En la mitosis los microtúbulos. ensamblan el aparato tico, estructura que es esencial para distribuir el de la nueva generación.

Transcripción

1 En la mitosis los microtúbulos ensamblan el aparato mitótico tico, estructura que es esencial para distribuir el material genético en las células c de la nueva generación. n.

2 El aparato mitótico se ensambla a partir de centrosomas, que en células en interfase ocupa una posición perinuclear núcleo

3 En las células animales el centrosoma se duplica antes de comenzar la mitosis Al final de la fase G1, la actividad de las kinasas Cdk2 y de las ciclinas A y E (activas durante G1/S y la fase S) promueven la duplicación de los centrosomas. De modo que la coordinación de la duplicación del DNA y del centrosoma están aseguradas por el mismo mecanismo de control. Lodish et al., 2004

4 El centrosoma consiste en un par de centríolos inmersos en una matriz fibrosa centrosomas duplicados

5 La matriz fibrosa pericentriolar contiene numerosas copias del complejo γ-turc (gamma-tubulin ring complex) El complejo γ-turc consiste de proteínas que estabilizan un anillo de subunidades de tubulina γ a partir del cual se ensamblan los heterodímeros α/β. Los microtúbulos ensamblados a partir del centrosoma poseen una polaridad uniforme, con su extremo de rápido crecimiento (+) distal.

6 El aparato mitótico consiste de tres tipos de microtúbulos funcionalmente distintos: astrales, del cinetocoro y polares Los MTs astrales irradian desde el centrosoma (en amarillo) y contribuyen a la separación de los polos y al posicionamiento del huso. Los MTs del cinetocoro (en rojo) forman ramilletes (fibras del cinetocoro) que anclan los polos a los cinetocoros de los cromosomas. Los MTs polares (en azul) se interdigitan en el ecuador del huso y permiten generar fuerzas que regulan la separación de los polos. Lodish et al., 2004

7 formación del huso captura y alineamiento de cromosomas transporte de cromátides hacia los polos no solo depende de microtúbulos sino también de moléculas motoras

8 Kinesinas-C contribuyen en la alineación de los MTs polares Las kinesinas-c son homodiméricas y poseen las cabezas motoras en el terminal carboxilo. Se translocan hacia el extremo (-) de los microtúbulos; participan en la alineación de los MTs polares y en el acercamiento de los polos. Lodish et al., 2004

9 Kinesinas bipolares tetraméricas y dineínas contribuyen a la separación de los centrosomas BimC, Eg5 son kinesinas bipolares que se unen a MTs polares antiparalelos y se translocan hacia el extremo (+) de los MTs. Junto a las las dineínas corticales las kinesinas bipolares separan los polos en prometafase y forman el huso bipolar. dineína cortical Lodish et al., 2004

10 El rol esencial de kinesinas en el ensamble del huso mitótico ha sido examinado in vitro a partir de extractos de huevos de Xenopus La inactivación de la kinesina bipolar Eg5 con la droga monastrol produce un huso monopolar. Los microtúbulos se marcaron empleando tubulina unida a rodamina (en rojo). El DNA se marcó con Hoechst (azul). + monastrol huso normal huso monopolar T. Mitchison lab

11 La estructura y dinámica del aparato mitótico depende de la actividad coordinada y combinatorial de diferentes motores Dineínas corticales que actúan sobre los MTs astrales y kinesinas-c (-) que actúan sobre los MTs polares antiparalelos de la zona media generan fuerzas opuestas que determinan la longitud del huso. + profase La asociación de kinesinas bipolares (+) a los MTs antiparalelos en la zona media contribuye a una posterior elongación del huso hasta alcanzar un estado estacionario. prometafase/metafase Sharp et al, Nature 2000

12 La ruptura del balance de fuerzas entre motores de distinta polaridad altera la longitud del huso En las figuras se muestran los husos mitóticos de células de levadura marcadas con un anticuerpo anti-tubulina (en verde) husos normales sobre-expresión de kinesina-c sobre-expresión de kinesinas bipolares (B) células de levaduras normales (C) células que sobreexpresan la kinesina-c Kar3p, de polaridad (-) exhiben el acortamiento del huso. (D) células que sobreexpresan la kinesina bipolar Cin8p, de polaridad (+) revelan el alargamiento del huso.

13 En profase, los microtúbulos de los centrosomas duplicados incrementan el dinamismo e invaden el centro de la célula Los complejos Cdk-ciclinas mitóticas (= MPF) incrementan el dinamismo de los microtúbulos durante profase mediante la fosforilación y activación de catastrofinas y la inactivación de MAPs estabilizadoras. Los MTs de metafase son más dinámicos que los de interfase (FRAP) Las catastrofinas son proteínas que se unen a los extremos (+) de los MTs y promueven la depolimerización del extremo (+). En contraste, las MAPs se asocian a la pared de los MTs y disminuyen la inestabilidad dinámica.

14 Ruptura de la envoltura nuclear Captura de cinetocoros por microtúbulos del huso Alineamiento de cromosomas en la placa ecuatorial

15 La inestabilidad dinámica de los microtúbulos y la actividad de motores (+) son esenciales para la captura de los cinetocoros Inestabilidad dinámica de los microtúbulos Rol de motores de polaridad (+): CENP-E CENP-E: centromeric protein-e, es una kinesina asociada al cinetocoro que contribuye al posicionamiento de los cromosomas en la placa ecuatorial. Lodish et al., 2004

16 Capturados los cinetocoros los cromosomas se transportan a la placa ecuatorial en movimientos oscilatorios Los movimientos oscilatorios resultan de la actividad de: a) motores asociados al cinetocoro y a los polos y que poseen distinta polaridad; b) motores unidos a la cromatina que se translocan hacia el extremo (+) de los MTs polares y empujan los brazos de los cromosomas hacia la placa de metafase; c) eventos de polimerización y depolimerización del extremo (+) de los MTs del cinetocoro. (c) (b) chromokinesinas son kinesinas-n asociadas a los brazos de los cromosomas. Lodish et al., 2004

17 El cinetocoro es un complejo multiproteico ensamblado sobre la región de heterocromatina centromérica de los cromosomas MCAK es una kinesina-m asociada a la capa externa del cinetocoro y que depolimeriza el extremo (+) de MTs. Proteínas de control o checkpoint mitótico también se localizan en el cinetocoro. CENP-E es una kinesina (+) asociada a la corona fibrosa del cinetocoro que contribuye a anclar el MT al cinetocoro. (MCAK: Mitotic Centromere-Associated Kinesin) Lodish et al., 2004

18 Excepto en levaduras el centrómero usualmente consiste en secuencias de DNA repetidas DNA centromérico de S. cerevisiae Alberts et al., 2002

19 En metafase los cinetocoros de las cromátides hermanas anclan microtúbulos de polos opuestos microscopía electrónica de barrido de cromosoma de metafase Inmunolocalización de cinetocoros (rojo) centrómeros MTs cromosomas cromátides

20 En Metafase los microtúbulos de los cinetocoros exhiben un estado dinámico de "treadmilling" Demostración experimental del treadmilling. Se muestra un huso mitótico ensamblado in vitro. Los MTs se marcaron con tubulina-rodamina (rojo) y los cromosomas con Hoechst (azul). La marca verde representa una fracción de tubulina-fluoresceína activable por un pulso de luz. Note que la fluoresceína activada se desplaza hacia el polo izquierdo. DNA microtúbulos 1.5min fotoactivación de la fluoresceína unida a la tubulina mediante un pulso de UV suministrado dentro de la región marcada (verde) En el "treadmilling" la adición de subunidades de tubulina en el extremo (+) es balanceada por el desensamble de subunidades en el extremo (-). 2.5min

21 El treadmilling de MTs de metafase también puede visualizarse en kimografías empleando trazas de tubulina fluorescente La técnica consiste en agregar a la preparación de tubulina que va a formar el huso trazas de tubulina fluorescente (rojo), de modo que cuando ésta se incorpora a los microtúbulos con baja frecuencia, genera un patrón de marcas o speckles fluorescentes. A B C kimografía pendiente de la línea formada por la posición de las trazas a distintos tiempos. tubulina fluorescente distancia * En (A) se esquematiza un microtúbulo marcado con trazas de tubulina fluorescente (en rojo). En (B) se muestra una fotografía del huso donde se visualizan las marcas o speckles fluorescentes. El cambio de posición de las marcas fluorescentes individuales en función del tiempo puede visualizarse si se analiza una franja o slice correspondiente a distintos tiempos y que seon alineadas después de la videomicroscopía (asterisco) (C). La distancia recorrida por las marcas fluorescentes se emplea para calcular la velocidad de translocación de la tubulina en los microtúbulos (~ 0.75 μm/min). Mitchison & Salmon, Nature Cell Biol 2001

22 tracción de los cinetocoros hacia los polos Anafase A: acortamiento de la fibra del cinetocoro en ambos extremos de los MTs Anafase B: separación de los polos por acción de kinesinas bipolares

23 Transición metafase anafase separación de las cromátides metafase anafase

24 Distintas fuerzas gobiernan el movimiento de los cromosomas durante la anafase ANAFASE A: Depolimerización de los MTs de los cinetocoros en los cinetocoros y en los polos. ANAFASE B: Deslizamiento entre MTs antiparalelos polares en el plano ecuatorial mediado por kinesinas (+). También fuerzas de tracción ejercidas por dineínas corticales.

25 Evidencia experimental del acortamiento de los MTs de los cinetocoros en el extremo (+). Experimentos de fotodestrucción (photobleaching) de la fluorescencia revelan la depolimerización de los MTs en el cinetocoro, evento que no requiere de ATP y actividad motora. región fotodestruída Gorbsky et al JCB 1988

26 El acortamiento de los MTs del cinetocoro también es demostrado empleando proteínas fluorescentes fotoactivables Tubulina conjugada a fluoresceína fotoactivable es microinyectada en células e incorporada al huso en metafase. Al comienzo de la anafase, la fluoresceína es activada (zona verde). Note que la tubulina activada se pierde al mismo tiempo que los cromosomas migran hacia los polos. MCAK es una kinesina asociada al cinetocoro que promueve la depolimerización del extremo (+) de los MTS. CENP-E es una kinesina que mantiene unidos los cromosomas a los MTs durante su acortamiento. Zhai et al JCB 1995

27 Kinesinas inducen el desensamble de los MTs en el cinetocoro y en los polos Las kimografías demuestran que la kinesina KLP10A es requerida para el flujo de tubulina fluorescente hacia los polos. La inhibición de KLP10A con un anticuerpo, inhibe el flujo. Kinesinas-M, como por ejemplo MCAK, XKCM1, KLP10A y KLP59C, se unen a los extremos de los MTs e inducen el desensamble. pole pole En estas kimografías de MTs con trazas de tubulina-rodamina se demuestra que la kinesina KLP59C es requerida para el movimiento de los cinetocoros (en verde). La inhibición de KLP59C con un anticuerpo, inhibe el efecto de pac-man. disassembly disassembly Rogers et al, Nature 2004

28 En la anafase B el huso es elongado por la acción coordinada de kinesinas y dineínas La inactivación de las kinesinas-c (-), y la acción de las kinesinas bipolares (+) en conjunto con dineínas corticales contribuyen a la separación de los polos en la anafase B. anafase B Sharp et al, Nature 2000

29 Deslizamiento entre microtúbulos antiparalelos en la zona media del huso

30 Resúmen de las distintas funciones de las proteínas motoras en la mitosis Motores (+) unidos a los brazos de los cromosomas (cromokinesinas) transportan a los cromosomas hacia la placa ecuatorial. Motores (-) anclados a la corteza celular (dineínas) contribuyen a elongar el huso. La movilidad del cinetocoro involucra dos tipos de motores: 1) motores (-) asociados a la corona fibrosa traccionan los cromosomas hacia los polos; 2) motores en el interior del cinetocoro promueven el desensamble de los MTs y el anclaje de los cromosomas al extremo (+). (2) (2) (1)

31 (División n del citoplasma) Dos mecanismos aseguran que la citoquinesis ocurra al finalizar la mitosis: 1. La inactivación de Cdk-ciclinas M mediada por APC-Cadh1. 2. La asociación de MTs antiparalelos en la región central del huso que es requerida para el ensamble del anillo contráctil.

32 La citoquinesis comienza durante la anafase

33 El primer cambio morfológico visible de la citoquinesis en una célula animal es la aparición de un surco en la superficie Microscopía electrónica de barrido mostrando el surco de clivado en la superficie de una célula huevo de anfibio

34 La estructura molecular responsible del surco superficial de clivado es un anillo contráctil de actina y miosina actina doble inmunofluorescencia miosina II

35 La miosina II es esencial para que ocurra la citocinesis En etapas anteriores a la citocinesis la miosina II es inhibida por fosforilación mediada por CDK-ciclinas M. Durante telofase, la activación de la fosfatasa Cdc14 y del complejo APC-Cdh1 promueven la defosforilación de la miosina y su asociación con el anillo de actina. La contracción del anillo forma el surco de clivado.

36 Dos modelos proponen roles opuestos de los microtúbulos en la formación del anillo contráctil El modelo de relajación astral propone que los microtúbulos astrales inhiben la contractilidad en la región adyacente a la corteza de los polos. Esto permitiría que la contracción ocurra en la corteza ecuatorial de la célula. El modelo alternativo de la estimulación astral propone que los microtúbulos astrales suministran una señal positiva que induce la contracción en la corteza ecuatorial. Un probable mediador de la contractilidad es la GTPasa Rho. Rho-GTP

37 La asociación de microtúbulos polares antiparalelos en la zona media es esencial para la citoquinesis La asociación de MTs antiparalelos en la zona media del huso (en verde) y el ensamble del anillo contráctil es mediada por la kinesina ZEN-4. La unión de ZEN-4 a los MTs es inhibida por fosforilación mediada por Cdk-ciclinas M. En telofase, la fosfatasa Cdc14 dispara la degradación de las Cdks-ciclinas M y defosforila a ZEN-4. APC Cdh1 Cdk-M ZEN-4 Cdc14 MLC microscopía electrónica de barrido mostrando dos células a punto de finalizar la citocinesis microscopía electrónica de transmisión mostrando el cuerpo medio matriz densa MTs de la zona media