la gran cantidad de valores atípicos en la zona de Control Negativo (Caleta Tortel y río Cochrane). Figura 22. Boxplot del factor de condición respecto de la especie de pez capturada en la pesca de investigación. 53

67 Como se aprecia en la Figura 22 en relación al factor de condición respecto de la especie capturada, los valores de este se aprecian simétricos respecto de la mediana para todas las especies de peces, presentando en general una dispersión muy baja de los valores de factor de condición. La mayor dispersión del factor se presenta en las especies trucha arcoiris, B. australis y perca (cajas mas grandes), con un elevado número de valores atípicos (puntos negros) y atípicos extremos (asteriscos) en el caso de los dos primeros. Perca, trucha café y trucha arcoiris son las especies que tienen la mediana mas alta del factor de condición respecto de las otras especies de peces capturadas, siendo O. regia y peladilla las con peor factor de condición. Figura 23. Boxplot de factor de condición en relación a la región de muestreo. Para el caso del factor de condición y la región de muestreo se puede observar (Figura 23) que los valores se distribuyen simétricamente respecto de la mediana para las cinco regiones en estudio. Siendo el factor de condición de un valor muy similar entre las regiones de Aysén, Los Ríos, Los Lagos y Magallanes, evidenciándose notoriamente una diferencia respecto a lo observado para la región de La Araucanía, donde los valores del factor de condición están en su gran mayoría por sobre 1. Se destaca la gran cantidad de valores atípicos observados en cuatro de las cinco regiones analizadas. Análisis de Factor de condición de Fulton Los datos obtenidos durante la Pesca de Investigación de peces silvestres y asilvestrados descritos más arriba, mostraron no tener una distribución normal, lo cual se obtuvo aplicando una prueba de Shapiro-Wilk <2,2x10-16 (p> 0,5 estadísticamente significativo). Debido a esto se procedió a hacer el 54

68 análisis con un test no paramétrico de Kruskal-Wallis con el fin de obtener alguna información respecto a cómo se comporta el factor de condición (variable respuesta o dependiente) en relación a la especie y zona (variables predictoras o independientes) donde fueron capturadas. Posteriormente se aplicó una prueba de Mann-Whitney con corrección de Bonferroni para las comparaciones múltiples que permitiera ver cuál es el grupo que causa la diferencia, en el caso que lo hubiera. Factor de condición versus zona de captura en Región de La Araucanía y Región de Los Ríos La prueba de Kruskal-Wallis para el caso de la zona de captura de peces silvestres y asilvestrados y su relación con el factor de condición arrojo un valor en el test <2,4x10-12 (p< 0,05 estadísticamente significativo) lo que indica que las medias del factor de condición varía entre las diferentes zona geográficas. Para identificar qué grupo (s) generan estas diferencias, se aplicó un test de comparaciones múltiples de Mann-Whitney con corrección de Bonferroni, dando como resultado lo observado en la Tabla 28. Como se observa en la Tabla 28 (cuadros grises) existen diferencias estadísticamente significativas entre los niveles de factor de condición registrados y las zonas de captura de peces silvestres y asilvestrados en Lago Calafquén versus Lago Caburga, registrándose para las zonas de Lago Calafquén menores medias de factor de condición. De esta misma forma el Lago Caburga posee niveles (estadísticamente significativos) del factor de condición superior a todos sus pares, exceptuando Lago Ranco y Lago Villarrica. Para el Estuario de Valdivia, este mostró valores estadísticamente inferiores al Lago Colico y Lago Villarrica. En el caso del Lago Colico este tiene niveles del factor de condición superior a Lago Panguipulli, Ranco y Villarrica. Tabla 28. Resultados prueba de Mann-Whitney con corrección de Bonferroni (p< 0,05 estadísticamente significativo) para factor de condición zona en la Región de La Araucanía y Región de Los Ríos. Est. Valdivia L. Caburga L. Calafquén L. Colico L. Panguipulli L. Ranco L. Riñihue L. Caburga L. Calafquén 1 0, L. Colico 0,0067 2,10E-05 0, L. Panguipulli 1 0,0041 3,20E-10 1,00E L. Ranco ,40E-06 0, L. Riñihue 1 0, , ,10E-10 0, L. Villarrica 0,0256 0, ,40E-08 3,00E ,

69 Factor de condición versus zona de captura en región de Los Lagos La prueba de Kruskal-Wallis para el caso de la zona de captura de peces silvestres y asilvestrados en la región de Los Lagos y su relación con el factor de condición arrojo un valor en el test <2,2x10-16 (p< 0,05 estadísticamente significativo) lo que indica que las medias del factor de condición varía entre las diferentes zona geográficas para esta región. Para identificar qué grupo (s) generan estas diferencias, se aplicó un test de comparaciones múltiples de Mann-Whitney con corrección de Bonferroni, observándose los resultados en la Tabla 29. Como se aprecia en la Tabla 29 muchas de las zonas pertenecientes a la región de Los Lagos presentaron diferencias estadísticamente significativas (celdas grises) del factor de condición promedio, por ejemplo se destaca la zona del Lago Rupanco, la cual exhibe un menor promedio que el resto de las zonas, con excepción del Lago Chapo con el cual no se genera una diferencia significativa. Algo similar se genera al comparar el Lago Yelcho con las demás zonas, debido a que este tiene mayores promedios del factor de condición que las otras zonas, sin contar Lago Natri y Lago Huillinco. Dentro de las zonas de Chiloé (Macrozonas 2, 3 y 4), se encontraron diferencias al comparar Chiloé Norte (Macrozona 2) respecto de Macrozona 3 y 4 donde estos últimos poseen un nivel superior del factor de condición. Si observamos lo que sucede con el Lago Llanquihue, este posee diferencias con la mayoría de las otras zonas, no presentando significancia con Lago Natri y Macrozona 3 (p>0,05). Tabla 29. Resultados prueba de Mann-Whitney con corrección de Bonferroni (p< 0,05 estadísticamente significativo) para factor de condición zona en la Región de Los Lagos. Macro 3 Macro 2 Macro 4 Macro 5 L. Chapo L. Huillin L. Natri L. Rupa L. Yelcho Macro 1 Macro 2 1,50E Macro 4 1 0, Macro 5 5,10E , L. Chapo < 2E-16 < 2E-16 < 2E-16 < 2E L. Huillin 0, ,20E ,00017 < 2E L. Natri L. Rupa < 2E-16 < 2E-16 < 2E-16 < 2E ,878 0, L. Yelcho < 2E-16 < 2E-16 < 2E-16 < 2E-16 0, ,9547 0, L. Yanqui 0, ,00E-12 0,002 6,70E-12 1,30E-08 0, Macro 1 6,10E , < 2E ,658-56

70 Factor de condición versus zona de captura en Región de Aysén y Región de Magallanes La prueba de Kruskal-Wallis para el caso de la zona de captura de peces silvestres y asilvestrados en la Región de Aysén y Región de Magallanes, y su relación con el factor de condición, arrojó un valor en el test <2,6x10-14 (p< 0,05 estadísticamente significativo) lo que indica que las medias del factor de condición varía entre las diferentes zona geográficas para estas regiones. Para identificar qué grupo (s) generan estas diferencias, se aplicó un test de comparaciones múltiples de Mann- Whitney con corrección de Bonferroni, los cuales se muestran en la Tabla 30. Tabla 30. Resultados prueba de Mann-Whitney con corrección de Bonferroni (p< 0,05 estadísticamente significativo) para factor de condición zona en la Región de Aysén y Región de Magallanes. Macro 8 Macro 7 Macro 6 L. Riesco L. Sofía Cap. Arac Pto Nat Macro Macro 6 1 4,90E L. Riesco < 2E-16 1,10E-13 < 2E L. Sofía < 2E-16 3,60E-15 < 2E-16 < 2E Cap. Arac 0,0232 1,30E-09 7,30E-16 0, Pto Nat < 2E-16 < 2E-16 < 2E-16 1,50E Tal como muestra la Tabla 30 para estas dos regiones, existieron zonas que notoriamente presentaron diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) del factor de condición promedio respecto de otras. Se destaca la Macrozona 7, la cual presentó medias superiores en relación a las demás zonas, exceptuando Lago Sofía y Puerto Natales, con los cuales es inferior. Para el caso de Lago Riesco igualmente presentó diferencias con casi todas los demás lugares de captura (p>0,05). También se destaca que la zona de Puerto Natales presento diferencias estadísticamente significativas superiores de la media del factor de condición si la comparamos con casi todas las otras zonas, exceptuando Lago Sofía. Factor de condición versus especie capturada Al igual que en el análisis anterior, para comparar cómo se comporta el factor de condición respecto de la especie de pez capturado se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis, el cual arrojó un valor de <2,5,2x10-08 (p< 0,05 estadísticamente significativo) lo que indica que las medias del factor de condición varía entre las distintas especies capturadas. Para identificar qué grupo (s) generan estas diferencias, se aplicó un test de comparaciones múltiples de Mann-Whitney con corrección de Bonferroni, dando como resultado lo observado en la Tabla

71 Tabla 31. Resultados prueba de Mann-Whitney con corrección de Bonferroni (p< 0,05 estadísticamente significativo) para factor de condición especie. O. regia Peladilla Perca Róbalo S. Atlántico S. coho T. Arcoiris T. café B. australis 0, Peladilla 8E Perca 1,90E Róbalo 4,30E ,60E S. Atlántico 2,60E ,20E-05 0, S. coho 1,70E , , T. arcoiris 1,30E ,0253 < 2E-16 5,80E-10 0, T. café 0, T. fario 9,10E , ,30E-08 0, Al observar la Tabla 31 (cuadros grises) se puede evidenciar que existen diferencias estadísticamente significativas de la media del factor de condición de O. regia respecto de la de todas las restantes especies de peces (p<0,05) registrando valores inferiores de esta variable. Se aprecia notoriamente la existencia de diferencia estadística de la especie perca (mayor factor de condición) en relación a casi todas la demás especies, menos las especies trucha café y trucha fario. Si contrastamos las medias del róbalo con las de la trucha arcoiris y trucha fario, estas últimas muestran promedios superiores (p<0,05). Estado de madurez gonadal especies salmonídeas Se determinó el estado de madurez gonadal de los 2006 ejemplares de especies salmonídeas capturadas. El mayor porcentaje de peces, se observó dentro de la categoría de Virginal, con 78,6% del total de peces capturados. Mientras que el porcentaje más bajo se obtuvo en la categoría de En regresión, con 0,05% (1 pez). El detalle de estos resultados, se puede observar en la Tabla 32 y Figura 24. Tabla 32. Porcentaje del estado de madurez gonadal en especies salmonídeas. Estado de madurez gonadal N de peces Porcentaje Virginal ,6% Inmaduro ,5% En maduración 42 2,1% Premaduros 0 0% Maduros 16 0,8% Desovantes 0 0% En regresión 1 0,05% 58

72 Figura 24. Estado de madurez gonadal en ejemplares de especies salmonídeas capturadas. Los resultados obtenidos en cuanto al ciclo de vida de especies salmonídeas, no pudieron ser incorporados en el análisis epidemiológico, con el objetivo de establecer asociaciones entre los tamaños y etapas del ciclo de vida de los peces y los resultados positivos a las EAR consideradas en este estudio, ya que no se obtuvieron resultados positivos a ninguno de los a patógenos analizados en las especies salmonídeas capturadas. Objetivo 7: Caracterizar y cuantificar el riesgo de transmisión de una EAR entre peces silvestres/escapados/cultivo Organización de la información y elaboración de matriz de interacción de variables en base a estadística multivariada Se identificaron factores que puedan tener influencia sobre la variable dependiente que en este caso es el diagnóstico PCR positivo para una determinada EAR. En base a esto se establecieron las posibles interacciones entre factores del área geográfica dados por la presencia de centros de cultivo de especies salmónidas y los resultados obtenidos de capturas y diagnósticos a partir de los muestreos de especies silvestres. La Tabla 33 muestra el diseño conceptual de la matriz de interacción, la que incluye posibles relaciones en el ambiente dulceacuícola y marino. Las interacciones definidas a priori se sustentan en la revisión de antecedentes bibliográficos. Cabe destacar que las relaciones que se establecieron entre las variables independientes y las variables dependientes derivadas del modelo de regresión logística entregaron datos cuantitativos para cada factor, lo que permitió el establecer un ranking de factores de riesgo asociados a la presencia de diagnósticos positivos en las poblaciones de peces silvestre. 59

73 Tabla 33. Diseño conceptual de la matriz de interacción entre variables del centro de cultivo muestreado y resultados de la pesca de captura. Variable Especie Peso Longitud Fecha Signología PCR capturada captura captura captura captura (+) ACS S/I + + Tipo centro S/I S/I + Esp. cult. + S/I S/I S/I + + Tpo. Siembra Vacunación S/I S/I S/I S/I + + Mort. Diaria S/I S/I S/I S/I + + Mort. acum. S/I S/I S/I S/I + + Biom. cent. S/I + + S/I + + Peso prom. S/I + + S/I + + Brot. cent. S/I S/I S/I S/I + + Brot. Área + S/I S/I S/I + + Carga calig S/I + + Biom. Área S/I + + S/I + + Escap. Área S/I S/I + Temperatura S/I + + Salinidad + S/I S/I S/I + + Presencia centro corriente arriba S/I S/I S/I S/I + + Desinfección efluentes S/I S/I S/I S/I + + Nota: ACS: agrupación concesiones salmoneras; Esp. cult.: especie cultivada; Tpo. siembra: tiempo desde la siembra; Mort. Diaria: mortalidad diaria; Mort. acum.: mortalidad acumulada desde la siembra; Biom. cent.: biomasa centro; Peso prom.: peso promedio peces centro; Brot. cent.: Nº brotes en el centro; Brot área: Nº brotes en el área; Carga calig.: carga de Caligus rogercresseyi; Biom. área: biomasa del área; Escap. área: cantidad escapes en el área; Esp. capt.: especies obtenidas en la muestra de captura; Peso capt.: peso de las capturas; Long. capt.: longitud de las capturas; Fecha capt.: fecha de la captura; Sign. capt.: signos clínicos de la captura; PCR (+): porcentaje de peces capturados positivos a PCR para la detección del agente; S/I: sin interacción; +: posible interacción Conformación de panel de expertos ad hoc multidisciplinario En relación al panel de expertos, se extendió la invitación formalmente a 5 investigadores de la Universidad Austral de Chile: - Dr. Ricardo Enríquez renrique@uach.cl Médico Veterinario, Universidad Austral de Chile. Dr. Medicina Veterinaria, Ludwig Maximilians Universität, München, Alemania. Vicepresidente de Comisión de estándares Sanitarios de Animales Acuáticos OIE 60

74 - Dra. Carla Rosenfeld Médico Veterinario, Universidad Austral de Chile. Mg. en Ciencias, Mención Medicina Preventiva Veterinaria, Universidad Austral de Chile. Dr. Patología Animal: Sanidad Animal, Universidad de Zaragoza, España. - Dra. María José Navarrete majose.navarrete@uach.cl Médico Veterinario, Universidad de Chile. Master en Medicina Preventiva Veterinaria, Universidad de California. Ph.D. Universidad de Medicina Veterinaria, Hannover. - Dr. Alex Romero alexromero@uach.cl Bioquímico, Universidad Austral de Chile. Doctor en Biología Molecular y Celular, Universidad Austral de Chile. Director instituto de Patología Animal, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile. - Dr. (c) Ricardo Ildefonso ricardo.ildefonso@pathovet.cl Tecnólogo Médico, Universidad de Antofagasta. Médico Veterinario, Universidad Austral de Chile. Candidato a Doctor en Acuicultura, Universidad Austral de Chile. De los 5 investigadores, solo pudieron participar: Dr. Ricardo Enríquez, Dr. Alex Romero, Dr. (c) Ricardo Ildefonso. La reunión se realizó en las dependencias del Laboratorio de Biotecnología y Patología Acuática de la Universidad Austral de Chile, el día jueves 08 de agosto de 2013 de 11:30 a 13:00 hrs. El objetivo de la reunión fue principalmente presentar el modelo de análisis de riesgo desarrollado y aplicar una encuesta para conocer probabilidades relevantes dentro del modelo y presentar el resumen de resultados obtenidos en proyectos de seguimiento anteriores. El material gráfico presentado en esta reunión se detalla en el ANEXO Diseño y Aplicación de encuesta La encuesta aplicada al panel de expertos se presentó en función del árbol de decisión previamente establecido por el equipo técnico de IFOP, en la reunión efectuada el día 08 de agosto del El propósito de la aplicación de la encuesta, fue poder recabar información referente a la probabilidad de ocurrencia de los procesos que están involucrados y que son necesarios y relevantes en la transmisión de Enfermedades de Alto Riesgo (EAR), entre poblaciones de peces silvestres/asilvestrados hacia salmones de cultivo, esto debido a que no ha sido posible obtener información acerca de ciertos puntos dentro del proceso de transmisión, que son relevantes para el cálculo del riesgo final. 61

75 La obtención de estos parámetros permitió hacer una estimación más precisa del riesgo de transmisión de estas enfermedades entre las poblaciones de peces anteriormente descritas, colaborando y apoyando de esta manera a través de la gestión y comunicación de riesgo y la elaboración de programas de vigilancia de mayor efectividad. La encuesta y el árbol de decisión se presentan en el ANEXO Análisis de Riesgo de la transmisión de EAR entre peces asilvestrados/silvestres/cultivo Estimación de Riesgo Para llevar a cabo esta etapa dentro del análisis de riesgo se integraron los resultados de la probabilidad de todo el flujo de proceso (árbol de escenario), desde la presencia de peces silvestres positivos al agente hasta la presentación de mortalidad de piscirickettsiosis como consecuencias del contacto o probabilidad de transmisión. La Tabla 34 muestra la distribución de probabilidad ajustada para cada etapa dentro del proceso de transmisión de P. salmonis y su posterior consecuencia. Los valores que están asociados en la etapa de prevalencia aparecen con una x, debido a que este varía dependiendo de la zona a la cual se está evaluando, ya que está basado en la frecuencia de infección de los peces silvestres a P. salmonis. Para las etapas restantes el valor de los parámetros fue entregado a través de la encuesta de opinión de expertos a profesionales de destacada trayectoria en el ámbito de salud y epidemiología de peces. Tabla 34. Distribuciones ajustadas y sus parámetros para cada etapa del análisis de riesgo. Etapa Distribución Parámetros alfa 1 alfa 2 Prevalencia Beta X X Mínimo Más probable Máximo Liberación Pert 0,26 0,43 0,63 Contacto Pert 0,03 0,21 0,33 Mortalidad Triangular 0,05 0,15 0,43 A continuación se detallan los resultados del análisis de riesgo de la transmisión de P. salmonis desde peces silvestres a salmónidos de cultivo a nivel de un centro ubicado en las zonas analizadas en el presente estudio. 62

76 Tabla 35. Probabilidad de transmisión y estimación de la mortalidad a nivel de centro de cultivo producto de la transmisión de P. salmonis desde peces silvestres. Riesgo de Transmisión Riesgo Mortalidad Percentil 2,5 Media Percentil 97,5 Percentil 2,5 Media Percentil 97,5 Caleta Tortel 1,14% 2,78% 4,79% 0,15% 0,50% 1,13% Est. Valdivia 0,11% 0,40% 0,86% 0,02% 0,08% 0,23% Fiordo Aysén 0,40% 1,15% 2,21% 0,06% 0,24% 0,58% Macrozona 1 0,34% 0,93% 1,84% 0,05% 0,19% 0,49% Macrozona 3 1,45% 3,41% 5,77% 0,19% 0,72% 1,61% Macrozona 4 0,25% 1,41% 2,35% 0,12% 0,30% 0,74% Como se observa en la Tabla 35 aquellas zonas que presentaron los mayores riesgos de transmisión de P. salmonis desde peces silvestres/asilvestrados a salmones de cultivo fueron las áreas de Caleta Tortel y río Cochrane (Control Negativo) con un 2,78% (1,14% - 4,79%), Macrozona 3 con 3,41% (1,45% 5,77%), Macrozona 4 con 1,41% (0,25% 2,35%) y Fiordo Aysén con 1,15% (0,40% - 2,21%). Los lugares de menor riesgo de transmisión perteneció a Estuario de Valdivia con 0,4% (0,11% - 0,86) y Macrozona 1 con 0,93% (0,34% - 1,84%). Sin embargo el resultado observado en cuánto al riesgo de transmisión en la zona de Caleta Tortel y río Cochrane, se debe tomar con cautela, debido a que esta zona no presenta centros de cultivo en sus alrededores. El valor obtenido en este análisis de riesgo, está basado en los resultados de la encuesta a expertos, que hace referencia a información general y no específica para cada zona. En cuanto al riesgo producido a partir de peces silvestres infectados con P. salmonis, se muestran en la tabla 35 la estimación de mortalidad que se produciría a nivel de centro de cultivo. Se aprecia que el mayor impacto se evidencia en las zonas de Macrozona 3 (0,72%) y Caleta Tortel con 0,5%. Las de menor mortalidad se encontrarían en Estuario de Valdivia y Macrozona 1 con 0,08% y 0,19% respectivamente. La razón de que en algunas zonas el riesgo sea mayor se puede relacionar a que en la mayoría de estas se detectó la presencia del agente con frecuencias mayores si se les compara con sus símiles, lo que actúa aumentando la probabilidad de la transmisión desde peces silvestres hacia poblaciones de cultivo. El bajo impacto que tendría la infección con P. salmonis en peces silvestres así como las consecuencias generadas a partir de esta sobre las poblaciones cultivadas, se puede asociar con los bajos niveles de probabilidad asignados por el panel de expertos a los eventos relativos al riesgo de transmisión del agente desde los peces silvestres. Por esta razón es de interés la realización de 63

77 estudios que permitan determinar de manera más fidedigna los niveles de probabilidad de estos eventos, y así tener estimaciones de riesgo con menores niveles de incertidumbre. Análisis de Sensibilidad Utilizando el método de correlación de Spearman, se evaluó la correlación de las variables del modelo de análisis de riesgo con las pérdidas estimadas de mortalidad producto de un brote de piscirickettsiosis en un centro de cultivo a partir de la transmisión desde un pez silvestre. Estos resultados se grafican para cada una de las zonas en las Figuras 25 a la 30. En la totalidad de las zonas la variable que presentó la mayor correlación con el riesgo de transmisión de P. salmonis entre peces silvestres y de cultivo fueron la mortalidad, con valores que variaron entre 0,59 a 0,74. Las otras variables que más correlación presentan fueron el contacto para cinco de las zonas que entraron en el análisis y la prevalencia en sólo una. Para poder aclarar estas últimas variables (estimadas en base a opinión de expertos) con metodologías de investigación más precisas, como por ejemplo ensayos de laboratorio, pueden tender a disminuir la subjetividad de la estimación, lo cual sería de gran importancia para lograr valores cuantitativos más precisos. La liberación del agente al medio es la que presenta los valores más bajos de correlación, siendo muy similares entre zonas, fluctuando entre 0,18 y 0,25. Figura 25. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de transmisión de P. salmonis en Control Negativo (Caleta Tortel y río Cochrane). 64

78 Figura 26. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de transmisión de P. salmonis en Estuario de Valdivia. Figura 27. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de transmisión de P. salmonis en Fiordo Aysén. 65

79 Figura 28. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de transmisión de P. salmonis en Macrozona 1. Figura 29. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de transmisión de P. salmonis en Macrozona 3. 66

80 Figura 30. Correlación de Spearman de las variables que determinan el riesgo de transmisión de P. salmonis en Macrozona Zonificación en base al riesgo En la Figura 31 se observan las distintas zonas geográficas de muestreo delimitadas, las cuales representan de manera diferenciada las zonas que presentaron resultados positivos a PCR para P.salmonis en los individuos capturado. Se definió una escala de 3 colores considerando los resultados obtenidos. De esta forma se presentan en rojo las zonas que como resultado del modelo de regresión logística, obtuvieron valores de odds ratio o razón de probabilidad de presentación del evento en el grupo expuesto versus el no expuesto al factor de riesgo (OR) superiores a 1, clasificándose como zonas de mayor riesgo de transmisión de P.salmonis entre poblaciones silvestres y poblaciones de cultivo. En color amarillo se presentan las zonas que registraron valores de OR menores a 1, lo que implica que son zonas de menor riesgo de transmisión de P.salmonis entre poblaciones silvestres y poblaciones de cultivo. Finalmente las zonas en color verde, representan aquellas áreas en que el riesgo de transmisión de P.salmonis entre las poblaciones silvestres y de cultivo es mínimo o inexistente debido a que el valor p no fue significativo en el análisis univariado (p>0,25) por lo tanto no se incluyó en el modelo final del análisis de regresión. 67

81 Figura 31. Análisis de factores de riesgo de las zonas vigiladas en agua de mar y estuario, dada la positividad a P.salmonis. 68

82 Objetivo 8: Relacionar epidemiológicamente los brotes de EAR en peces de cultivo con el estatus sanitario de las especies silvestres muestreadas. Aquellas variables que presentaron una asociación condicional (univariado) con la muestra PCR positiva a P. salmonis de los peces muestreados y analizados se observan en la Tabla 36. Tabla 36. Variables retenidas del análisis univariado y sus respectivos estadísticos. Variables Estimador Error estándar Odds ratio valor p Zona_Fiordo_Aysen 0,7812 0,2952 2,184 0,00814 Zona_Macrozona_1-1,4834 0,5985 0,226 0,0132 Zona_Macrozona_3-1,4413 0,5987 0,236 0,0161 Zona_Macrozona_4 1,1535 0,2792 3,169 3,59E-05 Especie_Róbalo 2,8093 0, ,598 7,13E-08 Especie_Pejerrey -2,2208 0,5217 0,108 2,07E-05 Factor_de_Condición 1,2644 0,5056 3,541 0,0124 Estación_Primavera_Verano 3,227 0, ,096 6,30E-08 Brote_SRS 0,7306 0,4387 2,076 9,58E-02 Cultivo_Salar 0,9220 0,475 2,514 0,0523 Cultivo_Coho 1,4201 0,4728 4,137 0,00267 De las variables previamente seleccionadas del análisis univariado se puede destacar los valores altos de odds ratio (razón de probabilidad de presentación del evento en el grupo expuesto versus el no expuesto al factor de riesgo) de las variables zona Macrozona 4 (3,169), especie róbalo (16,598) y peces capturados en temporada primavera verano con 25,096 (OR) en relación al resto de los factores que lograron ser significativos (p<0,25). Las variables que presentaron una asociación incondicional con PCR positivos a P. salmonis de los peces analizados se muestran en la siguiente tabla. 69

83 Tabla 37. Variables retenidas en el modelo final (análisis multivariado) y sus respectivos estadísticos. Variables Estimador Odds ratio valor p 2,5% 97,5% Constante -23,8150 0,000 3,33E-16 3,06E-5 < 2E-16 Zona_Fiordo_Aysen 0,0554 1,746 1,275 2,710 0,0406 Zona_Macrozona_1-2,1487 0,116 0,025 0,417 0,0019 Zona_Macrozona_4 0,8088 2,245 1,006 5,827 0,0859 Especie_Róbalo 17,8320 2,984 2,109 3,958 0,0023 Estación_Primavera_Verano 3,5191 1,295 1,092 1,599 0,0000 Brote_Piscirickettsiosis 3,1238 1,365 1,132 1,525 0,0049 Cultivo_Salar 4,6892 3,874 3,195 4,019 0,0045 Al observar los valores presentes en la Tabla 37 respecto de las zonas donde existían centros de producción y en torno a las cuales se capturaron los peces para su posterior análisis, se aprecia que la zona de Fiordo Aysén posee 1,746 (1,275 2,710) veces más probabilidades de presentar peces positivos a P. salmonis respecto de las demás zonas donde se realizó la pesca de investigación. Situación similar sucede con la zona de Macrozona 4 que exhibe 2,245 (1,006 5,827) veces más probabilidades. La situación anterior es coincidente con los lugares de más alta prevalencia o donde se obtuvo un número alto de individuos positivos. Así como algunos lugares son capaces de generar una mayor probabilidad de obtener peces silvestres/asilvestrados positivos a P. salmonis, también puede suceder lo contrario, como es el caso de Macrozona 1, donde hay una probabilidad de 0,116 (0,025 0,417) veces menos de presentar positividad al agente. En el caso de las especies capturadas, una muestra de róbalo tiene 2,984 (2,109 3,958) veces más probabilidades de dar positivo a P. salmonis que las demás especies, siendo el único grupo que es factor de riesgo. Esto se puede deber a que esta especie es la que con mayor frecuencia de captura en las campañas de pesca y a la vez la que presenta la mayor proporción de individuos positivos. Aquellas muestras tomadas en época de primavera verano tienen una probabilidad de 1,295 (1,092 1,599) veces más de presentar positividad que aquellas que se obtuvieron en temporadas de otoño invierno, lo cual se puede relacionar con las condiciones climáticas, ya que la temperaturas imperantes en esas estaciones son más elevadas, facilitando el desarrollo de P. salmonis. 70

84 La manifestación de brotes de piscirickettsiosis en centros de cultivo en el periodo previo o durante el muestreo hace que la probabilidad de que los peces capturados estén positivos a P. salmonis, sea 1,365 (1,132 1,525) veces mayor con respecto a centros que no reportaron brotes o que se encontraban en descanso sanitario al momento del muestreo. En cuanto a la variable tipo de cultivo presente al momento de la captura, la presencia de centros con biomasas vivas de la especie salmón Atlántico en zonas aledañas al lugar de captura del pez silvestre, mostró un OR de 3,874 (3,195 4,019) en relación a otro tipo de especie cultivada. Objetivo 9: Identificar y evaluar la capacidad de que especies no salmonídeas puedan actuar como reservorio de una EAR Estudios de Desafío de Eleginops maclovinus Con la actividad de pesca en la zona de Manao Norte, realizada el día 02 de mayo, se lograron capturar 188 ejemplares de róbalos, los cuales fueron inmediatamente trasladados al Modulo Experimental de Organismos Acuáticos (MEOA) del Centro de Maricultura Hueihue, Chiloé, perteneciente a IFOP. Los peces fueron distribuidos en 8 estanques de 1 m 3, con 15 peces cada uno (120 peces). Los peces restantes (68), fueron mantenidos como reserva, en el Modulo Experimental 2 en estanques de 2 m 3. Los róbalos del MEOA, fueron mantenidos en aclimatación durante 10 días, con alimento comercial para salmones, sin embargo durante este periodo de tiempo no comieron de dicho alimento, por lo que fue reemplazado por alimento natural correspondiente a mitílidos, de los cuales se alimentaron normalmente. Las truchas (no vacunadas contra P. salmonis) fueron trasladadas desde el Centro Lago Natri de Trusal, al MEOA, Hueihue, con fecha 29 de mayo de 2013, previo chequeo sanitario. Una vez que las truchas ingresaron al centro, fueron distribuidas en los mismos 10 estanques de 1 m 3 que ya contenían los róbalos, y distribuidas a razón de 15 peces cada uno (150 peces). Los peces restantes (150), fueron mantenidos como reserva, en el Modulo Experimental 2 en estanques de 2 m 3. Cabe mencionar que las truchas estuvieron separadas de los róbalos por una malla que dividió el estanque en 2 partes iguales. Fueron alimentadas con pellet calibre 4 dieta estándar comercial, y aclimatadas hasta la llegada del inóculo de Piscirickettsia salmonis. El inóculo fue proporcionado por el Dr. Ricardo Enríquez, del Laboratorio de Biotecnología y Patología Acuática de la Universidad Austral de Chile y correspondió a una cepa del genogrupo 2, aislada de salmón Atlántico, semejante a la secuencia detectada por PCR en róbalos. La concentración entregada según densidad óptica a 625 nm fue de 0,056 que corresponde a TCID50/ml. Con fecha 02 de julio de 2013, fue retirado de la Universidad Austral de Chile en Valdivia y trasladado inmediatamente a Hueihue, Chiloé para la inoculación de los grupos troyanos. Los grupos troyanos de róbalos y truchas fueron inyectados con 0,2 ml del inóculo. 71

85 El protocolo del Estudio de desafío por cohabitación se encuentra detallado en el ANEXO 7. Transcurridos 30 días post inoculación (pi), no se observó mortalidad de los grupos troyanos ni cohabitantes en ninguno de los estanques del MEOA. Tampoco se observaron cambios en cuanto al comportamiento de los peces, los que siguieron alimentándose normalmente, sin presentar evidencia alguna de la enfermedad. En consideración de estos antecedentes, el ensayo tuvo que ser finalizado, y los peces fueron sacrificados con fecha 05 de agosto (33 días pi). El sacrificio de los peces se realizó mediante sobredosis de anestésico (> 250 mg/l de benzocaína clorhidrato). Se tomaron muestras en duplicado, de improntas de riñón y bazo en portaobjetos, de cada uno de los peces. Las muestras provenientes de los grupos troyanos de truchas y róbalos, fueron analizados por tinción de Gram e prueba de inmunofluorescencia mediante anticuerpos (IFAT) para P. salmonis, en el Laboratorio de Microbiología del IFOP. No se observó la presencia de organismos cocoides Gram negativos en las muestras, tampoco se observó la presencia de fluorescencia en las muestras de IFAT. Objetivo 10: Proponer políticas públicas relacionadas con la mitigación de los riesgos de transmisión previamente identificados. A continuación se presenta un listado de propuestas de políticas públicas relacionadas con la mitigación de los riesgos de transmisión previamente identificados a través de la ejecución de la presente iniciativa: 1. Establecimiento de un Programa de Vigilancia Específico de Enfermedades de Alto Riesgo (EAR) en peces silvestres: Se propone el establecimiento de un Programa de Vigilancia Específico de Enfermedades de Alto Riesgo (EAR) en peces silvestres basado en los antecedentes ya obtenidos (posivitidad a P. salmonis) de los proyectos previamente ejecutados por IFOP en el marco de la Asesoría Integral para toma de decisiones en Pesca y Acuicultura, ASIPA, en los años 2010, 2011 y El programa contempla la realización de muestreos entre los meses de Septiembre y Mayo en las zonas propuestas en la Tabla

86 Tabla 38. Zonas propuestas para muestreo en el contexto del Programa de Vigilancia Específico de EAR en peces silvestres. Zona de muestreo Fiordo Aysén Estuario de Valdivia y Río Valdivia Macrozona 1 (Estuario y Seno de Reloncaví) Macrozona 5 (Hornopirén y Fiordo Comau) Macrozona 2 (Chiloé Norte) Macrozona 4 (Chiloé Sur) Macrozona 3 (Chiloé Central) Macrozona 6 (Melinka y Guaitecas norte) Macrozona 7 (Guaitecas Sur, Fiordo Cupquelan y Estero Quitralco) Macrozona 8 (Fiordo Puyuhuapi y Raúl Marín Balmaceda) Caleta Tortel y Río Cochrane Puerto Natales Código FA EV M1 M5 M2 M4 M3 M6 M7 M8 CN PN El Programa de Vigilancia considerará un catastro anual del estatus sanitario de las poblaciones silvestres en las zonas propuestas en la tabla 38. Los muestreos se desarrollarán durante los meses de Septiembre a Mayo de cada año. Los resultados derivados de este programa de Vigilancia serán entregados a la Subsecretaría de Pesca en el mes de Junio de cada año. Durante el mes de Julio de cada año se desarrollará un nuevo programa de muestreos, el que deberá ser presentado al Comité Técnico definido por SUBPESCA para ser validado e implementado a contar del mes de Septiembre del año respectivo. En función de los resultados obtenidos del Programa de Vigilancia Específico propuesto, se abordarán las medidas de mitigación a implementar, tanto en base a antecedentes bibliográficos de medidas implementadas en otros países con una problemática similar, como a la consideración de las opiniones y conclusiones obtenidas de las encuestas aplicadas al panel de expertos, el análisis de riesgo y el análisis de factores de riesgo. 2. Disminución de la población de peces de cultivo susceptibles: En las zonas en que, de acuerdo a los resultados obtenidos de la vigilancia de EAR en peces silvestres, se presente un mayor riesgo de encontrar peces silvestres positivos al patógeno P.salmonis, se propone restringir el ingreso de forma exclusiva a grupos de peces vacunados a centros de mar, como a su vez la utilización de protocolos y procedimientos que favorezcan la mantención de peces inmunocompetentes, tales como utilización de dietas funcionales, utilización de inmunoestimulantes o aplicación de booster de vacunas orales durante el periodo de engorda en mar. 73

87 3. Minimizar las pérdidas de alimento en los centros de cultivo de las áreas positivas: Dado que el alimento disponible para consumo de los peces silvestres es uno de los principales factores que favorece las interacciones entre peces silvestres y peces de cultivo, deben considerarse procedimientos o medidas que apunten a minimizar las pérdidas de alimento en los centros de cultivo en que existan poblaciones de peces silvestres positivas. Al no existir alimento disponible, es esperable que disminuya el ingreso de poblaciones silvestres próximas a los peces en cultivo, por lo que disminuirá la tasa de contacto entre ellos minimizando la probabilidad de transmisión del patógeno. Propuestas de acciones al respecto son: a) Dosificar el alimento en varias raciones pequeñas en lugar de una ración única para favorecer el consumo de la totalidad del alimento entregado. b) Implementar sistemas de control de pérdidas de alimento: Los sistemas de control de pérdidas permiten regular las tasas de entrega o detener el proceso de alimentación cuando la población de peces está saciada. La señal de detención ocurre generalmente cuando pasa una nube de pellets en la última fase o velocidad de alimentación, esta nube se conoce como señal de para. En los siguientes puntos se mencionan los sistemas de control de pérdidas de alimento más comúnmente empleados en la industria. Cámara submarina: Por su costo bajo costo este sistema es el más popular dentro de la industria salmonera. Consiste en una cámara submarina que apunta hacia la superficie, generalmente ubicada entre 3 a 9 metros. Durante el proceso de alimentación, el operador del sistema monitorea el comportamiento del cardumen y si ve presencia abundante de pellets puede regular la velocidad de entrega de acuerdo a la tasa de consumo de la población o detener la entrega. Figura 32. Sistema de control de alimentación por cámara (Fuente Skretting S.A.) 74

88 Sensores submarinos Estos sistemas buscan reemplazar la cámara submarina por un sensor (ubicado a la misma profundidad). Estos sensores cuentan los pellets en la medida que van pasando y envían una señal al operador o al sistema automático al que se encuentran enlazados. Existen tres tipos de sensores, los cuales se presentan en la figura 33. Figura 33. Sensores de conteo de pellets (1) Cono + liftup + equipo contador (2) Sensor doppler (3) Sensor infrarrojo (Fuente: Akvagroup S.A.). Una deficiencia a tener en cuenta de estos sistemas es que no existe una imagen de lo que ocurre con el comportamiento del cardumen, por lo cual se dificulta inferir la real apetencia de los peces. Además, cuando los sensores se obstruyen o ensucian con algas pueden entregar una señal incorrecta de para. 4. Fomentar el ingreso de peces provenientes de programas de mejoramiento genético resistentes a las enfermedades en zonas positivas de poblaciones silvestres: Dado que al existir peces silvestres positivos existe un riesgo de transmisión del patógeno a las poblaciones en cultivo, se debe considerar el favorecer en estas áreas, la siembra de peces provenientes de programas de mejoramiento genético para resistencia a enfermedades endémicas de las zonas, considerando el historial de los peces silvestres derivados del programa de Vigilancia Específico. 5. Trazabilidad de pescas de peces silvestres provenientes de zonas positivas a los patógenos vigilados: Dado que los peces silvestres provenientes de zonas positivas a los patógenos vigilados, representan un potencial riesgo de diseminación de lo agentes pesquisados por efecto de 75

89 actividades antropogénicas, tales como uso como carnadas de los pejerreyes de mar (O. regia). Es necesario considerar la trazabilidad de los ejemplares de especies que resulten positivas en el programa de Vigilancia, con el objetivo de evitar su uso como carnada en zonas en que no se hayan presentado poblaciones de peces silvestres positivos dentro del programa de Vigilancia Anual o históricos en atención a los antecedentes señalados por Hervé-Claude (2008) que analiza el riesgo de introducir una enfermedad por medio de la utilización de carnada positiva. 6. Comunicación del riesgo en forma contemporánea y oportuna a los coordinadores de ACS: Dado el riesgo que significa para una determinada área, el que existan poblaciones de peces silvestres positivas, se debe considerar la comunicación de los antecedentes derivados del Programa Específico de Vigilancia en forma contemporánea y oportuna a las empresas y operadores de cada Agrupación de Concesiones de Salmonicultura (ACS), con el objetivo de que incorporen los antecedentes en sus evaluaciones de riesgo internas y decisiones de siembra y cosecha del área. Se propone como mecanismo para implementar lo anterior, la publicación de un informe con los resultados del programa de Vigilancia Anual en la página web de la Subsecretaría de Pesca y Acuicultura. 7. Comunicación de resultados y antecedentes para favorecer el desarrollo de Investigación básica: Una de las principales dificultades en la Vigilancia de Enfermedades en las poblaciones de peces silvestres, es cuantificar el riesgo en forma concreta, dado que existen una serie de factores tales como antecedentes relativos a las vías de eliminación del patógeno desde los peces silvestres, número poblacional de peces silvestres, rutas migratorias, susceptibilidad de las poblaciones positivas, etc., que no son conocidos y deben ser desarrollados a nivel de investigación en ciencia básica. El disponer de estos antecedentes permitirá respaldar un análisis de riesgo del tipo cuantitativo sin subjetividades. Para ello se propone, incorporar en el informe a publicar anualmente por la Subsecretaría de Pesca y Acuicultura, los resultados del Programa de Vigilancia de EAR en peces silvestres, una sección con un listado de estudios científicos prioritarios y necesarios para mejorar las conclusiones generadas por la vigilancia. 76

90 6. CONCLUSIONES 1. Finalizadas las dos campañas de muestreo en las 29 zonas distribuidas en las regiones de La Araucanía, Los Ríos, Los Lagos, Aysén y Magallanes, se logró obtener un total de individuos capturados y un promedio de 155 peces por zona geográfica. 2. De la totalidad de los peces capturados, un 44,6% (2006 ejemplares), correspondieron a especies salmonídeas. 3. La especie capturada con mayor frecuencia respecto de la totalidad de las cinco regiones que abarcó este proyecto fue la trucha arcoiris con un 31% (1388), seguido de róbalo con un 25% (1131) y O. regia y B. australis con 15% (667) y 9% (389) respectivamente. 4. En la región de La Araucanía, el Lago Caburga es el lugar con mayor número de peces capturados con 156 individuos, seguido por el Lago Calafquen con 154. La región de Los Ríos mostró que en el Estuario de Valdivia y Lago Ranco se capturó el mayor número de peces con 164 y 155 individuos respectivamente. 5. Para la región de Los Lagos la mayor cantidad de peces capturados fue la Macrozona 5 (181) y el menor número en Lago Llanquihue con 145 individuos. El más alto número de peces muestreados en la Región de Aysén se encontró en la zona de Macrozona 8 y Macrozona 7 con 185 y 181 peces respectivamente. En la zona de la Región de Magallanes se capturaron peces con mayor frecuencia en el sector de Puerto Natales (153). 6. De las Enfermedades de Alto Riesgo pesquisadas en el marco del presente proyecto de investigación, solo se detectó la presencia de individuos positivos al agente patógeno Piscirickettsia salmonis. 7. Las zonas de Caleta Tortel y Río Cohrane (Control Negativo) (7,25%), Fiordo Aysén (12,50%) y Macrozona 4 (15,54%) son las de más alta prevalencia para P. salmonis. 8. Las Macrozonas 2, 5, 6, 7 y 8, además de Capitán Aracena, Puerto Natales y los lagos Huillinco y Natri, fueron los lugares que no presentaron positividad para este agente. 9. Las únicas especies que presentaron positividad a P. salmonis fueron en primer lugar el róbalo con un 5,37% y una prevalencia ponderada de 2,66% y pejerrey con un 0,70% y una prevalencia ponderada de 0,18%. 10. Los análisis de laboratorio realizados, resultaron negativos en un 100% para las especies salmonídeas, por lo que no fue posible relacionar la positividad con características morfológicas que indiquen si corresponden a peces escapados o asilvestrados. 77

91 11. El tipo de contenido gástrico que se encontró con mayor frecuencia fue moluscos con un 20%, seguido de los individuos que no presentaron ningún tipo de contenido (19%) y el tipo de algas y seromucoso, ambos con un 12%. 12. En cuanto al pellet o alimento comercial hallado en los peces capturados, este representó tan sólo un 5% (199). 13. Respecto del factor de condición, la mayor media en la región de La Araucanía se encontró en el Lago Caburga con 1,371, Lago Ranco con 1,217 en el caso de la Región de Los Ríos y un valor del factor de condición de 1,403 en el Lago Puyehue si hablamos de la Región de Los Lagos. Los menores valores se observaron en el Lago Calafquén (1,080) en el caso de la primera, Estuario de Valdivia (0,957) para la segunda región mencionada y Macrozona 1 (0,771) en la Región de Los Lagos. 14. En la Región de Aysén, la Macrozona 6 es la que presenta el nivel del factor de condición más elevado (1,162), el caso opuesto está representado por Macrozona 8 con una media de 1,022. Para el caso de la Región de Magallanes, el sector del Lago Sofía presentó el más alto valor del factor con 1,246, observándose el más bajo para la zona de Capitán Aracena con 0, Las zonas con mayor dispersión del factor de condición se observaron en el Lago Caburga (La Araucanía), el sector de Lago Puyehue, Lago Chapo y Lago Rupanco en la Región de Los Lagos. 16. La perca (1,337) y la trucha café (1,290) son las especies con el mayor promedio del factor de condición. Siendo el O. regia y peladilla las que presentaron el peor factor de condición con 0,784 y 0,919 respectivamente. 17. En cuanto a la madurez gonadal de las especies salmonídeas, el mayor porcentaje se observó dentro de la categoría de Virginal, con 78,6% del total de peces capturados. Mientras que el porcentaje más bajo se obtuvo en la categoría de En regresión, con 0,05% (1 pez). 18. En relación a las zonas de mayor riesgo de transmisión de P. salmonis entre poblaciones silvestres y de cultivo, destacan las áreas de Caleta Tortel y río Cochrane (Control Negativo) con un 2,78% (1,14% - 4,79%), Macrozona 3 con 3,41% (1,45% 5,77%), Macrozona 4 con 1,41% (0,25% 2,35%) y Fiordo Aysén con 1,15% (0,40% - 2,21%). 19. Los lugares de menor riesgo de transmisión pertenecieron a Estuario de Valdivia con 0,4% (0,11% - 0,86) y Macrozona 1 con 0,93% (0,34% - 1,84%). 78

92 20. El mayor impacto de mortalidad se evidencia en las zonas de Macrozona 3 (0,72%) y Caleta Tortel con 0,5%. Las de menor mortalidad se encontrarían en Estuario de Valdivia y Macrozona 1 con 0,08% y 0,19% respectivamente. 21. El bajo impacto que tendría la infección con P. salmonis en peces silvestres, así como las consecuencias generadas a partir de esta sobre las poblaciones cultivadas, se puede asociar con los bajos niveles de probabilidad asignados por el panel de expertos. 22. La mayor correlación con el riesgo de transmisión de P. salmonis entre peces silvestres y de cultivo fueron la mortalidad, con cifras que variaron entre 0,59 a 0,74%. 23. Las otras variables que más correlación presentan fueron el contacto y la prevalencia de cada zona. 24. El factor de liberación del agente al medio es el que presenta los valores más bajos de correlación. 25. Las zonas donde se capturaron los peces, algunas especies, la estación del año, brotes de Piscirickettsiosis en los centros de cultivo previo y durante el muestreo de peces silvestres y cultivo de salmón Atlántico en los lugares de muestreo, fueron factores de riesgo para la positividad a P. salmonis en individuos silvestres/asilvestrados. 26. La Macrozona 4 fue la que presentó la probabilidad más alta de riesgo, respecto de las demás zonas con un valor de odds ratio de 2,245, siendo la única que presentó riesgo en la Región de Los Lagos. 27. En la Región de Aysén la única zona que es factor de riesgo es Fiordo Aysén con un valor de odss ratio de 1, Róbalo es la única especie que presenta mayores probabilidades de obtener muestras positivas (OR=2,984), en relación a las otras especies capturadas. 29. Muestras tomadas en estación primavera verano presentan mayores probabilidades de ser positivas respecto de las que no se tomaron en esta época (OR=1,295). 30. Brotes de Piscirickettsiosis en centros de cultivo cercanos a donde se tomo la muestra es un factor de riesgo (OR=1,365) para la presentación de peces silvestres/asilvestrados positivos a P. salmonis. 31. Peces capturados en zonas con centros de cultivo de salmón Atlántico tuvieron mayores probabilidades de positividad (OR=3,874) que cuando existía otro tipo de especie cultivada. 79

93 32. No fue posible identificar y evaluar la capacidad de que especies no salmonídeas puedan actuar como reservorio de una EAR mediante el desafío por cohabitación entre truchas y róbalos, ya que no se desarrolló la enfermedad en los grupos troyanos inoculados con el patógeno. 33. Se presentaron una serie de propuestas a modo de políticas públicas a adoptar por parte de las autoridades competentes, en el ámbito de la Vigilancia de Enfermedades de Alto Riesgo en poblaciones de peces silvestres. 80

94 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Cadrin S., Friedland K.D. & Waldman J Stock identification methods: an overview. In S. Cadrin, K. D. Friedland, & J. Waldman, eds. Stock identification methods. San Diego, California: Elsevier Academic Press, pp. 36. Campalans B, P Rojas, JI Sepúlveda, R Castro, I Guerrero & J Pascual, Programa de vigilancia de salmonídeos cultivados en la zona sur austral. Informe Final FIP N , Universidad Católica de Valparaíso: 235 pp. Carlander K.D Handbook of freshwater. Fishery. Biology 3rd ed., Des Moines, Iowa: The Iowa State University press. 750 p. Chase, D. M., D. G. Elliott, and R. J. Pascho Detection and quantification of Renibacterium salmoninarum DNA in salmonid tissues by real-time quantitative polymerase chain reaction analysis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigations 18: Cunningham CO & M Snow Genetic analysis of infectious salmon anaemia virus (ISAV) from Scotland. Dis Aquat Org 41:1 8. Dohoo, I., W. Martin and H. Stryhn, Veterinary Epidemiologic Research. AVC, Prince Edward Island, pp: 706. Gaggero A, Castro H y Sandino A.M First isolation of Piscirickettsia salmonis from coho salmon, Onchorynchus kisutch (Walbaum), and rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), during the freshwater stage of their life cicle. Journal of fish Dis. 18: Garcés LH, J Larenas, PA Smith, S Sandino, CN Lannan & JL Fryer Infectivity of a rickettsia isolated from coho salmon Oncorhynchus kisutch. Disease of Aquatic Organism 11: Haugland O, Mikalsen AB, Nilsen P, Lindmo K, Thu B, Elliassen TM, Roos N, Rode M, Evensen O Cardiomyopathy syndrome of Atlantic salmon (Salmo salar L.) is caused by a dsrna virus of the Totiviridae family. J of Virolology: doi: /jvi Hervé-Claude L.P.; Carpenter T.E.; Hedrick R.P Risk of introducing viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) to the Chilean South Pacific via sardine imports from Europe. Dis Aquat Organ Jan 24;78(3): Hungnes O, TØ Jonassen, CM Jonassen & B Grinde Molecular epidemiology of viral infections: how sequence information helps us understand the evolution and dissemination of viruses. APMIS 108:

95 Hyslop E.J Stomach contents analysis a review of methods and their aplication. J. Fish Biol. 17: Intesal, Aquatic Health & Universidad Austral de Chile Catastro de enfermedades de peces nativos circundantes a centros de cultivo de salmónidos. Informe final FIP N Instituto Técnologico del Salmón: 75 pp. Joint Goverment/Industry Working Group Final Report of the Joint Government/Industry Working Group on Infectious Salmon Anaemia (ISA) in Scotland. Scottish Executive, Scotland: 140 pp. Johansen LH, Jensen I, Mikkelsen H, Bjorn PA, Jansen PA, Bergh O Disease interaction and pathogens exchange between wild and farmed fish populations with special reference to Norway. Aquaculture 315 (2011) León J, R Ávalos & M Ponce Flavobacterium psychrophilum y su patología en alevines de Onchorhynchus mykiss del centro piscícola El Ingenio, Huancayo. Revista Peruana de Biología 15(2): Murray AG, CD Busby & DL Bruno Infectious Pancreatic Necrosis Virus in Scottish Atlantic Salmon Farms, Emerging Infectious Disease 9: Nylund A & P Jakobsen Sea Trout as a carrier of infectious salmon anemia virus. J Fish Biol 47: Niklitschek E, & Aedo E Estudio del ciclo reproductivo de las principales especies objetivo de la pesca deportiva en XI Región. Informe final FIP 2000-Coyahique, Chile: Universidad Austral de Chile. Organización Mundial de Sanidad Animal Aquatic Animal Health code. Plarre H, M Devold, M Snow & a Nylund Prevalence of infectious salmon anaemia virus (ISAV) in wild salmonids in western Norway. Dis Aquat Org Vol. 66: Raynard RS, AG Murray & A Gregory Infectious salmon anaemia virus in wild fish from Scotland. Dis Aquat Org 46: Ricker W.E Computation and interpretation of biological statistics of fish populations, Otawa, Canadá. Servicio Nacional de Pesca Informe Sanitario. 82

96 Soto D., Jara F., Guerrero A., Godoy C., Ávila X., Moreno C., Niklitschek E.J., Molinet C. & Aedo J.E Evaluación de salmónidos de vida libre existentes en las aguas interiores de las regiones X y XI. Informe Final Proyecto FIP 9531, Puerto Montt, Chile: Universidad Austral de Chile. Soto D, F Jara & C Moreno Escaped salmon in the inner seas, Southern Chile: facing ecological and social conflicts. Ecological Applications 11: Soto D Estudio del ciclo reproductivo de las principales especies objetivo de la pesca deportiva en la X región. Informe Final FIP Universidad Austral de Chile. 153 p. Soto D & F Norambuena Evaluation of salmon farming effects on marine systems in the inner seas of southern Chile; a large-scale mensurative experiment. Journal of Applied Ichthyology 20: Stagg R, D Bruno, C Cunningham, T Hastings & I Bricknell Infectious salmon anaemia in Scotland: epizootiology and pathology. State Vet J 9:

97 A N E X O S

98

99 A N E X O 1 Protocolo toma de muestras.

100

101 Código: LN Necropsia Procedimiento de Necropsia y Toma de Muestras PROCEDIMIENTO DE NECROPSIA Y TOMA DE MUESTRAS DE PECES Página 1 de 3 Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 02 Fecha : Febrero 2013 Aprobado por: Jefe de Proyecto. 1. Propósito El objetivo de este procedimiento es la obtención de muestras para análisis de diagnóstico de enfermedades de peces. 2. Alcance Este procedimiento es ejecutado por el personal autorizado de IFOP y se aplica a nivel de investigación y diagnóstico de enfermedades. 3. Referencias 3.1. OIE. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals Responsabilidades El Jefe de Laboratorio es responsable de la implementación y actualización de este procedimiento. También es responsable de supervisar su correcta ejecución, revisar los resultados, revisar y/o elaborar el informe final de los resultados y supervisar el envió de los informes vía correo electrónico u otra vía quien solicita dicho análisis al laboratorio. El analista de laboratorio es el responsable de realizar las actividades de análisis descritas en este procedimiento. 5. Desarrollo de la actividad 5.1. Equipos y Materiales Papel Kraft o Jumbo Material quirúrgico estéril Algodón Tubos Eppendorf de 2 ml con etanol, etiquetados para la zona a muestrear Cajas para tubos tipo Eppendorf Cajas de termoaislante Guantes Ictiómetro o regla Balanza Aspersores Vasos precipitados Cámara fotográfica digital 5.2. Reactivos Alcohol 70 (para desinfectar) Etanol calidad para análisis Virkon s Deep blue 1 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 1.

102 Código: LN Necropsia Procedimiento de Necropsia y Toma de Muestras Página 2 de 3 PROCEDIMIENTO DE NECROPSIA Y TOMA DE MUESTRAS DE PECES Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 02 Fecha : Febrero 2013 Aprobado por: Jefe de Proyecto. 5.3 Toma de muestras de peces Recepcionar las muestras en el centro, de acuerdo al Check List de Recepción de Muestras Preparar la sala de necropsia con todos los materiales necesarios para la toma de muestras Sobre el mesón limpio y previamente desinfectado, extender un trozo de papel y seleccionar el material quirúrgico estéril, de acuerdo al tamaño de las muestras a analizar Pesar (gr) y medir (cm) cada uno de los peces, registrar los datos obtenidos en el registro de muestreo y distribuirlos sobre el papel, ordenados de forma tal que al observarlos, la cabeza y la cola estén a la izquierda y derecha del analista, respectivamente Realizar una descripción macroscópica de las características de la superficie externa del pez, considerando ambos lados, con el fin de observar y registrar la presencia de cualquier anormalidad aparente y visible Luego del examen externo, con material quirúrgico debidamente desinfectado, se realiza una incisión en el pez de tal forma de exponer los órganos internos de éste (ventana de necropsia) El examen de los órganos internos debe describir las anormalidades macroscópicas relevantes como cambios morfológicos, posición y coloración presente en los órganos y tejidos, presencia de fluidos en la cavidad abdominal, cantidad y tipo de contenido gastrointestinal (pellet u otro) mediante la disección del mismo, estado del desarrollo gonadal, indicando si es factible, el sexo Una vez concluido en análisis anatomopatológico, el analista deberá comenzar con el proceso de toma de muestras para el análisis de biología molecular Con ayuda de pinzas y bisturí tomar dos pequeños trozos (máximo 5 mm 3 ) de riñón, bazo, branquias y corazón de cada pez. Depositar uno de los trozos de cada órgano en un tubo Eppendorf con etanol, para usarlo como muestra y el otro trozo de cada órgano en otro tubo con etanol absoluto para guardarlo como contramuestra Solo en el caso de especies salmonídeas provenientes de las zonas de agua de mar y estuario, además de las muestras del punto anterior, de debe tomar un tercer trozo de corazón, que incluya aurícula y ventrículo y depositarlo individualmente en un tubo con formalina al 10% tamponada Una vez realizada la toma de muestras (solo para el caso de las especies salmonídeas), se deben pesar las gónadas y realizar registro fotográfico tanto de éstas, como del contenido estomacal de cada pez (si es que existe contenido) Para evitar contaminación cruzada, las muestras de cada pez deben ser tomadas con material quirúrgico único, el cual debe ser lavado y luego desinfectado inmediatamente, sumergiéndolo 3 a 5 minutos en una solución de Virkon s al 1%, luego 3 a 5 minutos en alcohol 70, para que pueda volver a ser utilizado. 2 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 1.

103 Código: LN Necropsia Procedimiento de Necropsia y Toma de Muestras Página 3 de 3 PROCEDIMIENTO DE NECROPSIA Y TOMA DE MUESTRAS DE PECES Elaborado por: Jefe de Laboratorio. Edición Nº : 02 Fecha : Febrero 2013 Aprobado por: Jefe de Proyecto Finalizada la toma de muestras, se debe lavar y secar cuidadosamente el material quirúrgico Una vez finalizada la toma de muestra de todos los peces, se deben eliminar los restos biológicos dentro de una bolsa y rosear con Deep blue o Mort Green, luego poner la bolsa dentro de una caja termoaislada, sellarla y llevar inmediatamente al vertedero REXIN de Puerto Montt con guía de despacho visada por el Servicio Nacional de Pesca y Acuicultura. De lo contrario la mortalidad debe ser congelada en bolsas plásticas gruesas, debidamente rotuladas con la zona de donde provienen y la fecha de procesamiento, hasta que pueda ser eliminada Finalmente, las cajas con las muestras tomadas se deben mantener a temperatura de refrigeración hasta su derivación (con el respectivo registro de muestreo) al Laboratorio de Biología Molecular en Puerto Montt, para su análisis. 6. Documentación 6.1 Registro de muestreo 6.2 Check list de recepción de muestras 7. Anexos No aplica. 3 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 1.

104

105 A N E X O 2 Protocolo Q-PCR PRV tiempo real.

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107 Código: LBM Pr12 Página 1 de 4 Título: Procedimiento para la Detección de Piscine Reovirus (PRV) mediante QRT-PCR Tiempo Real Elaborado por: Analista de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Noviembre 2012 Aprobado por: Jefe de Laboratorio. 1. Propósito El objetivo de este procedimiento es la detección del Virus Piscine Reovirus (PRV) en especies salmonídeas. 2. Alcance Este procedimiento, es ejecutado por el personal autorizado de IFOP y se aplica a nivel de investigación y diagnóstico de enfermedades. 3. Referencias 3.1 Øyvind Haugland, Aase B. Mikalsen, Pål Nilsen, Karine Lindmo, Beate J. Thu, Trygve M. Eliassen, Norbert Roos, Marit Rode, Øystein Evensen. (2011) Cardiomyopathy syndrome of Atlantic salmon (Salmo salar L.) is caused by a dsrna virus of the Totiviridae family. J. Virol. doi: /jvi LABD/NT3/ Programa de laboratorios de diagnóstico de enfermedades de animales acuáticos. Procedimientos para la validación y control de calidad de los Métodos de reacción en cadena de la Polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en animales acuáticos, Sernapesca. 4. Responsabilidades El Jefe de Laboratorio es responsable de la implementación y actualización de este procedimiento. También es responsable de supervisar su correcta ejecución, revisar los resultados, revisar y/o elaborar el informe final de los resultados y supervisar el envió de los informes vía correo electrónico u otra vía quien solicita dicho análisis de al laboratorio. El analista de laboratorio es el responsable de realizar las actividades de análisis descritas en este procedimiento. 5. Descripción de la actividad 5.1. Equipos y Materiales Coolcube Foils para placas 96 pocillos LC Gradilla tubos 1.5 ml Guantes desechables Micropipetas para 2, 10, 20, 200 y 1000 µl Placas 96 pocillos para LC Puntas 1-10 µl Puntas µl Puntas ul 1 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 2.

108 Código: LBM Pr12 Página 2 de 4 Título: Procedimiento para la Detección de Piscine Reovirus (PRV) mediante QRT-PCR Tiempo Real Elaborado por: Analista de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Noviembre 2012 Aprobado por: Jefe de Laboratorio Termociclador Tiempo Real LightCycler (LC) 480, Roche Tubos tipo Eppendorf ml Centrífuga refrigerada Refrigerador Congelador Bolsas de desechos Gabinete pre-esterilizado con luz UV 5.2. Reactivos Kit LightCycler 480 RNA Master Hydrolysis Probe, Roche Partidor PRV F 10 µm Partidor PRV R 10 µm Sonda PRV 10 µm Agua libre de nucleasas 5.3. Secuencia partidores y sonda Tabla 1. Partidores y sonda utilizados para el análisis de QRT-PCR PRV. PRV Sonda Primer F Primer R Secuencia FAM-5'- GGTGAAATCATCGCCAACTCA -3'-MGB 5'- CCCCATCCCTCACATATGGAT -3' 5'- GGTGAAATCATCGCCAACTCA -3' 5.4. Preparación de las muestras Cuantificar el RNA extraído mediante la medición de absorbancia a 260nm y la pureza de la extracción mediante el cálculo de la razón 260/ Realizar la preparación del Mix de reacción bajo cámara de flujo, con material estéril y micropipetas exclusivas del área Preparar el mix de reacción según Tabla 2. Multiplicar los volúmenes por el número de muestras y además considerar un tubo más para control positivo y uno para control negativo. 2 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 2.

109 Código: LBM Pr12 Página 3 de 4 Título: Procedimiento para la Detección de Piscine Reovirus (PRV) mediante QRT-PCR Tiempo Real Elaborado por: Analista de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Noviembre 2012 Aprobado por: Jefe de Laboratorio. Tabla 2. Preparación de Mix para el Kit LightCycler 480 RNA Master Hydrolysis Probe, Roche. Reactivo Volumen para una reacción 10 ul H20, grado PCR 3,5 ul Primer F 0,25 ul Primer R 0,25 ul Sonda TM 0,15 ul LightCycler 480 RNA Master Hydrolysis (vial 1) 3,7 ul Activator 0,65 ul Enhancer 0,5 ul TOTAL 9 ul Mezclar bien, repartir el Mix en los pocillos de la placa de 96, según volumen total calculado y agregar 1 µl de la muestra de DNA por pocillo de reacción, más un pocillo con 1 µl de control positivo de PCR y otro pocillo con 1µl de control negativo de PCR (agua libre de nucleasas + mix de reacción). Realizar todo este proceso bajo gabinete, manteniendo la cadena de frío Colocar la placa con las muestras en el termociclador LC 480 Roche y realizar la corrida, según condiciones de PCR Tabla 3. Tabla 3. Programa utilizado para el QRT-PCR PRV en el equipo Lightcycler 480 (Roche). Proceso Tiempo Temperatura Rampla Tº Modo Adquisición Ciclos TRANSCRIPCION REVERSA 3 min 60 C 20º/seg (4.4*) none none 1 DENATURACIÓN 30 seg 95ºC 20º/seg (4.4*) none none 1 Denaturación 5 seg 95ºC 20º/seg (4.4*) none Annealing 1 min 60ºC 20º/seg (2.2*) Quantification none 45 Extensión 10 seg 72ºC 20º/seg (4.4*) single ENFRIAMIENTO 30 seg 40ºC 20º/seg (1.5*) none none 1 3 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 2.

110 Código: LBM Pr12 Página 4 de 4 Título: Procedimiento para la Detección de Piscine Reovirus (PRV) mediante QRT-PCR Tiempo Real Elaborado por: Analista de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Noviembre 2012 Aprobado por: Jefe de Laboratorio. 5.5 Interpretación de los Resultados: Una vez terminada la corrida en el equipo, se observarán en la pantalla las curvas de amplificación para cada una de las muestras Se considerará como resultado positivo a aquellas muestras que posean un valor de Cp menor a 40, con una curva de amplificación sigmoidea clara. Se considerara negativa si no presenta valor de Cp o no presenta una curva de amplificación sigmoidea clara Control de calidad Se ha establecido que todas las muestras de RNA deben ser cuantificadas previamente al desarrollo del PCR de manera de siempre utilizar como mínimo 10 ng para cada reacción Los resultados deben ser uniformes en relación a la expresión del gen reportero en las distintas muestras para cada tejido Cada reacción será comparada con su respectivo control positivo y control negativo En caso de existir amplificación de los controles negativos, los reactivos deben ser chequeados y las reacciones repetidas posteriormente Cada resultado positivo será verificado mediante secuenciación. 6. Documentación 6.1 Planilla de trabajo de Laboratorio 6.2 Informe de Resultados 7. Anexos No aplica. 4 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 2.

111 A N E X O 3 Protocolo Q-PCR BKD tiempo real.

112

113 Código: LBM Pr13 Página 1 de 4 Título: Procedimiento para la Detección de Renibacterium salmoninarum mediante Q-PCR Tiempo Real Elaborado por: Analista de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Noviembre 2012 Aprobado por: Jefe de Laboratorio. 1. Propósito El objetivo de este procedimiento es la detección de la bacteria Renibacterium salmoninarum en especies salmonídeas y no salmonídeas. 2. Alcance Este procedimiento, es ejecutado por el personal autorizado de IFOP y se aplica a nivel de investigación y diagnóstico de enfermedades. 3. Referencias 3.1 Dorothy M. Chase, Diane G. Elliott, Ronald J. Pascho, (2006).Detection and quantification of Renibacterium salmoninarum DNA in salmonid tissues by real-time quantitative polymerase chain reaction analysis. J Vet Diagn Invest 18: LABD/NT3/ Programa de laboratorios de diagnóstico de enfermedades de animales acuáticos. Procedimientos para la validación y control de calidad de los Métodos de reacción en cadena de la Polimerasa utilizados para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en animales acuáticos, Sernapesca. 4. Responsabilidades El Jefe de Laboratorio es responsable de la implementación y actualización de este procedimiento. También es responsable de supervisar su correcta ejecución, revisar los resultados, revisar y/o elaborar el informe final de los resultados y supervisar él envió de los informes vía correo electrónico u otra vía quien solicita dicho análisis de al laboratorio. El analista de laboratorio es el responsable de realizar las actividades de análisis descritas en este procedimiento. 5. Descripción de la actividad 5.1. Equipos y Materiales Coolcube Foils para placas 96 pocillos LC Gradilla tubos 1.5 ml Guantes desechables Micropipetas para 2, 10, 20, 200 y 1000 µl Placas 96 pocillos para LC Puntas 1-10 µl 1 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 3.

114 Código: LBM Pr13 Página 2 de 4 Título: Procedimiento para la Detección de Renibacterium salmoninarum mediante Q-PCR Tiempo Real Elaborado por: Analista de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Noviembre 2012 Aprobado por: Jefe de Laboratorio Puntas µl Puntas ul Termociclador Tiempo Real LightCycler (LC) 480, Roche Tubos tipo Eppendorf ml Centrífuga refrigerada Refrigerador Congelador Bolsas de desechos Gabinete pre-esterilizado con luz UV 5.2. Reactivos Kit LightCycler 480 Probe Master, Roche Partidor BKD F 20 µm Partidor BKD R 20 µm Sonda BKD TM 10 µm Agua libre de nucleasas 5.3. Secuencia partidores y sonda Tabla 1. BKD Sonda Primer F Primer R Partidores y sonda utilizados para el análisis de Q-PCR BKD. Secuencia FAM-5'-CACCAGATGGAGCAAC3'-MGB 5'- GTGACCAACACCCAGATATCCA-3' 5'- TCGCCAGACCACCATTTACC-3' 5.4. Preparación de las muestras Cuantificar el DNA extraído mediante la medición de absorbancia a 260nm y la pureza de la extracción mediante el cálculo de la razón 260/ Realizar la preparación del Mix de reacción bajo cámara de flujo, con material estéril y micropipetas exclusivas del área Preparar el mix de reacción según Tabla 2. Multiplicar los volúmenes por el número de muestras y además considerar un tubo más para control positivo y uno para control negativo. 2 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 3.

115 Código: LBM Pr13 Página 3 de 4 Título: Procedimiento para la Detección de Renibacterium salmoninarum mediante Q-PCR Tiempo Real Elaborado por: Analista de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Noviembre 2012 Aprobado por: Jefe de Laboratorio. Tabla 2. Preparación de Mix para el Kit LightCycler 480 Probe Master (Roche). Reactivo Volumen para una reacción 10 ul H20, grado PCR 3,4 ul Primer F 0,25 ul Primer R 0,25 ul Sonda TM 0,15 ul LightCycler 480 Master Probe (vial 1) 5,0 ul TOTAL 9 ul Mezclar bien, repartir el mix en los pocillos de la placa de 96, según volumen total calculado y agregar 1 µl de la muestra de DNA por pocillo de reacción, más un pocillo con 1 µl de control positivo de PCR y otro pocillo con 1 µl de control negativo de PCR (agua libre de nucleasas + mix de reacción). Realizar todo este proceso bajo gabinete, manteniendo la cadena de frío Colocar la placa con las muestras en el termociclador LC 480 Roche y realizar la corrida, según condiciones de PCR Tabla 3. Tabla 3. Programa utilizado para el Q-PCR BKD en el equipo Lightcycler 480 (Roche). Proceso Tiempo Temperatura Rampla Tº Modo Adquisición Ciclos DENATURACIÓN 10 min 95ºC 20º/seg (4.4*) none none 1 AMPLIFICACION quatification 45 Denaturación 10 seg 95ºC 20º/seg (4.4*) none Annealing 30 seg 60ºC 20º/seg (2.2*) none Extensión 0,1 seg 72ºC 20º/seg (4.4*) single ENFRIAMIENTO 30 seg 40ºC 20º/seg (1.5*) none none Interpretación de los Resultados: Una vez terminada la corrida en el equipo, se observarán en la pantalla las curvas de amplificación para cada una de las muestras Se considerará como resultado positivo a aquellas muestras que posean un valor de Cp menor a 40, con una curva de amplificación sigmoidea clara. Se considerara negativa si no presenta valor de Cp o no presenta una curva de amplificación sigmoidea clara. 3 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 3.

116 Código: LBM Pr13 Página 4 de 4 Título: Procedimiento para la Detección de Renibacterium salmoninarum mediante Q-PCR Tiempo Real Elaborado por: Analista de Laboratorio. Edición Nº : 01 Fecha : Noviembre 2012 Aprobado por: Jefe de Laboratorio Control de calidad Se ha establecido que todas las muestras de DNA deben ser cuantificadas previamente al desarrollo del PCR de manera de siempre utilizar como mínimo 10 ng para cada reacción Los resultados deben ser uniformes en relación a la expresión del gen reportero en las distintas muestras para cada tejido Cada reacción será comparada con su respectivo control positivo y control negativo En caso de existir amplificación de los controles negativos, los reactivos deben ser chequeados y las reacciones repetidas posteriormente Cada resultado positivo será verificado mediante secuenciación. 6. Documentación 6.1 Planilla de trabajo de Laboratorio 6.2 Informe de Resultados 7. Anexos No aplica. 4 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 3.

117 A N E X O 4 Informe de secuenciación y alineamientos.

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119 Secuencias, alineamientos y porcentaje de identidad realizado en NCBI (National Center for Biotechnology Information) a muestras positivas a Piscirickettsia salmonis 1 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 4.

120

121 Zona N Muestra Tabla 1. Alineamiento de secuencias de muestras positivas a Piscirickettsia salmonis. Especie Secuencia Alineamiento CN 7 Róbalo GGTGTTGAGTGGCGACGTCAG TCATCATGGCCCTTACGACCA GGGCTACACACGTGCTACAAT GGGGCGTACAGACGGAGGCG AAGCAGCGATGTGGAGCGAAC CTGAGAAAGCGCCTCGTAGTA CN 31 Róbalo CCCCCTGCTGCGACGTCAGTC ATCATGGCCCTTACGACCAGG GACTACACACGTGCTACAATG GGGCGTACAGACGGAGGCGA AGCAGCGATGTGGAGCGAACC TGAGAAAGCGCCTCGTAGTAA CTG 2 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 4.

122 EV 1 Pejerrey GGGGAGGTGGGCGAGTCAGT CATCATGGCCCTTACGACCAG GGCTACACACGTGCTACAATG GGGCGTACAGACGGAGGCGA AGCAGCGATGTGGAGCGAACC TGAGAAAGCGCCTCGTAGTAA TGTA EV 82 Róbalo CGGCGTGGGCGAGTCAGTCAT CATGGCCCTTACGACCAGGGC TACACACGTGCTACAATGGGG CGTACAGACGGAGGCGAAGCA GCGATGTGGAGCGAACCTGAG AAAGCGCCTCGTAGTAATGTT 3 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 4.

123 Zona N Muestra Especie Secuencia Alineamiento EV 124 Róbalo CGTGTTGGGAGCGACGTCAGT CATCATGGCCCTTACGACCAG GGCTACACACGTGCTACAATG GGGCGTACAGACGGAGGCGA AGCAGCGATGTGGAGCGAACC TGAGAAAGCGCCTCGTAGT EV 153 Róbalo CGTGTGCTCATCGACGGTCAG GTCATCATGGGCCCTTACGAC CAGGGCTACACACGTGCTACA ATGGGCCCTTACAAGAGCGGA GGCGAAGCAGCGATGTGGAG CGAACCTGTGAAGCGCCTCGT AGTAGCCGTGTGTAGTCCTGT TCGTACGGTCATGATGACTTG ACGTAATTCAGAAGAGTGGCG GAGTCTCCTACTAGTGGGCGT CTTCTCCGCTGTTCTT 4 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 4.

124 Zona N Muestra Especie Secuencia Alineamiento M1 2 Róbalo CCGGCGGTGGGGCGACGTCA GTCATCATGGCCCTTACGACC AGGGCTACACACGTGCTACAA TGGGGCGTACAGACGGAGGC GAAGCAGCGATGTGGAGCGAA CCTGAGAAAGCGCCTCGTAGT AGGT M1 4 Róbalo GTTTTTCCCTTTGTGGGAGATG CCTCATCATGGCCCTTACGAC CAGGGCTACACACGTGCTACA ATGGGGCGTACAGACTTGAGG CGAAGCAGCGATGTGGAGCGA ACCTGAGAAAGCGCCTCGTAG TAGC 5 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 4.

125 Zona N Muestra Especie Secuencia Alineamiento M4 23 Róbalo CGGGGGTGGGCGAGTCAGTC ATCATGGCCCTTACGACCAGG GCTACACACGTGCTACAATGG GGCGTACAGACGGAGGCGAA GCAGCGATGTGGAGCGAACCT GAGAAAGCGCCTCGTAGTAAT TT M4 25 Róbalo CGGGAGTGGCGAGTCAGTCAT CATGGCCCCTACGACCAGGGC TACACACGTGCTACAATGGGG CGTACAGACGGAGGCGAAGCA GCGATGTGGAGCGAACCTGAG AAAGCGCCTCGTAGTAA 6 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 4.

126 Zona N Muestra Especie Secuencia Alineamiento M4 28 Róbalo CGGGGTGGGGCGAGTCAGTC ATCATGGCCCTTACGACCAGG GCTACACACGTGCTACAATGG GGCGTACAGACGGAGGCGAA GCAGCGATGTGGAGCGAACCT GAGAAAGCGCCTCGTAGTAAC TC M4 31 Róbalo GCCCGGGTTGGTGGGAGAGT CAGTTCATCATGGCCCTTACG ACCAGGGCTACACACGTGCTA CAATGGGGCGTACAGACGGAG GCGAAGCAGCGATGTGGAGC GAACCTGAGAAAGCGCCTCGT AGTATATAT 7 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 4.

127 Zona N Muestra Especie Secuencia Alineamiento M3 26 Pejerrey GCCCCATGGCGAGTCAGTCAT CATGGCCCTTACGACCAGGGC TACACACGTGCTACAATGGGG CGTACAGACGGAGGCGAAGCA GCGATGTGGAGCGAACCTGAG AAAGCGCCTCGTAGTAATTT M3 40 Pejerrey GGTGGGTGGGCGAGTCAGTC ATCATGGCCCTTACGACCAGG GCTACACACGTGCTACAATGG GGCGTACAGACGGAGGCGAA GCAGCGATGTGGAGCGAACCT GAGAAAGCGCCTCGTAGTAA 8 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 4.

128 Zona N Muestra Especie Secuencia Alineamiento FA 25 Róbalo GGTGGGGGTGGGCGAGTCAG TCATCATGGCCCTTACGACCA GGGCTACACACGTGCTACAAT GGGGCGTACAGACGGAGGCG AAGCAGCGATGTGGAGCGAAC CTGAGAAAGCGCCTCGTAGTA FA 28 Róbalo TGGGGTGTGGCGAGTCAGTCA TCATGGCCCTTACGACCAGGG CTACACACGTGCTACAATGGG GCGTACAGACGGAGGCGAAG CAGCGATGTGGAGCGAACCTG AGAAAGCGCCTCGTAGTA 9 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 4.

129 Zona N Muestra Especie Secuencia Alineamiento FA 31 Róbalo GGTCCTTTCGCGAGTCAGTCA TCATGGCCCTTACGACCAGGG CTACACACGTGCTACAATGGG GCGTACAGACGGAGGCGAAG CAGCGATGTGGAGCGAACCTG AGAAAGCGCCTCGTAGTATTT FA 33 Róbalo CCGGGGGTGGGCGAGTCAGT CATCATGGCCCTTACGACCAG GGCTACACACGTGCTACAATG GGGCGTACAGACGGAGGCGA AGCAGCGATGTGGAGCGAACC TGAGAAAGCGCCTCGTAGTAA CCTTT 10 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 4.

130 Zona N Muestra Especie Secuencia Alineamiento FA 37 Róbalo GTGGGGTTGGGAGAGTCAGTC ATCATGGCCCTTACGACCAGG GCCACACACGTGCTACAATGG GGCGTACAGACGGAGGCGAA GCAGCGATGTGGAGCGAACCT GAGAAAGCGCCTCGTAGTACA A FA 58 Róbalo CCGGGGTGGGCGAGTCAGTC ATCATGGCCCTTACGACCAGG GCTACACACGTGCTACAATGG GGCGTACAGACGGAGGCGAA GCAGCGATGTGGAGCGAACCT GAGAAAGCGCCTCGTAGTAAT TTCA 11 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 4.

131 Zona N Muestra Especie Secuencia Alineamiento FA 75 Róbalo TGTGGGTGGCGAGTCAGTCAT CATGGCCCTTACGACCAGGGC TACACACGTGCTACAATGGGG CGTACAGACGGAGGCGAAGCA GCGATGTGGAGCGAACCTGAG AAAGCGCCTCGTAGTA 12 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 4.

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133 A N E X O 5 Presentación panel de expertos.

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135 1 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 5.

136 2 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 5.

137 3 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 5.

138 4 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 5.

139 A N E X O 6 Encuesta a expertos y árbol de decisión.

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141 REUNIÓN PANEL DE EXPERTOS: PROYECTO ASIPA 2012 Evaluación y seguimiento de la situación sanitaria de especies silvestres en agua dulce y mar PROPÓSITO El propósito de este panel de expertos, es poder recabar información referente a la probabilidad de ocurrencia de los procesos que están involucrados y que son necesarios y relevantes en la transmisión de Enfermedades de Alto Riesgo (EAR) entre poblaciones de peces silvestres/asilvestrados, hacia salmones de cultivo. Esto debido a que no ha sido posible obtener información acerca de ciertos puntos dentro del proceso de transmisión, que son relevantes para el cálculo del riesgo final. La obtención de estos parámetros permitirá hacer una estimación más precisa del riesgo de transmisión de estas enfermedades entre las poblaciones de peces anteriormente descritas, colaborando y apoyando de esta manera a través de la gestión y comunicación de riesgo, la elaboración de programas de vigilancia de mayor efectividad. 1 CONVENIO SUBPESCA: ASESORÍA INTEGRAL PARA LA TOMA DE DECISIONES EN PESCA Y ACUICULTURA, 2012 INFORME FINAL - EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR. ANEXO 6.

142 ENCUESTA A PANEL DE EXPERTOS Para llevar a cabo el proceso de recopilación de información por medio de este formulario, es necesario detallar y recordar ciertos conceptos para facilitar la obtención de sus respuestas en calidad de expertos. Enfermedad de alto riesgo (EAR): desviación del estado completo de bienestar físico de un organismo, que involucra un conjunto bien definido de signos y etiología, que conduce a una grave limitante de sus funciones normales, asociada a altas mortalidades y de carácter transmisible a organismos de la misma u otras especies. Pez silvestre: corresponde a cualquier pez de las especies que se pueden capturar en torno a un centro de cultivo, como las encontradas en las Pescas de Investigación de este proyecto: Chancharro, Merluza Austral, Peladilla, Perca, Pejerrey, Róbalo, Rollizo, Trucha fario, Trucha café. Pez asilvestrado: corresponde a una especie de salmónido que habita fuera de las balsas jaulas, los cuales incluye al salmón coho, salmón del Atlántico, trucha arcoíris, salmón Chinook. En base a la información proporcionada previamente y teniendo claro los procesos mediante los cuales la transmisión de una EAR (Piscirickettsia salmonis) desde peces silvestres/asilvestrados podría llevarse a cabo hacia peces de centros de cultivo y apelando a su experiencia como profesional en temas referentes a esta área, se le pide contestar 3 cifras por pregunta: a) un posible valor mínimo b) un valor más probable c) un posible valor máximo 1.- Cuál es la probabilidad de que un pez silvestre infectado con Piscirickettsia salmonis libere el agente al medio acuático? Mínima Más probable. Máxima 2 CONVENIO SUBPESCA: ASESORÍA INTEGRAL PARA LA TOMA DE DECISIONES EN PESCA Y ACUICULTURA, 2012 INFORME FINAL - EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR. ANEXO 6.

143 2.- Si existe presencia de un pez, silvestre o asilvestrado, infectado con Piscirickettsia salmonis en las cercanías de un centro de cultivo de salmónidos (perímetro 10 km), cuál es la probabilidad de contacto con la población de peces de cultivo? Mínima Más probable. Máxima 3.- Si un pez infectado (silvestre o asilvestrado) libera Piscirickettsia salmonis en la proximidad (10 km) de un centro de cultivo de salmónidos y entra en contacto con este qué tan probable es que se infecten salmónidos del centro de cultivo? Mínima Más probable. Máxima 4.- Si se toma en cuenta que un pez silvestre/asilvestrado libera Piscirickettsia salmonis al medio y este individuo es capaz de entrar en contacto con los individuos presentes en un centro de cultivo Cuál es el número de peces infectados en el centro de cultivo? Mínima Más probable. Máxima 5.- Considerando la presencia de un brote de Piscirickettsia salmonis en un centro de cultivo originado a partir de una especie silvestre/asilvestrado Cuál sería el porcentaje de mortalidad mensual esperado para ese centro de cultivo? Mínima Más probable. Máxima 3 CONVENIO SUBPESCA: ASESORÍA INTEGRAL PARA LA TOMA DE DECISIONES EN PESCA Y ACUICULTURA, 2012 INFORME FINAL - EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR. ANEXO 6.

144 ÁRBOL DE DECISIÓN 4 CONVENIO SUBPESCA: ASESORÍA INTEGRAL PARA LA TOMA DE DECISIONES EN PESCA Y ACUICULTURA, 2012 INFORME FINAL - EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR. ANEXO 6.

145 A N E X O 7 Protocolo estudio desafío por cohabitación.

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147 PROTOCOLO ESTUDIO DE DESAFÍO POR COHABITACIÓN CON EL PATÓGENO Piscirickettsia salmonis EN RÓBALOS Y TRUCHAS ARCOÍRIS EN CONDICIONES CONTROLADAS 1 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 7.

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149 OBJETIVOS Determinar la transmisión bidireccional de la infección por inoculación experimental y cohabitación entre truchas y róbalos (Criterio B de OIE, 2012). Detectar y cuantificar la presencia (Criterio A de OIE, 2012) de Piscirickettsia salmonis en riñón y bazo de trucha arcoiris y róbalos infectados experimentalmente en forma invasiva y por cohabitación mediante PCR. Aislar Piscirickettsia salmonis desde truchas y róbalo a partir de tejido renal u otro que presente lesiones a la necropsia (Criterio C de OIE, 2012). Describir la anatomopatología del cuadro de piscirickettsiosis (Criterio D de OIE, 2012) y distribución del agente causal (Criterio E de OIE, 2012) en tejidos de Eleginops maclovinus. INTRODUCCIÓN El desarrollo de la acuicultura en base a la introducción de especies de peces salmónidos ha generado diversos cambios en las relaciones ecológicas lacustres y marinas de las regiones en las cuales se desarrolla esta actividad, con resultados inciertos tanto para las especies cultivadas, así como las especies acuáticas nativas. Factores como el aumento en la concentración de animales y la disponibilidad de alimento en las cercanías de los centros de cultivo, escapes de salmónidos desde unidades de cultivo, accidentes climáticos y sismológicos (Sepúlveda et al., 2009), pueden favorecer las interacciones entre peces cultivados y peces de vida libre, lo cual favorece las posibilidades de transmisión de agentes infecciosos entre ellos. La piscirickettsiosis en Chile es una enfermedad importante en el cultivo de peces salmónidos, y dado el hecho de que se ha detectado Piscirickettsia salmonis en órganos de peces de vida libre (IFOP, 2012), es importante verificar si existe transmisión desde la especie de vida libre y nativa Eleginops maclovinus a peces salmonídeos. MATERIALES Y MÉTODOS Peces El uso de los animales para experimentación científica se realizará de acuerdo a las Normas para la utilización de animales en investigación de la Universidad Austral de Chile. Los peces de vida libre de la especie róbalo, Eleginops maclovinus, serán capturados vivos en el sector Manao Norte ( ,47 S ,95 O, (referencia aproximada) por medio de redes de enmalle, seleccionando 120 individuos de 150 g aproximadamente. Los peces serán trasladados en estanques contenedores de fibra de vidrio con difusores de oxígeno hasta el Centro de Maricultura Hueihue (CMH) del Instituto de Fomento Pesquero (IFOP) en la localidad de Manao [ ,61 S ,52 O, (referencia aproximada), instalaciones de piscicultura de flujo abierto, la que cuenta con sistema de desinfección de efluentes y afluentes y una temperatura estimada promedio 10 C 2 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 7.

150 durante el periodo de otoño, en que se desarrollará el ensayo y con una salinidad promedio de 30 ppm. Se capturará un total de 120 ejemplares, de los cuáles se tomará una muestra de 9 ejemplares se agruparan en pooles de 3 muestras de riñón, bazo, corazón y branquias, para análisis por PCR e IFAT, a fin de verificar que se encuentren libres de patógenos tales como ISAV, Piscirickettsia salmonis e IPNV. Durante el período de aclimatación de 7 días, los peces serán dispuestos en estanques de 1 m 3, mantenidos con alimento comercial para salmónidos. Truchas arcoiris (Oncorhynchus mykiss), no vacunadas contra P.salmonis, de 150 g se adquirirán desde la empresa Salmones Antártica S.A y serán trasladadas al CMH. A las truchas se les suministrará alimento calibre 4 dieta estándar comercial, mientras que al grupo de róbalos se les entregará alimento natural correspondiendo a mitílidos. Ambas especies se aclimatarán por un período de 7-14 días. Las muestras provenientes de la totalidad de los peces, serán analizados en el laboratorio de Biotecnología de organismos acuáticos de la Universidad Austral de Chile para análisis por PCR e IFAT a fin de verificar que se encuentren libres de patógenos tales como ISAV, Piscirickettsia salmonis e IPNV. Aislado bacteriano Se utilizará una cepa de P.salmonis proveniente del Instituto de Bioquímica de la Facultad de Ciencias, de la Universidad Austral de Chile en Valdivia. El agente es genómicamente similar al detectado en róbalo durante estudios de IFOP (2012) correspondiendo a la cepa IRD -99 y posee una DL50 conocida. DISEÑO EXPERIMENTAL El modelo de desafío por cohabitación se desarrollará según el siguiente esquema de trabajo: Se utilizará una densidad de cultivo de aproximadamente 7 Kg/m 3 la que podrá variar hasta un máximo de 15 Kg por metro cúbico en función de los pesos de los róbalos capturados por pesca de investigación. El estudio se realizará en triplicado para los grupos experimentales G1 y G2 y en duplicado para los grupos control G3 y G4. 3 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 7.

151 G1: Considera la incorporación de 15 ejemplares de róbalo (troyanos) inyectados intraperitonealmente con un inóculo de Piscirickettsia salmonis de patogenicidad conocida, previamente titulado, en un volumen de 0,2 ml de inóculo, a un estanque que contiene 15 ejemplares de trucha arcoiris no inoculadas (cohabitantes). G2: Considera la incorporación de 15 ejemplares de trucha arcoiris (troyanos) inyectadas intraperitonealmente con un inóculo de Piscirickettsia salmonis de patogenicidad conocida, previamente titulado, en un volumen de 0,2 ml de inóculo, a un estanque que contiene 15 ejemplares de róbalo no inoculados (cohabitantes). G3 (control negativo): Considera la incorporación de 15 ejemplares de róbalo y 15 ejemplares de trucha arcoiris, ambos inoculados con 0,2 ml de suero fisiológico estéril. G4 (control positivo): Considera la incorporación de 15 ejemplares de trucha arcoiris (troyanos) inyectadas intraperitonealmente con un inóculo de Piscirickettsia salmonis de patogenicidad conocida, previamente titulado, en un volumen de 0,2 ml de inóculo, a un estanque que contiene 15 ejemplares de trucha arcoiris no inoculadas (cohabitantes). El estanque será separado por una malla pecera que atravesará el diámetro de la circunferencia del estanque dividiéndolo en 2 partes iguales. Una mitad contendrá a los 15 róbalos y la segunda mitad las 15 truchas. Los grupos experimentales se mantendrán por un período de 30 a 45 días con disponibilidad de alimento estándar comercial calibre 4 ad libitum y serán alimentados 2 veces al día a una tasa de consumo de alimento de 1.4% de su peso vivo. El esquema del diseño experimental se detalla en la Figura 1. Las mortalidades o peces moribundos serán retirados al menos 3 veces al día y serán evaluados por medio de necropsia, siembra de placas con medio de cultivo selectivo para P.salmonis, para realizar aislamiento de Piscirickettsia salmonis desde muestras de riñón y bazo. En caso de no producirse mortalidad de los cohabitantes, se analizará a la totalidad de los peces por medio de análisis anatomopatológico, se realizará inmunofluorescencia e inmunohistoquímica en muestras de riñón y bazo y RT-PCR para confirmar la presencia o ausencia del patógeno inoculado. 4 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 7.

152 PCR Piscirickettsia salmonis Posterior a la toma de muestras para aislamiento bacteriano se tomarán muestras de riñón y bazo, las que serán analizadas en pool de órganos por medio de la metodología de RT-PCR en tiempo real para la detección de Piscirickettsia salmonis (Karatas et al., 2008), en el Laboratorio de Biotecnología de organismos acuáticos de la Universidad Austral de Chile. Figura 1. Diseño experimental. Esquema de distribución y número de individuos por estanque en ensayo de inoculación experimental. Texto en rojo corresponde a peces "troyanos". Cuantificación de microorganismos en órganos Para cuantificar la multiplicación del agente en la muestra de órganos de los peces, se realizarán análisis mediante la técnica de qpcr-piscirickettsia salmonis en el laboratorio de Biotecnología de organismos acuáticos de la Universidad Austral de Chile, procedimiento que debe aplicarse en aquellos individuos en los cuales se verificó un cuadro infeccioso mediante características anatomopatológicas. Análisis histológico e inmunohistoquímico Muestras de branquias, corazón, riñón anterior y posterior, intestino, encéfalo, bazo e hígado serán fijadas en formalina tamponada 10%. Las muestras se fijarán por un período mínimo de 48 hrs y posteriormente se procesarán mediante técnica histológica de rutina, con inclusión en parafina, cortes de 5 µm de espesor y tinción con hematoxilina-eosina (H&E), además de Giemsa adicional en el caso de lesiones sospechosas en tinción H&E. En cortes de espesor similar, se eliminará la actividad de peroxidasa endógena y los tejidos se incubarán con un anticuerpo monoclonal o policlonal anti-p. salmonis, para luego de un lavado, incubarlos con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa. Posteriormente los tejidos serán expuestos a un cromógeno para 5 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 7.

153 inspección al microscopio de luz (OIE, 2003). Los análisis serán ejecutados en el Laboratorio de Biotecnología de organismos acuáticos de la Universidad Austral de Chile. Invalidación del estudio Se pondrá fin a las pruebas en cualquier momento en caso de que exista la muerte de más del 60% de los peces en un sólo día. Este término temprano se realizará mediante el traslado de los peces a estanques que contengan una sobredosis de anestésico (> 250 mg/l de benzocaína clorhidrato). Se enviarán muestras para análisis de patógenos u otra presunta causa. El estudio a su vez será invalidado en el caso que se observe una mayor mortalidad en los grupos controles sin desafío que en los tratamientos desafiados, que no sea atribuible a manejos homogéneamente realizados a los grupos como la inyección. El término temprano se realizará mediante el traslado de los peces a estanques que contengan una sobredosis de anestésico (> 250 mg/l de benzocaína clorhidrato). Se enviarán muestras para análisis de patógenos u otra presunta causa. Registros y análisis estadístico La información de observaciones diarias se registrará de acuerdo a la Tabla 1 en tanto que los resultados de sobrevivencia de los grupos experimentales serán registrados utilizando el formato de la Tabla 2. Los resultados de los análisis de laboratorio aplicados serán registrados utilizando el formato presentado en la Tabla 3. Tabla 1. Tabla de registros de observaciones diarias y de toma de muestras en peces moribundos o de mortalidad. Día N Estanque N Pez N Peso (g) Long (cm) Especie Moribundo o Mortalidad Observaciones macroscópicas Cultivo Bacteriológico Muestra PCR Ps Muestra Histología INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 7.

154 Tabla 2. Tabla de contingencia de sobrevivencia de peces en relación con la condición de Inoculado o Cohabitante para cada una de las especies de peces. ESPECIE Trucha Róbalo TRATAMIENTO Inoculado Cohabitante Control SUBTOTAL Inoculado Cohabitante Control SUBTOTAL TOTAL Moribundo o mortalidad Sobreviviente TOTAL Tabla 3. Tabla de contingencia de resultados de análisis de laboratorio en relación con la condición de Inoculado o Cohabitante de cada una de las especies de peces. ESPECIE TRATAMIENTO Órgano Lesiones Macroscópicas Lesiones Histológicas IHQ P.salmonis Cultivo bacteriológico RT PCR P.salmonis Subtotal Total Riñón Hígado Inoculado Bazo Riñón Hígado Cohabitante Bazo Riñón Hígado Trucha Control Bazo Riñón Hígado Inoculado Bazo Riñón Hígado Cohabitante Bazo Riñón Hígado Róbalo Control Bazo 7 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 7.

155 Se analizará la dependencia entre variables cualitativas utilizando el estadístico X 2 (Chi-cuadrado), con un valor de confianza del 95% y un valor de p 0,05, para evaluar si los niveles de las variables cualitativas influyen en los niveles de la variable nominal analizada. La hipótesis nula a contrastar será la de independencia entre los factores, en tanto la hipótesis alternativa es la de dependencia entre ellos. PLAN DE TRABAJO ITEM Colección y adaptación de peces Preparado de aislado bacteriano Inoculación experimental Análisis de laboratorio Análisis de resultados Informe final MESES REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Instituto de Fomento Pesquero, Evaluación y seguimiento de la situación sanitaria de especies silvestres en agua dulce y mar - Informe final. Puerto Montt. Karatas, S., J Mikalsen, TM Steinum, T Taksdal, M Bordevik, DJ Colquhoun Real time PCR detection of Piscirickettsia salmonis from formalin-fixed paraffin-embedded tissues. J. of Fish Dis. 31: Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos, Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), Report of the Meeting of the OIE Aquatic Animal Health Standards Commission. Paris, 5 9 March Sepúlveda, M; F. Farías y E. Soto Escapes de salmones en Chile. Eventos, impactos, mitigación y prevención. Valdivia, Chile: WWF. 8 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 7.

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157 A N E X O 8 Resultados del estudio (documento borrador).

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159 Evaluación y seguimiento de la situación sanitaria de especies silvestres en agua dulce y mar Instituto de Fomento Pesquero; Subsecretaría de Pesca y Acuicultura. Introducción El rol de las especies silvestres como reservorio y vectores de transmisión de enfermedades a los animales de producción es un tema discutido ampliamente. Tras la crisis sanitaria producida en la industria del salmón en el sur de Chile, ocasionada por el patógeno ISAv, implicó cambios respecto de la vigilancia sanitaria que llevaba hasta ese entonces, la Autoridad sectorial. El presente trabajo tuvo por objetivo establecer una vigilancia de las Enfermedades de Alto Riesgo (EAR) en peces silvestres de cuerpos de agua lacustres, estuarinos y marinos de las regiones donde se han establecido las producciones de peces salmonídeos a nivel industrial (La Araucanía, Los Ríos, Los Lagos, Aysén y Magallanes). La iniciativa consideró la evaluación de especies tanto salmonídeas como no salmonídeas, respecto de la detección de agentes patógenos virales y bacterianos, tanto exóticos como endémicos de nuestro país, con la finalidad de generar antecedentes respecto de posibles relaciones en la presentación de patologías relevantes en especies salmonídeas en cultivo y el rol de las especies silvestres o asilvestradas en su presentación. Materiales y métodos Se ejecutaron actividades de pesca de investigación, autorizada por medio de Resolución Exenta N 2549/2012, en 29 zonas de muestreo de interés, de las regiones de La Araucanía, Los Ríos, Los Lagos, Aysén y Magallanes (Tabla 1). Una vez que los ejemplares fueron capturados en las zonas de muestreo, se trasladaron al Laboratorio de Necropsia del Instituto de Fomento Pesquero, donde cada uno de los ejemplares se les efectuó un muestreo biológico registrando los pesos y longitudes de los peces, luego se realizó la necropsia enfocada a describir anomalías en base a comparación de los ejemplares observados en cada muestreo. De cada pez se extrajeron por separado una muestra de aproximadamente 0,5 centímetros cúbicos de cada uno de los órganos: riñón, corazón, branquias y bazo, los cuales en conjunto constituyeron un pool de órganos, los que fueron preservadas en etanol 90%. El análisis de las muestras, se realizó mediante la técnica de RT PCR y PCR en tiempo real. El material genético fue extraído utilizando kits comerciales y el análisis molecular se realizó en dependencias del Instituto de Fomento Pesquero, Puerto Montt. Los patógenos analizados fueron, ISAv, Alfavirus, IHNv, VHSv, OMv, EHNv, PRV, IPNv P. salmonis, F. psychrophilum y R. salmoninarum. Para cada muestra se incorporó un control interno o housekeeping gene. 1 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 8.

160 Tabla 1. Zonas de muestreo y códigos asignados Zona de muestreo Fiordo Aysén Estuario de Valdivia y Río Valdivia Macrozona 1 (Estuario y Seno de Reloncaví) Macrozona 5 (Hornopirén y Fiordo Comau) Macrozona 2 (Chiloé Norte) Macrozona 4 (Chiloé Sur) Macrozona 3 (Chiloé Central) Macrozona 6 (Melinka y Guaitecas norte) Macrozona 7 (Guaitecas Sur, Fiordo Cupquelan y Estero Quitralco) Macrozona 8 (Fiordo Puyuhuapi y Raúl Marín Balmaceda) Control Negativo (Caleta Tortel y Río Cochrane) Puerto Natales Capitán Aracena Lago Llanquihue Lago Chapo Lago Riesco Lago Huillinco Lago Natri Lago Sofía Lago Caburga Lago Calafquén Lago Colico Lago Villarrica Lago Ranco Lago Panguipulli Lago Riñihue Lago Yelcho Lago Rupanco Lago Puyehue Código FA EV M1 M5 M2 M4 M3 M6 M7 M8 CN PN PA L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 L11 L12 L13 L14 L15 L16 Los resultados positivos a los patógenos vigilados, fueron enviados a secuenciación para confirmación del diagnóstico. En los casos en que se diagnosticó P.salmonis, se realizó PCR convencional de las muestras positivas para obtener un fragmento de 470 pb para secuenciación y alineamiento de las secuencias, con las disponibles en el National Center for Biotechnology Information (NCBI). 2 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 8.

161 Resultados y discusión Como resultado de las actividades de pesca, se obtuvieron, individuos capturados y un promedio de 155 peces por zona geográfica. De la totalidad de los peces capturados, un 44,6% (2006 ejemplares), correspondieron a especies salmonídeas. Los resultados de los diagnósticos indican que, de la totalidad de los peces muestreados, existe prevalencia de un 0% para los patógenos IHNv, VHSv, EHNv, SAv, ISAv, IPNv, F. psychrophilum, R. salmoninarum. Solo se obtuvo positividad para el patógeno Piscirickettsia salmonis. Las zonas de Chiloé Sur (15,54%) y Fiordo Aysén (12,5%), fueron las de más alta prevalencia para P. salmonis. Mientras que las Macrozonas 5, 6, 7 y 8 y las zonas de Capitán Aracena, Puerto Natales, lago Huillinco y lago Natri, no presentaron positividad a este patógeno (Tabla 2). Tabla 2. Prevalencia de P. salmonis por zona de captura. Prevalencia Intervalo de Confianza P. salmonis Zona % +/n Lim Inferior Lim Superior Control Negativo 7,25% 10/138 3,07% 11,42% Estuario Valdivia 3,95% 6/152 0,83% 7,06% Fiordo Aysén 12,50% 18/144 7,10% 17,90% Macrozona 1 2,00% 3/150 2,05% 6,05% Macrozona 2 0,00% 0/145 0,00% 0,00% Macrozona 3 2,05% 3/146 0,22% 4,33% Macrozona 4 15,54% 23/148 8,58% 22,50% Macrozona 5 0,00% 0/137 0,00% 0,00% Macrozona 6 0,00% 0/160 0,00% 0,00% Macrozona 7 0,00% 0/172 0,00% 0,00% Macrozona 8 0,00% 0/170 0,00% 0,00% Capitán Aracena 0,00% 0/111 0,00% 0,00% Puerto Natales 0,00% 0/153 0,00% 0,00% Lago Huillinco 0,00% 0/146 0,00% 0,00% Lago Natri 0,00% 0/149 0,00% 0,00% Los resultados positivos se enviaron a secuenciación, confirmándose su identidad por medio de alineamiento con las secuencias disponibles en la base de datos de NCBI. 3 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 8.

162 Se realizó un análisis de factores de riesgo, mediante un modelo de regresión logística, resultando que las variables independientes que condicionan como factores de riesgo la aparición de peces silvestres positivos a P.salmonis, corresponden a la zona de captura, la especie capturada, el factor de condición del ejemplar capturado, la estación del año en que se efectúan las capturas, lesiones en los ejemplares capturados y la presencia de brotes de Piscirickettsiosis en los centros de cultivo del área muestreada previo y durante el muestreo de peces. La Macrozona 4, fue la que presentó la probabilidad más alta respecto de las demás zonas, con un valor de odds ratio de 2,245, siendo la única que presentó riesgo en la región de Los Lagos. Por otro lado se realizó un análisis de riesgo utilizando la opinión de un panel de expertos para definir las probabilidades de transmisión para las zonas con que no se cuenta con información a la fecha. En este caso los resultados indican que, las áreas de Caleta Tortel y Río Cochrane (Control Negativo) con un 2,78% (1,14% - 4,79%), Macrozona 3 con 3,41% (1,45% 5,77%), Macrozona 4 con 1,41% (0,25% 2,35%) y Fiordo Aysén con 1,15% (0,40% - 2,21%), fueron las zonas de mayor riesgo de transmisión de P. salmonis entre poblaciones silvestres y de cultivo. La probabilidad de incrementar el riesgo de transmisión de P. salmonis entre peces silvestres y de cultivo se asocia principalmente con la mortalidad, con cifras que variaron entre 0,59 a 0,74%. La liberación del agente al medio fue el factor que presentó los valores más bajos de correlación. El bajo impacto que tendría la infección con P. salmonis en peces silvestres, así como las consecuencias generadas a partir de ésta sobre las poblaciones cultivadas, se puede asociar con los bajos niveles de probabilidad asignados por el panel de expertos a los eventos relativos al riesgo de transmisión del agente desde los peces silvestres. Por esta razón es relevante la realización de estudios que permitan determinar de manera concreta, los niveles de probabilidad de estos eventos, y así tener estimaciones de riesgo con menores niveles de incertidumbre. Conclusiones Las especies silvestres o asilvestradas son posibles portadores de agentes infecciosos tales como P.salmonis. Cabe destacar la relevancia de este antecedente para el patógeno P.salmonis, principal agente causal de mortalidad en la actividad salmonicultora nacional. La presencia de éstos patógenos en especies silvestres y asilvestradas es un antecedente que debe ser profundizado, para conocer la direccionalidad de la transmisión de patógenos y el rol de estas poblaciones en la epidemiología de las enfermedades. 4 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 8.

163 A N E X O 9 Base de datos hallazgos necropsia de peces salmonídeos (CD).

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165 1 INFORME FINAL: EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA SITUACIÓN SANITARIA DE ESPECIES SILVESTRES EN AGUA DULCE Y MAR - ANEXO 9.

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