MITOSIS Y CITOQUINESIS PROFESOR JUAN FERNANDEZ

Transcripción

1 MITOSIS Y CITOQUINESIS PROFESOR JUAN FERNANDEZ 2011

2 PUNTOS DE VERIFICACION ( CHECK POINTS ) QUE CONTROLAN EL CICLO CELULAR Check point G1=entrada al período S Check point G2=entrada al periodo M Check point M= salida de la metafase

3 CONTROL DEL CICLO CELULAR POR EL COMPLEJO CICLINA/CDK Asociacion a la ciclina M Puede haber una o mas Cdks y varias ciclinas: G1, G1/S, S, M Disociacion de la ciclina M Disociación de la ciclina S Asociación a la ciclina S

4 DIAGRAMA QUE MUESTRA LAS ETAPAS DE LA MITOSIS Y SU INTERCALACION DENTRO DEL CICLO CELULAR

5 MITOSIS EN UNA CELULA ANIMAL: INMUNOFLUORESCENCIA + DAPI. Célula del pulmón de un urodelo Interf. Prof. Temp. Prof. Tard. Prometaf. Microtúbulos= verde DNA= azul Metaf. Anaf. Temp. Anaf. Tard. Telof.

6 MICROFOTOGRAFIAS ELECTRONICAS DE TRANSMISION PARA COMPARAR UNA CELULA EN INTERFASE (MEGACARIOCITO) CON OTRA EN MITOSIS (MIELOBLASTO) Interfase Rhodin, 1963 Mitosis Fawcett, 1966

7 MICROTOGRAFIA ELECTRONICA DE TRANSMISION DE UNA CELULA EN MITOSIS Polos del huso: centríolos y material peri centriolar Huso mitótico y microtúbulos Cromosomas y relaciones con el huso mitótico Fawcett, 1966

8 VIDA MEDIA DE LOS MICROTUBULOS DURANTE LA MITOSIS E INTERFASE Microtúbulos marcados con fluoresceína y blanqueados con luz láser. Curva del 50% de recuperación de la fluorescencia del sitio blanqueado Alberts et al., 2005

9 CICLO DEL CENTROSOMA Duplicación de los centríolos Comienza separación Separación avanzada Polos del huso mitótico

10 ORGANIZACION DE LAS CINETOCORAS EN EL CROMOSOMA MITOTICO Y LOCALIZACION DE CONDENSINAS Y COHESINAS Inmunofluorescencia para detectar DNA y proteínas cinetocóricas

11 ESTRUCTURA Y FUNCION DE LAS COHESINAS Y CONDENSINAS Estructura del dímero de cohesina o condensina Dímeros de cohesina Dímeros de condensina

12 MICROFOTOGRAFIA ELECTRONICA QUE MUESTRA LA ESTRUCTURA LAMINAR DE LA CINETOCORA Y LA INSERCION DE MICROTUBULOS

13 PROMETAFASE: CAPTURA DE MICROTUBULOS POR LAS CINETOCORAS (1) Movimiento y captura de los cromosomas, (2) crecimiento de los microtúbulos y movimiento de los cromosomas y (3) inserción bipolar

14 ORGANIZACION DE LOS MICROTUBULOS EN EL HUSO MITOTICO Microtúbulos astrales Microtúbulos cinetocóricos Cromosomas Cinetocoras Motores Microtúbulos interpolares Centrosomas Micr. de contrate de fases de una metafase

15 MULTIFLUORESCENCIA DE UN HUSO MITOTICO CUYOS COMPONENTES SE HAN REVELADO POR INMUNOCITOQUIMICA AZUL: CROMOSOMAS ROJO: CINETOCORAS VERDE: MICROTUBULOS

16 DOBLE INMUNOFLUORESCENCIA (TUBULINA ROJA Y TUBULINA ENCAJONADA AMARILLA) + DAPI DE UNA MITOSIS (METAFASE) ENSAMBLADA IN VITRO A PARTIR DE UN EXTRACTO DE OVOCITO Y ESPERMATOZOIDES DE XENOPUS Cromosomas y microtúbulos del huso La tubulina-fluoresceína se desencajona Pulso de luz ultra violeta La tubulina avanza a lo largo de los microtúbulos Caza: 1,5 min Se incorpora tubulina roja Caza: 2,5 min

17 DOBLE INMUNOFLUORESCENCIA DE UN HUSO ENSAMBLADO IN VITRO (CITOPLASMA DE HUEVO DE RANA+ BOLITAS DE LATEX CUBIERTAS DE DNA BACTERIAL) EN AUSENCIA DE CENTROSOMAS Y CINETOCORAS NUCLEACION DE MICROTUBULOS PARTICIPACION DE MOTORES (-)--->(+) Verde= microtúbulos Rojo= latex+dna PARTICIPACION DE MOTORES (+)--->(-) ENFOQUE

18 RELACIONES ENTRE EL CHECKPOINT DE ENSAMBLAJE DEL HUSO MITOTICO Y LA MAQUINARIA QUE REGULA EL CICLO CELULAR Proteína quinasa/ciclina B Separasa/Securina COMPLEJO PROMOTOR DE LA ANAFASE INACTIVO Efector del complejo de check point mitótico Quinasa activadora Complejo promotor de la anafase/ciclosoma Activación de la separasa COMPLEJO PROMOTOR DE LA ANAFASE ACTIVO Musacchio and Salmon, 2007 Degradación por poliubiquitilación Inactivación de la qinasa CDK1 y salida del programa de mitosis

19 PROCESO DE INSERCION DE MICROTUBULOS A LA CINETOCORA SIN TENSiON MAD2 alta en cinetocora Aurora-B alta en centrómero Inserciones correctas e incorrectas CON TENSION MAD2 baja en cinetocora Aurora-B alta en centrómero SEPARACION DE CROMATIDES MAD2 y Aurora-B bajas Digestión de cohesina Correcciones ejecutadas por Aurora-B quinasas Musacchio and Salmon, 2007

20 REORGANIZACION DEL HUSO MITOTICO Y SEGREGACION DE LOS CROMOSOMAS DURANTE LA ANAFASE Acortamiento microtúbulos cinetocóricos Alargamiento microtúbulos interpolares

21 DOS MODELOS ALTERNATIVOS DE COMO LA CINETOCORA PODRIA GENERAR FUERZA DURANTE LA ANAFASE Actividad de motores moleculares y despolimerización Despolimerización de microtúbulos

22 GENERADORES DE FUERZA MOLECULAR Y SUS SITIOS DE ACCION EN EL HUSO MITOTICO DE MAMIFEROS Ens/desens de mts pueden empujar o tirar un objeto Motores moleculares pueden mover objetos hacia los extremos (+) o (-) de los microtúbulos Un elemento elástico puede empujar o tirar un objeto Fuerzas de fricción se oponen al movimiento Empuje a los largo de microtúbulos en antiparalelo Tirar o empujar desde la cinetocora Localización en el huso mitótico donde operan las fuerzas Tracción con respecto a la corteza celular Congregación en los polos del huso Dumont and Mitchison, 2009 Empujar los brazos del cromosoma

23 MODELO QUE PODRIA EXPLICAR LA FUNCION DE MOTORES MOLECULARES DURANTE LA ANAFASE B Motor (+)-->(-) Motor (-)-->(+)

24 LOS PRINCIPALES MOTORES MOLECULARES (DIMERICOS Y TETRAMERICOS) ASOCIADOS AL HUSO MITOTICO Kinesina 5 (-)-->(+) Kinesina 14 (+)-->(-) Kinesina 10 (-)-->(+) Dineína (+)-->(-) Flechas: dirección en que se mueve el motor Alberts et al., 2008

25 PARTICIPACION DE MICROTUBULOS Y FILAMENTOS DE ACTINA EN LA DIVISION CELULAR Microtúbulos del huso y cromosomas Anillo de citoquinesis. microtúbulos y cromosomas

26 REGULACION DE LA CONTRACCION DEL ANILLO DE CITOQUINESIS POR LA RHO A GTPasa Rho A GTPasa inactiva Rho A GTPasa aciva Factor de nucleación activado Nucleación de actina Activación de Rock (kinasa) Fosforilación de cadenas livianas de miosina Activación de miosina II Alberts et al., 2008

27 METAFASES SINCRONICAS EN EL BLASTODERMO DEL EMBRION DEL PEZ CEBRA. INMUNOFLUORESCENCIA Verde: microtúbulos (husos mitóticos). Rojo: DNA (cromosomas) Manuscrito en preparación. Lab. Juan Fernández

28 INMUNOFLUORESCENCIA DE UNA BLASTULA DEL PEZ CEBRA, METAFASE Y TEMPRANA ANAFASE VERDE= MICROTÚBULOS, ROJO o AZUL= DNA Manuscrito en preparación. Lab. Juan Fernández

29 ANIMACION DE LA PRIMERA DIVISION DE CLIVAJE DE UN EMBRIÓN TRANSGENICO DEL PEZ CEBRA Expresion del dominio de la ensconsina (E-MAP-115), que se une a microtúbulos, fusionada a 3 GFP (EMTB-3GFP) Primera imágen: Profase I Whür et al., 2010

30 LOS CICLOS CELULARES 2, 3 y 4 DE UN EMBRION TRANSGENICO DEL PEZ CEBRA CON SUS MICROTUBULOS MARCADOS Punto de partida: metafase de la segunda división de clivaje

31 COMPARACION DEL CICLO CELULAR DE LEVADURAS QUE SE DIVIDEN POR FISION O YEMACION. MITOSIS INTRANUCLEAR

32 INFLUENCIA DE MOTORES QUE SE MUEVEN EN DISTINTAS DIRECCIONES SOBRE LA LONGITUD DEL HUSO MITOTICO EN LEVADURAS Inmunofluorescencia contra microtúbulos Levadura yemando Huso normal Sobre expresión de kinesina 14 (+)-->(-) Sobre expresión de kinesina 5 (-)-->(+) Alberts et al., 2008

33 INMUNOFLUORESCENCIA DE UNA CELULA VEGETAL EN CITOQUINESIS Ausencia de polos del huso y ásteres Formación de pared celular

34 POLARIZACION CELULAR Y DIVISIONES ASIMETRICAS Ahringer, 2003

35 DIVISIONES DESIGUALES Y ASIMETRICAS DE CELULAS TRONCALES (TELOBLASTOS) EN UN EMBRIÓN DE LA SANGUIJUELA Teloplasma (dominio citoplasmático) y núcleo del teloblasto. M.O Inmunofluorescencia de un teloblasto en anafase y de células blásticas en interfase teñidas con Hoescht Teloblasto y células blásticas. MO Contacto del tipo gap entre dos teloblastos. MET Fernández et al. Varias fuentes

36 MITOSIS EN LA BLASTULA SINCISIAL DEL EMBRION DE DROSOPHILA Verde= microtúbulos Rojo= cromosomas Manuscrito en preparación. Lab. Juan Fernández

37