3. UNIDAD 3. OTROS MÉTODOS INSTRUMENTALES

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1 Introducción 3. UNIDAD 3. OTROS MÉTODOS INSTRUMENTALES Esta unidad reúne los elementos principales que describen tres de las más avanzadas técnicas instrumentales utilizadas en la ciencia para la identificación y cuantificación de estructuras moleculares. Se presentan los conceptos principios y aplicaciones de Espectrometría de masas, Espectroscopía de Resonancia magnética nuclear (RMN) y Espectroscopía Raman. Aunque cada una de las técnicas representa un campó grande de estudio y aplicación, la combinación de estas podrá conllevarnos a obtener mayor información a nivel molecular. Igualmente se destacan las aplicaciones en el seguimiento de reacciones y mecanismos de reacción, así como, la mejor forma de abortar la interpretación de la información obtenida.

2 CAPITULO 7: ESPECTROMETRÍA DE MASAS Introducción La espectrometría de masas (MS) es una técnica de análisis basada en la separación, de acuerdo con sus relaciones masa/carga, de especies cargadas formadas a partir de la ionización de una muestra. Se trata de una técnica extremadamente sensible, de gran versatilidad y cuyos campos de aplicación experimentan un crecimiento vertiginoso en nuestros días. La MS suministra información muy valiosa sobre los compuestos químicos: la masa molecular, la fórmula global y a partir de un patrón de fragmentación de una molécula se puede obtener la estructura molecular. También la composición isotópica en sustancias naturales o marcadas. Debe reiterarse la elevada sensibilidad de la MS (en condiciones muy especiales pueden detectarse señales correspondientes a sólo 10 iones) por lo que es la preferida para la determinación de trazas en química ambiental y en los controles antidopaje. Los orígenes de la MS se remontan al estudio de la conducción de la electricidad en los gases a finales del siglo XIX. El descubrimiento por Goldstein en 1886 de los rayos canales (iones positivos) y la medición de su razón masa/carga por Wien en 1898, mediante deflexión bajo la acción de campos eléctricos y magnéticos, son los hitos iniciales del desarrollo de la espectrometría de masas. Wien encontró que los rayos canales tenían carga opuesta y una razón masa/carga muy superior a las del electrón, determinada ese mismo año por J.J.Thomson. Thomson comienza en 1905 a estudiar estos rayos canales positivos y recibe en 1906 el premio Nobel de física por sus estudios de la conductividad eléctrica en gases. En 1913 logra separar iones con diferente relación masa/carga, determinando la existencia de los dos isótopos del neón 20 Ne y 22 Ne. Francis Aston construye en 1919 el primer espectrógrafo de masas rudimentario con un poder de resolución de 130 y recibe en 1922 el premio Nobel por su descubrimiento, mediante el espectrógrafo de masas, de un gran número de isótopos de elementos no radiactivos. En 1934 Mattauch y Herzog desarrollan un espectrómetro de masas de doble enfoque y Dempster en 1936 la fuente de ionización por chispa. En 1937 Aston construye un espectrógrafo con un poder de resolución de En 1931 Lawrence desarrolla el ciclotrón por lo que recibe el premio Nobel en 1939 y sus principios son aplicados al enriquecimiento de uranio en el proyecto Manhattan.

3 La urgente necesidad de métodos de análisis eficientes de las fracciones del petróleo durante la segunda guerra mundial llevó a la aplicación de la MS al campo de los compuestos orgánicos. Los primeros espectrómetros de masas comerciales aparecerán al finalizar la guerra. En 1946 Stephens presenta el concepto de MS con analizador de tiempo de vuelo. La aplicación de la MS a los compuestos orgánicos y el estudio de las fragmentaciones como fuente de información estructural se desarrollan muy rápidamente desde fines de los años cuarenta del siglo XX. En 1956 Mc Lafferty propone la reacción de transferencia de hidrógeno o reordenamiento que lleva su nombre. En 1959 se comienzan a desarrollar los sistemas acoplados entre un cromatógrafo de gases y un espectrómetro de masas (GC-MS). Aparecen nuevos métodos de generación de iones y de analizadores. En 1966 se introduce la ionización química y en 1968 Dole desarrolla la ionización por electronebulización. En 1974 Comisarow y Marshall diseñan la MS mediante resonancia del ión ciclotróntransformada de Fourier y en 1976 Mc Farlane y colaboradores desarrollan la MS por desorción de plasma. En los años ochenta se desarrollan nuevas técnicas de ionización efectivas que permiten la ionización de especies no volátiles, con mínima descomposición. Estos métodos abren las puertas a las aplicaciones de la MS al campo de las macromoléculas y en particular las biomoléculas. En 1984 Fenn y colaboradores aplican la electronebulización para ionizar biomoléculas. En 1985 Hillencamp, Karas y otros describen la ionización por desorción con láser inducida por matrices (MALDI) y en 1987 Tanaka perfecciona el método para ionizar proteínas intactas. En 1989 Paul recibe el premio Nobel por el desarrollo de la trampa de iones. En 2002 Fenn y Tanaka reciben el premio Nobel de química por el desarrollo de métodos de ionización por desorción suaves para el análisis por MS de macromoléculas biológicas.

4 Lección 30: Aspectos generales de la espectrometría de masas (MS) Proceso de Ionización electrónica Los fundamentos de la espectrometría de masas pueden ejemplificarse mediante la técnica de ionización electrónica, ya que es el primer paso en ésta técnica de análisis químico. Figura 87. Pasos principales en la espectrometría de masas Esto sucede cuando electrones acelerados a través de un campo eléctrico (ver Figura 88), adquieren energía cinética considerable y pueden interactuar con moléculas (M) del analito en cuestión para originar especies cargadas llamadas iones: En este caso es un catión-radical molecular. Normalmente se encuentra en un estado excitado y puede sufrir fragmentación, que puede ser de diferentes formas: ( ) ( ) ( ) ( )

5 Los iones y a su vez pueden fragmentarse y así sucesivamente. La forma de fragmentación dependerá en cada caso de la estructura molecular (ver Figura 89). Figura 88. Fragmentaciones posibles de una molécula en espectrometría de masas. La mayoría de los iones producidos tiene una carga correspondiente a la pérdida de un solo electrón (e = 1, C), aunque también se pueden obtener iones multicargados. La carga total de los iones se representa usualmente por, donde es la carga del electrón y el número de cargas sobre el ión. Todos los iones producidos son separados en un espectrómetro de masas de acuerdo con su relación masa/carga Medición de la masa atómica Debido a que la espectrometría de masas es una técnica analítica con una alta resolución, ésta puede discriminar entre la masa de isótopos. Es por esto, que la masa de los iones formados en el proceso de ionización se expresa en unidades de masa atómica o Dalton Estas unidades se establecen mediante una escala relativa tomando como referencia el isótopo del carbono 12, al cual se le ha asignado la masa de. Por definición, una o es un doceavo (1/12) de la masa de un átomo neutro del carbono 12.

6 De tal manera que la razón masa/carga (m/z) se expresa en Thompson. En general, en la espectrometría de masa, la carga se indica en múltiplos de la carga elemental o carga de un electrón en valor absoluto (1 e = 1, C). Cuando a una molécula se le suministra una determinada energía para su ionización, la molécula se descompone siguiendo un patrón concreto en el que se obtienen siempre los mismos fragmentos y en la misma relación de intensidad. Los iones así separados son detectados como corrientes iónicas cuyas intensidades son proporcionales a sus abundancias respectivas Este patrón concreto se representa gráficamente en el espectro de masas, al que se denomina por esta razón huella digital de la sustancia. De esta forma, el espectro de masas permite la identificación inequívoca de las moléculas tal como se observa en la Figura 90. Figura 89. Espectro de masas del alcohol terpénico geraniol.

7 Lección 31: Instrumentación Los espectrómetros de masas son instrumentos sofisticados que en general constan de: A) Un sistema de introducción de muestra, que puede ser entre otros un cromatógrafo de líquidos o un cromatógrafo de gases. B) Una fuente de ionización, que es donde se produce la fragmentación molecular característica de cada compuesto, C) Un analizador o filtro de masas que separa los fragmentos iónicos generados en función de su relación masa/carga D) Un detector que recoge y caracteriza los fragmentos iónicos que salen del analizador. Además todo el sistema se encuentra sometido a alto vacío (1x10-4-1x10-5 torr.) para evitar colisiones entre los fragmentos iónicos generados Introducción de la muestra Escoger el sistema de introducción de una muestra en un equipo especializado para MS dependerá de las propiedades físico-químicas de los compuestos a detectar. Es importante conocer que en MS se emplean pequeñas cantidades de analito debido a que es una técnica muy sensible; por lo tanto, el objetivo principal del sistema de entrada es introducir pequeñas cantidades de muestra (en micromoles) en el espectrómetro de masas. La muestra introducida debe vaporizarse, por lo cual, es el limitante principal en MS. Sin embargo, no es necesario vaporizar toda la muestra, sino únicamente la cantidad necesaria para alcanzar una presión de vapor mayor o igual a 10-6 mmhg, a una temperatura que no pirolice la muestra. De acuerdo con esto se utilizan tres métodos para la introducción de la muestra que se relacionan a continuación Introducción indirecta En la introducción indirecta, la muestra se vaporiza en un recipiente externo al espectrómetro, el cual puede ser un balón de vidrio o metal esmaltado

8 interiormente mantenidos a temperaturas elevadas. Se aplica para el análisis de gases, líquidos de punto de ebullición menor que 200 C o sólidos sublimables. Una vez vaporizada la muestra en el balón a una presión de 10-2 mmhg mediante un dispositivo adecuado, escape molecular, se permite salir el vapor a escala molecular hacia la fuente de iones, que se mantiene a un alto vacío (10-6 a 10-7 mmhg), el vapor fluye hacia la fuente de iones con gran rapidez debido a la diferencia de presión Introducción directa La muestra se introduce por medio de una varilla metálica que lleva en la punta un capilar conteniendo la muestra. Esta se calienta en el capilar, ya sea a través de la varilla o por medio de una resistencia eléctrica externa. La varilla se introduce en la fuente de iones por medio de un sistema de válvulas para evitar alterar el vacío que se mantiene en el interior del equipo. Este procedimiento presenta un problema principal el cual es que las muestras cristalinas no vaporicen de manera continua, lo que origina que la presión interna del equipo no permanezca constante, por lo que el sistema no será adecuado para la realización de análisis cuantitativos Introducción a partir de un cromatógrafo de gases Este procedimiento se ha popularizado para el análisis por espectrometría de masas de mezclas de compuestos, ya que la introducción se realiza directamente en fase gaseosa y el cromatógrafo realiza la separación de los diversos componentes de la mezcla. El acoplamiento de la cromatografía tanto líquida (liquid chromatography, LC) como gaseosa (gas chromatography, GC) como sistema de introducción de muestra, incrementa la capacidad de identificación de la técnica, proporcionando una herramienta de identificación y confirmación única. Cromatografía de gases / Espectrometría de masas: Algunos fabricantes de instrumentos ofrecen equipos de cromatografía de gases que pueden acoplarse directamente con distintos tipos de espectrómetros de masas de barrido rápido. El caudal de las columnas capilares en general es suficientemente bajo como para que la salida de la columna pueda introducirse directamente en la cámara de ionización de un espectrómetro

9 de masas. Desde finales de los años setenta han aparecido en el mercado diversos espectrómetros de masas diseñados específicamente como detectores para cromatografía de gases. Cromatografía HPLC / Espectrometría de masas: Un problema fundamental del acoplamiento de la cromatografía de líquidos con la espectrometría de masas es el enorme contraste que existe entre los volúmenes relativamente grandes de disolvente de la primera y los requerimientos de vacío de la última. Para resolver este problema se han desarrollado diversas interfaces. Algunas de las técnicas de acoplamiento se utilizaron durante un tiempo y hoy están en desuso, como la DLI =Direct Liquid Inlet o la Moving Belt (cinta móvil) Las técnicas que se usan rutinariamente en la actualidad para la introducción y análisis de muestras líquidas por espectrometría de masas pueden clasificarse en dos grupos: las que solo introducen la muestra líquida en la fuente iónica del instrumento tales como las de haz de partículas (PB, Particle Beam) y las que además consiguen la ionización de la misma (TSP = Thermospray o termonebulización, LC-FAB = Liquid chromatography - Fast Atom Bombardment, ESI= Electrospray Ionization) Ionización de la muestra Las fuentes de iones de los espectrómetros de masas, tienen todas unas características comunes, pese a la variabilidad de tipos existente y es que todas transforman los componentes de una muestra en iones. En muchos casos el sistema de entrada y la fuente de iones están combinados en un único componente. En todos los casos, se obtiene un haz de iones positivos o negativos (normalmente positivos) que posteriormente se acelera hacia el interior del analizador de masas o sistema separador a través del acelerador. La formación de iones del analito es el punto de arranque de arranque de un análisis por espectrometría de masas. El aspecto de los espectros de masas para distintas especies moleculares, depende en gran medida del método utilizado para la formación de los iones. Estos métodos los podemos dividir en dos categorías: Fuentes de fase gaseosa: en estas primero se volatiliza la muestra y luego se ioniza. Están generalmente restringidas a compuestos térmicamente estables que tengan puntos de ebullición menores de unos 500ºC. En la

10 mayoría de los casos, estos requerimientos limitan la utilización de las fuentes de fase gaseosa a compuestos con pesos moleculares menores de unos 103 Daltons. Son aplicables a muestras no volátiles y térmicamente inestables. Normalmente los espectrómetros de masas están equipados con accesorios que permiten intercambiar ambos tipos de fuentes. Son aplicables a compuestos que tienen pesos moleculares superiores de 1000 Daltons. Fuentes de desorción. En estas la muestra en estado sólido o líquido, se transforma directamente en iones gaseosos. Son aplicables a muestras no volátiles y térmicamente inestables. Normalmente los espectrómetros de masas están equipados con accesorios que permiten intercambiar ambos tipos de fuentes. Son aplicables a compuestos que tienen pesos moleculares superiores de Daltons. Las fuentes de iones se pueden clasificar también en fuentes duras y fuentes blandas. Fuentes duras: comunican suficiente energía a las moléculas para que estén en un estado de energía altamente excitado. La relajación posterior, implica la rotura de las uniones produciendo iones fragmentados. Su espectro da lugar a muchos picos y nos da información acerca de la naturaleza de los grupos funcionales e información estructural de los analitos. Fuentes blandas: dan lugar a poca fragmentación y el resultado es un espectro con muy pocos picos dándonos información útil ya que nos permite la determinación exacta del peso molecular de la molécula o moléculas Fuentes De Fase Gaseosa Impacto de electrones (EI): Se somete a la muestra a una temperatura suficientemente elevada (normalmente mediante un filamento caliente de wolframio o de renio) como para producir un vapor molecular, el cual

11 posteriormente se ioniza bombardeando las moléculas originadas con un haz de electrones de elevada energía (ver Figura 91). Figura 90. Ionización por impacto de electrones (EI) Pese a sus desventajas, esta técnica es la que se ha usado para determinar la mayoría de los espectros que componen las colecciones de espectros. Fuentes de ionización química (CI): En la ionización química los átomos gaseosos de la muestra (tanto de un sistema de entrada indirecto como de una sonda caliente) se ionizan al colisionar con los iones producidos al bombardear con electrones un exceso de gas reactivo (normalmente metano). Normalmente se utilizan iones negativos, aunque la ionización química de iones negativos se utiliza ocasionalmente en aquellos analitos que contienen átomos muy electronegativos. Fuentes de ionización por campo (FI): En las fuentes de ionización por campo, los iones se forman bajo la influencia de un campo eléctrico elevado (108 V/cm). Estos campos se producen al aplicar elevados potenciales (10

12 a 20 kv) a emisores especialmente construidos. Que están formados por numerosas puntas finas cuyos diámetros son menores a 1 μm. A menudo estos emisores adquieren la forma de un fino hilo de wolframio en el cual se han formado dendritas o filamentos microscópicos de carbono por pirólisis de benzonitrilo en un campo eléctrico elevado. El resultado de este tratamiento es la aparición de centenares de microagujas de carbón que emergen desde la superficie del hilo. En este caso el analito adquiere poca energía vibracional y rotacional por lo que tiene poca fragmentación Fuentes De Desorción En las dos últimas décadas se han desarrollado numerosos métodos de ionización por deserción para tratar muestras no volátiles o termodinámicamente inestables. Estas técnicas prescinden de la volatilización y de la posterior ionización y en su lugar se suministra energía a la muestra sólida o líquida de diversas maneras, de modo que se provoca la formación directa de iones gaseosos. Como consecuencia se obtienen espectros muy simplificados. Fuentes de desorción por campo (FD): Esta fuente de ionización usa un emisor con múltiples puntas, similar al usado en las fuentes de ionización por campo. En este caso el electrodo se coloca sobre una sonda que puede retirarse y recubrirse con una disolución de la muestra, después de reinsertarla la ionización se produce tras proporcionar un potencial elevado a este electrodo. En ocasiones es necesario calentarlo haciéndole pasar una corriente pero puede ocurrir una degradación térmica antes de completarse la degradación. Desorción/ionización por láser asistida por una matriz (MALDI): Esta técnica de reciente descubrimiento nos permite calcular pesos moleculares exactos de extractos de biopolímeros polares en un intervalo de masas moleculares de varios cientos de miles de Daltons. En esta técnica se mezcla una disolución acuoso/alcohólica de la muestra con un exceso de una sustancia matriz que absorbe la radiación. La disolución resultante se evapora en la superficie de una sonda metálica que se utiliza para la introducción de la muestra. La mezcla sólida se expone a la acción de un haz de láser pulsante, provocando la sublimación del analito a iones que son introducidos en un espectrómetro de tiempo de vuelo para el análisis de masas.

13 Figura 91. Desorción por láser asistida por matriz (MALDI). Ionización por electronebulización (ESI/MS): Esta técnica se ha convertido en una de las más importantes para el análisis de biomoléculas de pesos superiores a Daltons (ver Figura 93). Se realiza en condiciones atmosféricas de presión y temperatura. La disolución de la muestra se bombardea a través de una aguja capilar de acero inoxidable a un flujo de algunos microlitros por minuto. Las agujas se mantienen a un potencial de varios kv con respecto al electrodo cilíndrico que rodea a dicha aguja. La niebla de finas gotitas cargadas resultantes pasa a través de un capilar de desolvatación donde se produce la evaporación del disolvente y de las moléculas del analito y donde estas adquieren la carga. Debido a que las gotitas se vuelven más pequeñas por la evaporación del disolvente, su densidad aumenta produciéndose la desorción de los iones en la atmósfera gaseosa.

14 Figura 92. Ionización por electronebulización Fuentes de bombardeo con átomos rápidos (FAB): Con este tipo de fuentes, las muestras en un estado condensado, a menudo en una matriz de una disolución de glicerol, se ionizan por bombardeo con átomos de xenón o argón de elevada energía. Tanto los iones positivos como negativos del analito son expulsados de la superficie de la muestra por un proceso de desorción. El haz de átomos rápido se obtiene pasar iones acelerados de argón o xenón de una fuente o cañón de iones a través de una cámara que contiene átomos de argón o xenón a una presión de unos 10-5 torr. Setos experimentan una reacción de intercambio de electrones en resonancia con los átomos obteniéndose un haz de átomos de alta energía. Desorción por plasma (PD): El deterioro del 252Cf produce dos fragmentos de fisión que viajan en direcciones opuestas. Un fragmento golpea la muestra anulando entre 1-10 iones analíticos. El otro fragmento golpea un detector y desencadena la puesta en marcha de la adquisición de datos. Este método es especialmente interesante para moléculas largas de origen biológico.

15 Ionización por termonebulización (TS): La ionización por termonebulización se usa para elementos reflectantes. Una muestra es depositada encima de una cinta metálica, que puede ser de Pt o Re y una corriente eléctrica calienta el metal a altas temperaturas. La cinta es revestida de grafito que reduce la desfragmentación Analizadores de masa Para la separación de iones con diversas relaciones masa/carga son posibles varios métodos. Idealmente, un analizador debería ser capaz de distinguir entre diferencias muy pequeñas de masa. Además, los analizadores deberían permitir el paso del suficiente número de iones para dar lugar a corrientes de iones fácilmente medibles. Sin embargo, estas dos propiedades no son totalmente compatibles y siempre se debe llegar a un compromiso en el diseño. La capacidad de un espectrómetro de masas de distinguir entre masas se expresa normalmente en términos de su resolución R, que se define como: Ecuación 3.1 donde m es la diferencia entre dos picos adyacentes que están resueltos y m es la masa nominal, masa sin decimales, del primer pico (a veces se utiliza en su lugar la masa media de los dos picos). Dos picos se consideran que están separados si la altura del valle entre ellos no es más que un porcentaje de su altura (a menudo un 10%). Así, un espectrómetro con una resolución de 4000 podrá resolver picos que tengan valores de m/z de 400,0 y 400,1 (o 40,00 y 40,01). La exactitud de la masa mide la proximidad del valor registrado de m/z a su verdadero valor. La resolución que se necesita en un espectrómetro de masas depende en gran parte de su aplicación. Por ejemplo para diferenciar entre iones de la misma masa nominal tales como C2H4 +, CH2N +, N2 + y CO + (todos ellos con 28 daltons de masa nominal pero con masas exactas de , , y daltons, respectivamente) se necesita un instrumento con una resolución de varios miles. Por otro lado, los iones de bajo peso molecular que difieren en una unidad de masa o más [por ejemplo, NH3 +, (m = 17) y CH4 + (m = 16)] pueden distinguirse con un instrumento que tenga una resolución inferior a 50. Los espectrómetros comerciales son asequibles con resoluciones que van desde aproximadamente 500 a

16 Analizadores de sector magnético Los analizadores de sector magnético utilizan un imán permanente o un electroimán para hacer que el haz de iones de la fuente se mueva en una trayectoria circular de 180, 90 o 60 grados. La Figura 94 muestra un instrumento de sector de 90 grados en el que los iones, formados por impacto de electrones, son acelerados a través de la rendija B hacia el tubo analizador metálico, que se mantiene a una presión interna de alrededor de 10-7 torr. Se puede llevar a cabo un barrido de los iones de diferente masa a través de la rendija de salida variando la fuerza del campo del imán, barridos magnéticos, o el potencial de aceleración entre las rendijas A y B, barridos eléctricos. Los iones que pasan a través de la rendija de salida se recogen en un electrodo colector y dan lugar a una corriente de iones que es amplificada y registrada. Figura 93. Analizador de masas de sector magnético Analizador de masa de Cuadrupolo. El espectrómetro de masas cuadrupolo (ver Figura 95) es el analizador de masas más común. Su tamaño compacto, una velocidad de escaneo rápida, alta eficiencia de transmisión, y requerimientos modestos de vacío son ideales para pequeños instrumentos de bajo costo.

17 La mayoría de instrumentos cuadrupolo se limitan a la resolución de unidad de m/z y tiene un rango de masas de 1000 m/z. Muchos instrumentos de mesa tienen una amplia masa de 500 m/z, pero los instrumentos de investigación están disponibles con rango de masas hasta de 4000 m/z. El analizador de masas tipo cuadrupolo está formado por cuatro barras conductoras de secciones hiperbólicas alineadas paralelamente entre sí y equidistantes de un eje central imaginario situado sobre el eje Z, donde los segmentos opuestos están conectados y los segmentos adyacentes están eléctricamente aislados. Se aplica una combinación de corriente continua (DC) y voltajes de radiofrecuencia (RF) sobre los pares de segmentos. La magnitud del voltaje de radiofrecuencia determina la relación masa/carga que es capaz de describir una trayectoria tal que atraviesa el analizador y alcanza el detector. De modo que variando dicha magnitud se podrán detectar los fragmentos iónicos cargados positivamente que se generaron en la fuente de ionización y que son característicos de cada compuesto. Figura 94. Analizador de masas cuadripolar. Este tipo de analizador es robusto y muy reproducible. Es muy utilizado en el modo SIM (Selected Ion Monitoring) en el que solo filtra los iones los iones de unas relaciones m/z concretas. Esto permite obtener espectros de masas muy simples (con muy pocos iones) pero que son muy sensibles. Además la respuesta

18 lineal a la concentración es muy buena, por lo que son muy utilizados para llevar a cabo análisis de cuantificación Analizador de trampa de iones (IT-MS, ion-trap MS o ITD, ion trap detector) Una trampa de iones es un dispositivo en el que los cationes o aniones gaseosos pueden ser formados y confinados durante largos períodos de tiempo por la acción de campos eléctricos y/o magnéticos. Se han desarrollado varios tipos de trampas de iones que en general son cuadrupolos, pero en el espacio lo que hacen es manipular iones y permitir hacer masas/masas. La Figura 95 muestra la sección longitudinal de una trampa de iones sencilla asequible comercialmente. Consiste en un electrodo anular y un par de electrodos colectores. Se aplica al electrodo anular un potencial de radiofrecuencia variable mientras que los dos electrodos colectores están conectados con tierra. Los iones con un valor apropiado de m/z circulan en una órbita estable dentro de la cavidad que está rodeada por el anillo. Cuando el potencial de radiofrecuencia se aumenta, las órbitas de los iones más pesados llegan a estabilizarse, mientras que las de los iones más ligeros se desestabilizan, lo que causa colisiones con la pared del electrodo anular. Cuando este dispositivo funciona como un espectrómetro de masas los iones quedan atrapados en el interior de la trampa mediante la aplicación de los voltajes y radiofrecuencias adecuados, pudiéndose de esta forma hacer experimentos con ellos. Se sacan los iones que no interesan de la trampa y dejamos el que nos interesa estudiar que chocaría con el He y así se haría el masas/masas. Los espectrómetros de trampa de iones son robustos, compactos y más económicos que los instrumentos de sector o de cuadrupolo. Sin embargo, sufre de limitaciones en cuanto a su capacidad de resolución y otras relacionadas con la alta probabilidad de que puedan producirse interacciones ión molécula durante el prolongado tiempo de residencia de los iones en la cavidad Analizadores de tiempo de vuelo En un espectrómetro de masas con analizador de tiempo de vuelo (Time-Of-Flight: TOF), los iones son extraídos en pulsos de la fuente de ionización e inmediatamente son acelerados mediante la acción de un campo eléctrico para lograr la uniformidad en sus energías cinéticas antes de que entren al analizador. Posteriormente los iones con movimiento rectilíneo uniforme atraviesan un tubo,

19 sometido a alto vacío, hacia el detector. El tiempo necesario para atravesar la longitud del tubo (tiempo de vuelo) depende del valor de la razón m/z de cada ión. Para iones con carga unitaria (z=1; m/z=m), el tiempo necesario para recorrer la distancia de la fuente al detector es depende de su masa, de manera que mientras mayor sea ésta, más lentamente arribará el ión al detector. En el caso del analizador TOF no existen campos eléctricos o magnéticos que obliguen a los iones a describir complicadas trayectorias. En principio no existe un límite superior en el rango de valores de la masa de los analizadores TOF, lo que los hace especialmente útiles combinados con fuentes de ionización blandas en el análisis de macromoléculas. Los analizadores TOF tienen una transmisión iónica eficiente por lo que son instrumentos muy sensibles. Además el barrido de un espectro es muy rápido convirtiéndolo en componentes ideales en los equipos acoplados con cromatógrafos. La deficiencia principal de los analizadores TOF es su baja resolución espectral, lo que tiene su origen en que iones de igual m/z presentan cierta dispersión en los valores de energía cinética después de la aceleración, y por lo tanto iones de un valor de m/z dado se superponen con los valores de m/z próximos al llegar al detector. Entre las variantes más utilizadas para enfrentar esta dificultad se destaca la utilización de un reflector iónico electrostático, denominado reflectrón, que usualmente está compuesto por una seria de rejillas y electrodos de anillo, El reflectrón crea un campo retardador que actúa como un espejo y envía los iones de retorno hacia el tubo de vuelo. El reflectrón introduce una corrección en la energía de dispersión de los iones que salen de la fuente de ionización y que tienen el mismo valor de la razón m/z. Los iones con más alta energía cinética penetrarán más profundamente en el reflectrón y por lo tanto estarán un tiempo mayor en el mismo. Así, estos iones impactarán al detector al mismo tiempo que aquellos iones más lentos que tienen el mismo valor de m/z y penetran menos en el mismo. El reflectrón incrementa la resolución espectral a expensas de la sensibilidad dado que muchos iones se pierden en su área y además introduce una limitación en el alcance de masas. Este sistema se denomina TOF-reflectrón, para diferenciarlo del TOF-lineal. Los analizadores TOF son directamente compatibles con las técnicas de ionización por pulsos, tales como el MALDI o plasma, dado que en éstas los tiempos de ionización están definidos exactamente y son cortos. Por ejemplo, una combinación ampliamente utilizada es el MALDI-TOF. Las técnicas de ionización continuas también pueden ser compatibles con analizadores TOF, pero requieren algunas adaptaciones para transformar un haz iónico continuo en otro en forma de pulsos. Resulta difícil lograr el acoplamiento de una fuente de ionización por

20 electronebulización con un analizador TOF. Los analizadores TOF con su elevado alcance de masas, rapidez de operación y resolución elevada en su variante con reflectrón se aplican cada vez con más frecuencia en EM comenzando a desplazar a los analizadores cuadripolares en numerosas aplicaciones Detectores Luego de la separación de los iones en el analizador del espectrómetro de masas, éstos deben ser detectados. La detección dependerá de cómo se efectuó la separación de los iones, es decir del tipo de analizador utilizado. Un analizador cuadripolar separa iones con valores diferentes de relación masa/carga (m/z) de forma secuencial, esto es, iones a m/z 200; 201; 202 que pasarán al detector uno después de otro. Por lo tanto, el detector iónico situado al final de analizador cuadripolar necesita cubrir solamente un punto o foco en el espacio de manera que un espectro de masas completo se registra en el dominio del tiempo. Este tipo de detector de iones se denomina detector puntual. Por su parte, un analizador de sector magnético puede separar iones en el espacio, lo cual permite que su arribo al detector pueda ser registrado de forma simultánea. Este tipo de detector iónico se denomina detector compuesto, y mediante su utilización el registro del arribo de los iones se realiza en el dominio del espacio. Los detectores puntuales dan espectros de masas donde el registro es función del tiempo y en los detectores compuestos es función del espacio. Dependiendo del analizador, los espectrómetros de masas pueden utilizar detectores puntuales, compuestos o ambos Electromultiplicadores Resulta importante conocer cómo funciona un multiplicador electrónico, pues elementos de este tipo se encuentran entre los más empleados entre los detectores de iones. En la Figura 97 se muestra el esquema de un multiplicador electrónico. Un ión positivo o negativo proveniente del analizador y registrado en el dinodo de conversión causa la emisión de varias partículas secundarias, las cuales pueden a su vez dar lugar a iones positivos y negativos así como a partículas neutras. Cuando iones positivos impactan al dinodo de conversión de alto voltaje negativo, las partículas secundarias de interés serán iones negativos y electrones. Por el contrario, cuando iones negativos impactan al dinodo de conversión de alto voltaje

21 positivo, las partículas secundarias de interés serán iones positivos. Esas partículas secundarias son aceleradas en el dinodo continuo e impactan al cátodo con energía suficiente para desalojar electrones en la medida en que chocan con las paredes internas curvilíneas. Figura 95. Esquema de funcionamiento del detector electromultiplicador. Los electrones pasan posteriormente al multiplicador electrónico e impactan nuevamente las paredes causando la emisión de más y más electrones en la medida en que se desplazan hacia el potencial situado al final de las paredes. De esa forma se crea una cascada de electrones que finalmente origina una corriente medible al final del multiplicador electrónico. La potencia de amplificación es el producto del factor de conversión (número de partículas secundarias emitidas por el dinodo de conversión) y el factor de multiplicación del multiplicador electrónico dinodo continuo. Este valor puede resultar del orden de Los multiplicadores electrónicos son muy sensibles, si bien es cierto que su tiempo de vida es limitado debido a la contaminación de la superficie por los iones o debido a un vacío relativamente pobre Detector (colector) iónico compuesto El detector iónico compuesto consiste en un número de elementos de detección iónicos ordenados en una línea o en varias líneas unas sobre otras en un plano.

22 Cada elemento de detección es un multiplicador electrónico. Por esta razón para la construcción de los detectores compuestos los multiplicadores electrónicos individuales tienen que ser muy pequeños de manera que puedan ser situados unos al lado del otro en el menor espacio posible. Así, el diseño de un elemento de un detector compuesto es significativamente diferente al de un multiplicador electrónico estándar utilizado para un detector de iones puntual, aun cuando sus métodos de trabajo son similares. La mayor ventaja de los detectores de iones compuestos sobre los detectores de iones puntuales se encuentra en la posibilidad que brindan de registrar un rango de valores de m/z y la abundancia correspondiente de los iones, todo a un mismo tiempo, que además es muy breve. Hay dos situaciones importantes en las cuales son preferibles mediciones rápidas en espectrometría de masas: Cuando se utilizan fuentes de ionización como la desorción por láser, en cuyo caso se produce un pulso en un intervalo de tiempo muy corto, usualmente del orden de los nanosegundos. Si el detector se demora 1s para intentar barrer el rango de valores de m/z de los iones producidos, sólo podrá detectar iones durante los primeros nanosegundos. La utilización de un detector de iones puntual cuando la ionización se ha efectuado por pulsos del orden de tiempo descrito llevaría a la situación siguiente: luego de transcurridos los primeros intervalos del barrido no llegarán más iones al detector porque no deben existir. En el detector de iones compuesto la detección simultánea elimina esta dificultad. Cuando resulta necesario detectar trazas de un material. El problema práctico es que el espectro de masas debe ser registrado lo más rápidamente posible para evitar el riesgo de que los fragmentos iónicos de la sustancia que existe en tan baja cantidad no sean detectados durante el barrido. El detector de iones compuesto permite registrar una región estrecha del espectro e incluso monitorear un solo valor de m/z Acoplamiento con otras técnicas instrumentales Excelentes resultados pueden obtenerse mediante el acoplamiento de espectrómetros de masas con diferentes instrumentos. Los sistemas que se originan reúnen las ventajas de cada componente individual de manera que, por

23 una parte permiten solucionar problemas que resultarían insolubles o muy difíciles de solucionar para las técnicas individuales y por otro lado, y esto es muy importante, dan lugar a novedosos sistemas de trabajo experimental con amplias capacidades de aplicación. Dos de los sistemas más importantes son el acoplamiento cromatografía - espectrometría de masas (C-EM) y el tándem de espectrometría de masas (EM/EM) Acoplamiento cromatografía-espectrometría de masas. La cromatografía es un método utilizado para la separación de mezclas en sus componentes individuales, haciendo que éstos pasen a través de una columna de un sólido o un líquido. Para que ocurra el proceso cromatográfico, son necesarias una fase móvil y una estacionaria. En la cromatografía gaseosa (CG) la fase móvil es un gas y la estacionaria una columna embebida de líquido. En la cromatografía líquida (CL) la fase móvil es un líquido y la estacionaria generalmente es una columna de un sólido poroso. El flujo de la fase móvil a través de la estacionaria, fuerza a la mezcla a moverse por la columna cromatográfica. Una variante de la (CL) es la cromatografía líquida (High Performance Liquid Chromatography: HPLC), en la cual la fase móvil se somete a presión para obtener una mayor eficiencia de separación. Los métodos cromatográficos son muy eficientes para separar los componentes de una mezcla, pero la información que brindan no es en general suficiente para identificar con seguridad a cada uno de ellos. Por su parte, la espectrometría de masas es un método altamente eficiente para deducir la estructura química de una sustancia. Sin embargo, su utilidad es limitada en el análisis de mezclas debido a que el espectro de masas de éstas es una complicada superposición de los espectros correspondientes a los componentes individuales. Para el análisis de mezclas complejas de sustancias se utilizan los acoplamientos CG-EM y CL-EM. La idea esencial es realizar la separación cromatográfica de los componentes de la mezcla, que una vez separados se inyectan en sucesión al espectrómetro de masas para obtener los espectros de cada uno de ellos, tal como se ilustra en la Figura 97.

24 Figura 96. Esquema del acoplamiento Cromatografía-MS Cromatografía líquida-espectrometría de masas (CL/EM) El acoplamiento CL/EM es más complicado debido principalmente a dos factores: en la espectrometría de masas se tienen que producir iones en fase gaseosa y resulta necesario eliminar el disolvente utilizado en la elución. Dos de los métodos utilizados para solucionar estos problemas se describen a continuación. Acoplamiento por interfase de flujo de partículas: Se trata de un procedimiento mediante el cual se puede separar el disolvente de las moléculas eluidas en una columna de cromatografía líquida de forma rápida y eficiente. El eluato cromatográfico se bombea a través de un capilar hacia un nebulizador concéntrico de vidrio. Seguidamente el eluato se transforma en una nube de gotas que son dispersadas mediante un flujo concéntrico de helio. La nube pasa a través de una cámara de desolvatación cuyas paredes están calentadas y en la que existe una presión ligeramente inferior a la atmosférica. Durante el trayecto estas gotas sufren una desolvatación parcial y producen gotas de los compuestos eluídos ligeramente solvatadas. Cuando el flujo abandona la cámara de evaporación la mezcla de helio, vapor de disolvente y moléculas eluidas sufre una expansión en la primera etapa de bombeo, de lo cual resulta un flujo de gas a alta velocidad que contiene a las moléculas eluidas. Estas moléculas difunden más lentamente del centro del flujo hacia la periferia. Mediante un selector se escogen las capas periféricas del flujo de manera que el vapor de disolvente escogido y el helio son extraidos y bombeados mecánicamente fuera del aparato. Este proceso se repite en la segunda

25 etapa del bombeo. Finalmente, un estrecho flujo de partículas enriquecido en las moléculas de interés, de lenta difusión, es enviado hacia el espectrómetro de masas sin perturbar el vacío. En las fuentes de ionización (EI) o (CI) las partículas inyectadas se vaporizan rápidamente antes de la ionización. En la fuente FAB, el flujo de partículas se dirige sobre una boquilla FAB cubierta por una matriz. Así, las partículas chocan con la superficie de la matriz y son atrapadas en ella. Figura 97. Esquema del acoplamiento CL/EM por interfase de flujo de partículas. Acoplamiento FAB de flujo continuo: Consiste en unir el extremo de una columna cromatográfica capilar con el extremo de una boquilla FAB mediante un capilar que pase a través de la boquilla de introducción. Se añade de 1 a 5 % de glicerol al disolvente cromatográfico. La velocidad del flujo varía de 1 a 5 μl min -1, por lo que se puede bombear con facilidad. El disolvente se evapora pero el glicerol permanece en la superficie de la boquilla con la elución de los componentes y sirve como una matriz de la fuente de ionización FAB Espectrometría de masas en tándem Un tándem de espectrometría de masas (EM-EM, en inglés MS n ) es cualquier sistema que contiene al menos de dos etapas de análisis, separadas por una interfase en la cual los iones procedentes del primer analizador generalmente son activados y se fragmentan. El sistema de tres cuadrupolos ya ha sido tratado en el epígrafe correspondiente. La espectrometría de masas en tándem es también

26 posible en los equipos de doble enfoque con analizadores magnético y electrostático, utilizando la técnica denominada de barrido ligado (linked scan). Esta técnica consiste en el barrido simultáneo de los campos E y B de acuerdo a una relación matemática que depende de la geometría empleada, de la región donde ocurren las fragmentaciones y del tipo de información deseada (espectro de iones producto, iones precursores o neutrales). Aquí mencionaremos los aspectos más generales de EM-EM. Entre las técnicas de activación utilizadas con este fin se incluyen las siguientes: disociación inducida por colisión (collision-induced dissociation: CID), disociación por captura electrónica (electron capter dissociation: ECD), disociación por transferencia electrónica (electron transfer dissociation: ETD), disociación multifotónica infrarroja (infrared multiphoton dissociation: IFMPD). El principio de trabajo del tándem de espectrometría de masas, se ilustra en la Figura 100. En el más simple de los experimentos de masas, EM-EM, el primer analizador (EM 1 ) genera el espectro de masas de una sustancia y selecciona los iones correspondientes a un mismo valor de m/z, que se denominan iones precursores. Los iones precursores son activados y se fragmentan, pasando al segundo analizador (EM 2 ), con lo que se obtiene el espectro de masas de los iones precursores seleccionados (barrido de iones fragmento). Existen dos categorías principales de espectrómetros que permiten realizar experimentos EM-EM: tándem de espectrómetros en el espacio y en el tiempo. El tándem en el espacio es el resultado del acoplamiento de instrumentos (cuadrupolo triple) y el tándem en el tiempo es la realización de una secuencia apropiada de eventos en un mismo instrumento de almacenamiento de iones (por ejemplo en una trampa de iones o la cámara de iones en un ciclotrón). En lo que sigue nos referiremos al primero de los sistemas. El más simple de los sistemas tándem de espectrometría de masas incluye dos analizadores EM/EM o EM 2 ; no existen en principio límites para el número de espectrómetros que pueden acoplarse, es decir, sistemas EM n. Hasta ahora se han construido sistemas que incluyes hasta cuatro analizadores de masa acoplados. En la medida en que aumenta el número de analizadores acoplados crecen las capacidades experimentales, también la complejidad y por supuesto, el costo del instrumento. La espectrometría de masas en tándem también es útil cuando se trata de analizar una mezcla de sustancias. En la Figura 101 una mezcla de compuestos A+B+C se introduce a una fuente de ionización blanda donde se originan los iones correspondientes A +, B +, C +, que son iones moleculares

27 Figura 98. Espectrometría de masas en tándem. El analizador EM 1 genera el espectro de masas de la mezcla y selecciona el ión que será fragmentado en cada caso. Mediante el analizador EM 2 se registra el espectro de masas del ión seleccionado. El analizador EM 1 realiza la separación de los componentes de la mezcla y el espectrómetro EM 2 registra el espectro de masas de cada componente. El sistema EM/EM funciona de manera análoga al sistema cromatografía-masas, pero a una velocidad incomparablemente mayor. La espectrometría de masas en tándem permite obtener más información que cualquiera de las técnicas aisladas de espectrometría de masas ante un mismo problema, y además abordar problemas no accesibles a las técnicas individuales.

28 Figura 99. Esquema de sistema tándem para mezclas.

29 Lección 32: Indicadores de la eficiencia de un espectrómetro de masas Como en toda técnica de medición, un conjunto de indicadores expresa la eficiencia y confiabilidad de un espectrómetro de masas. Algunos ya han sido definidos previamente al estudiar los analizadores Límite de masas superior o alcance de masas Es el valor más elevado de la razón m/z que puede ser medido. Se expresa en thomson (Th) o unidades atómicas (u) para un portador de una carga elemental Poder de resolución. Es la capacidad del espectrómetro para diferenciar las señales de dos iones con valores de m/z cercanos (ver Figura 102). Se considera que dos picos están resueltos cuando el valle entre los mismos tiene una fracción determinada de la intensidad del pico más débil (10% en analizadores magnéticos o ICR, 50% en analizadores cuadrupolares). Si δm es la menor diferencia de masas entre dos picos de masa m y (m + δm) que pueden ser resueltos, se define la resolución R como: Ecuación 3.2 Figura 100. Esquema de la definición para la Resolución. FWHM (full width at half máximum) ancho total a la mitad del máximo.

30 Dos picos vecinos se suponen que están suficientemente separados cuando el valle que separa sus máximos ha disminuido a un 10% de su intensidad. Por lo tanto, esto se conoce como definición de resolución del valle 10%, R10%. Las condiciones del valle 10% se cumplen cuando la anchura del pico a 5% de la altura relativa es igual a la diferencia de masa de los iones correspondientes, porque entonces la contribución del 5% de cada pico en el mismo punto del eje m/z añade hasta un 10% (ver figura 102). Con el advenimiento de los analizadores de cuadrupolo lineales, la definición de resolución del ancho completo a la mitad del máximo (FWHM) se extendió entre los fabricantes de instrumentos. También se utiliza comúnmente para TOF (time of flight) y los analizadores de masas de cuadrupolo-trampa de iones. Con formas de picos gaussianas, la relación de RFWHM a R10 es 1,8%. Ejemplo: Los cambios en los espectros IE de aire residual muestran bien el efecto de una mayor resolución (Figura 103). La configuración de R = 1000 presenta una anchura de pico de 0,028 u para la señal en m/z 28. Un aumento de R = 7000 perfectamente separa la menor contribución de CO +, m/z 27,995, de los N 2 + predominantes en m/z 28,006.

31 Figura 101. Espectros de masas IE de aire residual (a) en R = 1000 y (b) en R = Las intensidades relativas no están afectadas por la diferente resolución. Los dígitos decimales de las etiquetas de comunicación indican precisiones alcanzables en masa en las condiciones respectivas Transmisión La razón entre el número de iones que llega al detector y el número de iones producidos en la fuente de ionización. Depende del analizador y es determinante en la sensibilidad Sensibilidad Se define como la razón entre la corriente iónica y la cantidad de muestra en la fuente y expresa la capacidad del espectrómetro de masas para detectar las señales de un ión. Ejemplo: Los instrumentos modernos de sector magnético especifican tener una sensibilidad de aproximadamente el C para el ión molecular de octadecanoato de metilo, 298 m/z, con R = 1000, 70 ev en modo de IE. La carga

32 de C corresponde a 2, cargas de electrones. Un microgramo de octadecanoato de metilo es equivalente con 3, mol o 2, moléculas Límite de detección Debe diferenciarse de la sensibilidad. Es la cantidad más pequeña de muestra que produce una señal distinguible del ruido de fondo (generalmente una señal con intensidad diez veces superior al nivel de ruido). Se debe destacar que esta cantidad mínima no tiene que corresponder con la cantidad de muestra necesaria para obtener un espectro de masas interpretable. Por ejemplo, el límite de detección puede ser menor de 1 pg, pero que se necesite 1 ng del compuesto para obtener el espectro. El límite de detección depende considerablemente de la abundancia de la especie iónica dependiendo de la abundancia de esta especie respecto al total de iones derivados de la molécula analizada. Así, para reducir el límite de detección se debe generar una señal todo lo intensa que sea posible, para lo cual se utilizan métodos tales como: modificar las condiciones de ionización, emplear técnicas más suaves de ionización, obtener derivados de la muestra para incrementar el número de iones producidos en la fuente o reducir sus fragmentaciones.

33 Lección 33: Aplicaciones de la espectrometría de masas Las aplicaciones son tan numerosas y abarcan tantos campos que resulta complicado citarlas todas, a continuación veremos las más características: Elucidación de la estructura de moléculas orgánicas y biológicas. Determinación del peso molecular de péptidos, proteínas y oligonucleicos. Identificación de los compuestos de cromatogramas en capa fina y papel. Determinación de secuencias de aminoácidos en muestras de polipéptidos y proteínas. Detección e identificación de especies separadas por cromatrografía y electroforesis capilar. Identificación de drogas de abuso y sus metabolitos en sangre, orina y saliva. Control de gases en enfermos respiratorios durante los procesos quirúrgicos. Pruebas para confirmar la presencia de drogas en sangre de caballos de carreras y en atletas olímpicos. Datación de ejemplares en arqueología. Análisis de partículas en aerosoles. Determinación de residuos de pesticidas en alimentos. Control de compuestos orgánicos volátiles en el agua de suministro Vamos a ver ahora de un modo más extenso las principales aplicaciones de esta técnica Aplicaciones cualitativas Determinación del peso molecular de todas las sustancias que pueden volatilizarse por la posición del pico correspondiente a la masa patrón.

34 Determinación de la formula molecular. Si el instrumento es de gran resolución bastará la determinación precisa de su masa molecular para poder atribuirle una fórmula empírica. Otras veces puede determinarse por la relación entre las alturas del pico correspondiente a la masa patrón y la de los picos de los isótopos. Existe una tercera forma que sería con la regla del nitrógeno, según la cual todas las sustancias orgánicas con peso molecular par deben de contener un número par o ningún átomo de N y los de número impar deben de contener un número impar. Por el contrario los fragmentos moleculares por rotura de enlace, tienen una masa impar si contienen cero o número par de átomos de N y masa par si el número de átomos de N es impar Identificación de compuestos por su fragmentación patrón La fragmentación de la mayor parte de las moléculas produce un gran número de picos que permiten la identificación de numerosos compuestos y el reconocimiento de ciertos grupos funcionales de ellos. Se han descrito una serie de reglas generales que rigen los procesos de fragmentación, los cuales son de gran utilidad para la determinación de los espectros Identificación de productos de reacción o de productos metabólicos Se usa en cinética química y en farmacología pudiéndose llegar a identificar impurezas y metabolitos a concentraciones de pocas partes por millón. Muchos estudios de farmacocinética se realizan haciendo uso de la espectrometría de masas dada la naturaleza compleja de las matrices (con frecuencia sangre u orina) y la alta sensibilidad requerida para determinar concentraciones extremadamente bajas de analitos. Se utiliza comúnmente un sistema de cromatografía líquida- espectrometría de masas (LC-MS) con sistema de cuadrupolos triple. Un tándem de masas se pude adicionarse para elevar la especificidad. El uso de patrones y estándares internos permite determinar cuantitativamente el fármaco deseado. Puede seguirse entonces la metabolización del fármaco a partir de su suministro al paciente Caracterización y análisis de polímeros El polímero se piroliza en condiciones controladas y los productos volátiles se hacen pasar a un espectrómetro para su análisis.

35 Análisis de sangre Gracias a la rapidez del método, se puede emplear incluso como control durante un proceso quirúrgico. Así se puede determinar a gran velocidad las concentraciones hemáticas de monóxido y dióxido de carbono, oxígeno, nitrógeno, gases anestésicos (como el NO) Análisis proteómico Con el desarrollo de las técnicas de ionización ESI y MALDI, la espectrometría de masas se ha impuesto desde los años noventa como un método esencial en la caracterización de proteínas, especialmente en la secuenciación o determinación de estructuras primarias. Esta técnica ha sustituido en buena medida a las técnicas de secuenciación de proteínas por vía química. Las técnicas tradicionales tienen una baja eficiencia y no son adecuadas para la secuenciación rápida del creciente número de proteínas obtenidas en los diferentes proyectos de genómica. El procedimiento estándar parte de la hidrólisis enzimática (tripsina, pepsina) de la proteína a secuenciar y una separación cromatográfica inicial para llegar a mezcla de un pequeño número de péptidos. Los espectrómetros de masa en tándem permiten la separación final y la caracterización de los péptidos, en ellos la mezcla inicial de péptidos puede ionizarse con la técnica ESI. El primer EM separa los iones moleculares de los diferentes péptidos, estos iones se activan vibracionalmente por colisiones y fragmentan. El espectro de masas que se obtiene de cada péptido en el segundo EM permite su identificación. Debido a la simplicidad de la fragmentación es posible utilizar las masas de los fragmentos para la búsqueda en una base de datos de masas para secuencias peptídicas. Finalmente la superposición de los diferentes péptidos, con su abundante información redundante que resulta de los diferentes caminos de la proteólisis, permite obtener la secuencia de aminoácidos o estructura primaria de la proteína Estudiar la abundancia de isótopos Esta fue la finalidad con la que fue creada la técnica y en la actualidad se usa para análisis por dilución de isótopos, estudios con trazadores isotrópicos, estudiar la edad de las muestra por su proporción de isótopos con la ventaja frente a los radiactivos que se pueden medir los isótopos no radiactivos. La espectrometría de

36 masas permite determinar la composición isotópica de los elementos en una muestra, la que tiene numerosas aplicaciones prácticas. Las diferencias en masa entre los isótopos de un elemento son muy pequeñas y los isótopos menos abundantes son comúnmente muy raros por lo que se requieren instrumentos especialmente sensibles. Estos instrumentos son denominados espectrómetros de masas para la composición isotópica (isotope ratio mass spectrometer IR-MS por sus siglas en inglés). Para especies con masas pequeñas se manifiestan diferencias en las propiedades físicas, químicas y biológicas entre las diferentes composiciones isotópicas como la velocidad de vaporización entre HB2BO y HOD, fijación de CP16POB2B y CP16POP18PO como carbonato de calcio en un foraminífero, etc. La fijación selectiva de COB2B con diferente composición isotópica por parte de organismos vivos depende de la temperatura ambiente. El estudio por EM de materiales fósiles permite el estudio de las condiciones climáticas en tiempos remotos (Paleoclimatología). Un equipo muy especializado se dedica a la determinación del contenido de deuterio en muestras de agua y otros compuestos. La razón isotópica D/H promedio en el agua de los océanos es de 156 ppm pero oscila varias decenas de ppm en las aguas fluviales de acuerdo a su procedencia. Las razones isotópicas en una muestra son una fuente de información valiosa para determinar adulteración o falsificación de vinos u otros productos de alta calidad, establecer la procedencia geográfica de una droga (cocaína, marihuana) y en la detección de alteraciones metabólicas. La técnica IR-MS se aplica también a la determinación de la edad de materiales mediante el llamado fechaje del carbono. La determinación de los tiempos de permanencia a la intemperie o de tiempo de enterramiento de diferentes materiales se basa sobre el hecho de que un objeto enterrado unos pocos metros bajo el suelo, sedimentos, rocas o hielo está protegido de los rayos cósmicos y al ser desplazado a la superficie se expone a dicha radiación. Al ser expuesto se generan los llamados núcleos cosmogénicos como P10PBe, P14PC, P26PAl y P36PCl. Estos núclidos son radiactivos con tiempos de vida medios desde miles hasta millones de años. Las mediciones en espectrómetros de masa especializados, con elevada exactitud, permite encontrar las razones entre los isótopos estables y los radiactivos. La determinación del tiempo de exposición de un material se realiza partiendo de las razones entre los isótopos estables y los radioisótopos. De aquí se deduce la cantidad absoluta de radio-isótopos presentes, la que es proporcional al tiempo de permanencia en la superficie. Si la velocidad de producción de un radio-isótopo es conocida puede determinase entonces el tiempo de exposición del material. La determinación de los tiempos de enterramiento utiliza también a los núclidos cosmogénicos. Si el objeto

37 permaneció un tiempo determinado en la superficie puede estimarse la cantidad inicial de radioisótopos presentes en el material al momento del enterramiento. Posteriormente se produce una disminución de la concentración de los radioisótopos, que sólo depende de los tiempos de vida medios conocidos. Si se dispone de dos concentraciones en tiempos diferentes puede entonces estimarse el tiempo de enterramiento Aplicaciones cuantitativas. Para la determinación cuantitativa de los componentes de una mezcla es conveniente que cada uno de ellos presente por lo menos un pico que difiera claramente de los demás. La calibración se realiza por comparación de los picos con patrones adecuados. Las alturas de los picos son directamente proporcionales a las presiones parciales de los componentes volatilizados en la muestra. Las aplicaciones cuantitativas de la espectrometría de masas para análisis cuantitativo son de dos tipos: Determinación cuantitativa de especies moleculares o tipos de especies moleculares en muestras orgánicas, biológicas y ocasionalmente inorgánicas Normalmente tales análisis se llevan a cabo haciendo pasar la muestra a través de una columna cromatográfica o de electroforesis capilar y posteriormente por el espectrómetro Determinación de la concentración de elementos en muestras inorgánicas y, en menor medida, de muestras orgánicas y biológicas: Las concentraciones de analito en este caso se obtienen directamente a partir de las alturas de los picos de los espectros de masas. Se crean curvas de calibrado que nos permiten el análisis cuantitativo gracias a la existencia de picos únicos para cada componente y cada valor de m/z.

38 Lección 34: Espectros de masas moleculares Reviste gran importancia práctica la aplicación de los principios de la espectrometría de masas a la interpretación de espectros de sustancias de interés, haciendo énfasis en la obtención de las inferencias estructurales. Es importante puntualizar que se pretende ilustrar cómo los mecanismos de fragmentación pueden ser aplicados a compuestos particulares, sin intentar sistematizar estos mecanismos de reacción. En la espectrometría de masas el número de caminos de fragmentación posibles crece exponencialmente con el número de sitios de iniciación. Así, los espectros de los ésteres tienen más picos que los de los éteres o cetonas. Además, una molécula que contenga dos grupos funcionales puede sufrir reacciones que no ocurren en aquellas con un solo grupo. El estudio de los mecanismos de fragmentación de los compuestos se limitará esencialmente a aquellos obtenidos mediante la técnica EI. Las denominadas reglas de fragmentación, de carácter empírico y basadas sobre la formación preferente de nuevos iones o fragmentos neutros más estables, nos permiten prever en muchos casos las fragmentaciones más notables de un compuesto. Un espectro de masas por lo general se presenta como un gráfico de barras verticales, en el que cada barra representa un ion que tiene una específica relación de masa a carga específica (m/z) y la longitud de la barra indica la abundancia relativa de los iones. Al ion más intenso se le asigna una abundancia de 100, que se conoce como el pico de base. La mayoría de los iones formados en un espectrómetro de masas tienen una sola carga, por lo que el valor m/z es equivalente a la masa en sí. Espectrómetros de masas modernos distinguen fácilmente los iones que difieren en sólo una unidad de masa atómica, y por lo tanto proporcionan valores totalmente precisos para la masa molecular de un compuesto. El ion de mayor masa en un espectro normalmente se considera como el ion molecular e iones de menor masa son fragmentos del ion molecular; suponiendo que la muestra es un compuesto puro.

39 Ejemplo: Puesto que una molécula de dióxido de carbono se compone de sólo tres átomos, su espectro de masas es muy simple. El ion molecular es también el pico de base, y los fragmentos de iones sólo son CO (m/z = 28) y O (m/z = 16). Figura 102. Espectro de masas y fragmentación del CO 2. Ejemplo: El ion molecular de propano también tiene m/z = 44, pero no es el ion más abundante en el espectro. La escisión de un enlace carbono-carbono da fragmentos de metilo y de etilo, uno de los cuales es un carbocatión y el otro un radical. Ambas distribuciones se observan, pero el más grande de cationes de etilo (m/z = 29) es el más abundante, posiblemente debido a su tamaño permite una mayor dispersión de carga.

40 Figura 103. Espectro de masas y fragmentación del propano Ejemplo 3: Una rotura del enlace similar en ciclopropano no da dos fragmentos, por lo que el ion molecular es más fuerte que en el propano, y de hecho es el responsable para el pico de base. La pérdida de un átomo de hidrógeno, ya sea antes o después de la apertura del anillo, produce el catión estable alilo (m/z = 41). El ion fuerte tercero en el espectro tiene m/z = 39 (C3H3). Su estructura es incierta, pero dos posibilidades se muestran en el diagrama. El ion con m/z = 39 en propano y la ausencia del ion de m/z = 29 en ciclopropano son particularmente significativas para distinguir estos hidrocarburos.

41 Figura 104. Espectro de masas y fragmentación del ciclopropano Compuestos orgánicos más estables tienen un número par de electrones totales, lo que refleja el hecho de que los electrones ocupan orbitales atómicos y moleculares de dos en dos. Cuando un electrón se elimina de una molécula para dar un ion, el recuento total de electrones se convierte en un número impar, y nos referimos a los iones tales como cationes radicales. El ion molecular en un espectro de masas es siempre un radical catiónico, pero los fragmentos de iones puede ser o bien cationes par de electrones o impar de electrones cationes radicales, en función del fragmento neutro perdido. Las fragmentaciones más simples y más comunes son las divisiones de los enlaces que producen un radical neutro (número impar de electrones) y un catión que tiene un número par de electrones. La fragmentación menos común es en el que se pierde un fragmento neutro con número par de electrones, se producen iones radicales fragmento de cationes con número impar de electrones. Los fragmentos de iones mismos, se pueden fragmentar aún más. Como regla general, iones con

42 número impar de electrones se pueden fragmentar, ya sea a iones con número par o impar de electrones, pero incluso los fragmentos de iones de electrones sólo para los otros pares de electrones iones. Las masas de iones moleculares y fragmento reflejan también el número de electrones, en función del número de átomos de nitrógeno en la especie. Iones con número par de átomos de nitrógeno. Iones con número impar de átomos de nitrógeno. Iones con número impar de electrones, número masa par. Iones con número impar de electrones número impar de masa. Iones con número par de electrones, número impar de masa. Iones con número par de electrones, número de masa par. Ejemplo: La cetona insaturada, 4-metil-3-penten-2-ona, (ver Figura 106) no tiene nitrógeno por lo que la masa del ión molecular (m/z = 98) es un número par. La mayoría de los fragmentos de iones tienen masas impares, y por lo tanto son cationes con número par de electrones. Figura 105. Espectro de masas y fragmentación del 4-metil-3-penten-2-ona.

43 La dietilmetilamina, por otro lado, tiene un nitrógeno y su masa molecular (m/z = 87) es un número impar. Una mayoría de iones fragmentos tienen masas pares (iones m/z = 30, 42, 56 y 58), son cationes de nitrógeno con número par de electrones. Los iones débiles con número par de electrones m/z = 15 y 29 se deben a metilo y cationes de etilo (no a átomos de nitrógeno). Figura 106. Espectro de masas y fragmentación de N,N-dietilmetilamina Reglas de Fragmentación Las reglas de fragmentación están basadas en la estabilidad de iones y fragmentos neutros. Esta estabilidad puede racionalizarse, como hemos visto anteriormente, sobre la base de los conceptos de la Química Orgánica. Así por ejemplo está favorecida la formación de un ión estabilizado por deslocalización de la carga y/o cuando hay pérdida simultánea de un fragmento neutro estable. A tales efectos ya se ha destacado la abundancia de fragmentaciones con pérdida de pequeñas moléculas neutras estables en los espectros de masas-ei. Es frecuente la pérdida de CO, CO 2, H 2 O, C 2 H 4, C 2 H 2, HCN, HCl, HBr, NH 3, cetena (CH 2 =C=O), H 2 S y las moléculas radicales NO y NO 2. También debemos tener en cuenta la estabilidad relativa de los radicales: 3rio > 2rio > 1rio

44 Ruptura alquílica Figura 107. Fragmentación por ruptura alquílica en el 3,3-dimetilpentano. En cadenas alifáticas se rompen preferentemente los enlaces C-C en especial en los puntos de ramificación, dando lugar a iones fragmentos de mayor estabilidad (iones carbonio terciarios más estables que los secundarios y éstos más que los primarios) Ruptura olefínica Figura 108. Fragmentación por ruptura oleofínica en hidrocarburos alquílicos. Este tipo de ruptura corresponde a una fragmentación secundaria a partir de un carbocatión. Desde el punto de vista de la estabilización es determinante la formación de una molécula pequeña estable de olefina.

45 Ruptura alílica Figura 109. Fragmentación por ruptura alílica en hidrocarburos alquílicos insaturados. Los enlaces dobles favorecen la escisión homolítica de los enlaces en posición α para formar iones arílicos, estabilizados por deslocalización de la carga Ruptura bencílica Figura 110. Fragmentación por ruptura bencílica. La presencia de un anillo aromático induce la ruptura de los enlaces simples en posición α que conducen a la formación de un ión bencílico, estabilizado por deslocalización de la carga. Se ha encontrado que este ión se isomeriza rápidamente a ión tropilio Ruptura en α con formación de ión onio Los heteroátomos con capacidad de actuar como donores electrónicos favorecen la ruptura de los enlaces en posición α con formación de iones con nuevos enlaces: Figura 111. Fragmentación por ruptura α.

46 El ión molecular se formula como debido a la pérdida de un electrón de un par libre del heteroátomo X, creándose un centro inductor de fragmentaciones. La tendencia a formar los iones onio depende de la capacidad de X para actuar como donor. Este tipo de fragmentación predomina en las aminas y es muy débil en los haluros de alquilo. Cuando los heteroátomos se encuentran formando enlaces dobles la ruptura hemolítica en posición α es también prominente: Figura 112. Fragmentación por ruptura α en cetonas Ruptura heterolítica inducida por heteroátomos Figura 113. Fragmentación por ruptura heterolítica. Los heteroátomos con pares electrónicos libres poco básicos y débil tendencia a compartirlos presentan la ruptura heterolítica directa (típica de los derivados halogenados). La tendencia a esta ruptura heterolítica es inversamente proporcional a la de la ruptura homolítica: X = Hal > X = OR > X = SR > X =NR 2

47 Ruptura de retro-diels Alder (RDA) Figura 114. Fragmentación por ruptura retro Diels Alder. Esta fragmentación equivale a la ruptura de dos enlaces sencillos alicíclicos. Resulta significativa por originar fragmentos iónicos pares a partir del ión molecular. Esta retrorreacción de Diels-Alder es típica de dobles enlaces en ciclos (ciclohexenos y tetralinas). Los sustituyentes en 1, 2, 3, 6 se observan en los residuos butadiénicos y aquellos en 4, 5 en los residuos etilénicos pudiéndose diferenciar los mismos por EM Reordenamiento de hidrógeno en posición γ inducido por dobles enlaces y heteroátomos (Reordenamiento de McLafferty) Este reordenamiento específico, el más característico en EM mediante un doble enlace como centro inductor actuando a través de un estado de transición cíclico de 6 miembros. El proceso que usualmente predomina es el primero con pérdida de una molécula neutra de olefina. La masa de los iones formados y las olefinas eliminadas permiten determinar la presencia de sustituyentes y el tamaño de las cadenas laterales. La migración de HBγB es más fácil cuando está unido a un carbono secundario. Cuando existen HBγB respecto al centro inductor en ambas cadenas laterales se pueden presentar transposiciones sucesivas (doble reordenamiento).

48 Figura 115. Fragmentación por reordenamiento de McLafferty Transposición radicálica (ciclohexanona) Figura 116. Fragmentación por transposición radicálica. Esta transposición es un proceso secundario posterior a la ruptura en alfa. Es típico de las ciclohexanonas.

49 Transposición de hidrógeno a través de un estado de transición de 4 miembros Figura 117. Fragmentación por transposición de hidrógeno. Este reordenamiento se presenta en moléculas con heteroátomos en enlaces sencillos. Es importante como fragmentación secundaria en éteres, tioéteres, aminas secundarias y terciarias. La procedencia del hidrógeno de la cadena lateral no es exclusivamente de la posición Retroadición 1,4 (Efecto orto) Figura 118. Fragmentación por efecto orto. Se presenta esta transposición sólo en compuestos aromáticos orto-disustituidos, lo que permite diferenciarlos de los isómeros meta y para.

50 Ejemplo 1: El espectro de masas EI (70 ev) del n-octadecano, Figura 119, ilustra las características fundamentales de los espectros de masas de n-alcanos. El pico molecular es débil y se observa una serie típica de picos correspondientes a iones C n H 2n+1 + en m/z = 29, 43, 57, 71, con máxima abundancia alrededor de n = 3 ó 4 la que decrece monotónicamente al aumentar n, que constituyen la denominada serie saturada. Figura 119. Espectro de masas del n-octadecano. Aparecen señalados los picos de la serie saturada y los primeros miembros de la serie insaturada Adicionalmente existe una serie de picos con menor intensidad originada por iones C n H 2n-1 + en m/z = 27, 41, 55, 69, que se deben a reacciones de deshidrogenación y que constituyen la serie insaturada. En presencia de ramificaciones, Figura 120, el pico correspondiente al ión molecular es aún más débil (en estructuras muy ramificadas lo común es que no se observe). Se mantiene los picos de la serie saturada pero con variaciones notables en sus intensidades, reflejando las rupturas preferentes de enlaces C-C en los puntos de ramificación. Se observan también picos con intensidades significativas correspondientes a iones C n H 2 + (C 5 H 10 +, 70 Th). Estos picos están presentes en los espectros de las n-parafinas pero son mucho menos intensos.

51 Figura 120. Espectro de masas del 2-metil-3-etilpentano. Ejemplo 2: Aunque los iones moleculares de los cicloalcanos son más abundantes que aquellos de sus contrapartes acíclicas, sus espectros son frecuentemente más difíciles de interpretar. Para producir un fragmento iónico es necesaria la ruptura de dos enlaces en un anillo, como se ilustra con el ejemplo del ciclohexano, cuyo espectro de masas se muestra en la Figura 121: Figura 121. Fragmentación típica del ciclohexano.

52 La ruptura de un enlace no causa cambios en la masa, produciendo un ión radical distónico. El electrón no apareado en ese ión isomérico es donado para formar un nuevo enlace con el átomo de carbono adyacente, con simultánea ruptura de otro enlace del átomo de carbono α. Aunque el sitio radicálico se ha desplazado, la naturaleza cíclica original causa que esta segunda ruptura de enlace sitúe al electrón no apareado sobre el fragmento cargado, produciendo un ión con electrón no apareado. Figura 122. Espectro de masas IE del ciclohexano. El hecho de que la fragmentación del anillo involucre la ruptura de al menos dos enlaces, contribuye a incrementar el carácter aleatorio de los mecanismos de fragmentación observados en estos compuestos. Sin embargo, correlaciones espectrales cuidadosas pueden dar informaciones estructurales valiosas sobre estas sustancias. Un ejemplo clásico lo constituyen los estudios del esqueleto molecular de compuestos esteroidales mediante espectrometría de masas.

53 Ejemplo 3: La adición de un núcleo aromático a un alcano influye sustancialmente en el espectro de masas. Los picos del ión molecular son mucho más intensos que los de los alcanos correspondientes (estabilización por deslocalización de la carga) y frecuentemente los iones doblemente cargados resultan abundantes. Los procesos de ruptura de anillos aromáticos usualmente requieren energías relativamente elevadas y están acompañados por un alto grado de movimiento de átomos de hidrógeno e incluso de átomos pertenecientes al esqueleto molecular, lo cual da lugar a las series iónicas aromáticas. Los anillos aromáticos sustituidos con cadenas alifáticas sufren reacciones de fragmentación tales como: Ruptura bencílica con reordenamiento que da lugar al ión tropilio: Figura 123. Esquema de fragmentación de ruptura bencílica. El ión tropilio, cuando está presente, normalmente da lugar al pico base del espectro de masas. También puede continuar fragmentándose mediante pérdida de acetileno en cada etapa para dar los iones ciclpentadienilo y ciclopropenilo: Figura 124. Fragmentación del ion tropilio

54 Ruptura directa de enlaces externos al anillo y posterior fragmentación del ión originado: Figura 125. Esquema de la ruptura de radicales alquílicos del benceno. Reordenamiento de hidrógeno: Figura 126. Esquema del reordenamiento de hidrógeno en moléculas aromáticas. En bencenos monosustituidos aparece un pico en m/z = 79, correspondiente a un doble reordenamiento de hidrógeno (complejo σ): Figura 127. Esquema de fragmentación por doble transposición de hidrógeno.

55 Cuando la cadena lateral tiene átomos de hidrógeno en posición reordenamientos de Mc Lafferty: ocurren Figura 128. Esquema de rupturas por reordenamiento de Mc Lafferty. En el espectro de masas del 1-fenilhexano, Figura 130 se pueden observar los picos correspondientes a los mecanismos de fragmentación previamente descritos. Figura 129. Espectro de masas IE de 1-fenilhexano.

56 Ejemplo 4: El pico del ión molecular de un alcohol primario o secundario es muy pequeño y es prácticamente indetectable en el caso de un alcohol terciario. Esto se debe a que si bien la adición de un grupo hidroxilo disminuye la energía de ionización de la molécula, también hace más fácil la descomposición de ésta a través de reacciones iniciadas en el propio grupo hidroxilo ionizado. Una de las vías utilizadas para solucionar el problema de la detección del pico correspondiente al ión molecular de los alcoholes es la preparación de derivados tales como los éteres y ésteres trimetilsilílicos. Es posible que estos derivados en algunos casos no originen picos intensos del ión molecular, pero sí serán intensos los picos en (M- 15) + debido a la facilidad en la pérdida de un grupo metilo. En prácticamente todos los alcoholes ocurre la ruptura homolítica en alfa. Así, los espectros de masas de los alcoholes primarios muestran un pico intenso en m/z = 31 debido al fragmento iónico CH 2 =OH +. Los alcoholes secundarios dan picos importantes en m/z = 45, 59, 73 debidos a iones onio del tipo RHC=OH + y los terciarios en m/z = 59, 73, 87 debidos a RR'C=OH +. En el caso de los alcoholes terciarios el sustituyente más voluminoso se pierde con mayor facilidad: R": sustituyente más voluminoso. Figura 130. Esquema de la fragmentación típica de un alcohol terciario En adición al pico en (M - 1), en los espectros de masas de los alcoholes primarios también se observan picos de baja intensidad en (M - 2) y (M - 3) originados de acuerdo con el mecanismo siguiente:

57 Figura 131. Esquema de fragmentación de un alcohol primario para explicar la formación de los iones M-1, M-2, M-3. Usualmente se puede encontrar un pico importante en (M- 8) en los espectros de masas de los alcoholes primarios principalmente, el cual se debe a la pérdida de agua y se puede interpretar a través del siguiente mecanismo: Figura 132. Esquema de fragmentación de un alcohol primario para explicar la formación de los iones M-8 Debe tenerse presente que a este pico puede contribuir la descomposición térmica sobre superficies calientes de la fuente de ionización sobre todo en alcoholes de elevada masa molecular En los alcoholes cíclicos la pérdida de agua se debe a dos diferentes procesos. El mecanismo principal de deshidratación envuelve la pérdida de un grupo hidroxilo junto con un átomo de hidrógeno, proveniente bien a partir de C 3 o de C 4 para producir iones bicíclicos: Figura 133. Esquema de la fragmentación de un alcohol cíclico.

58 El mecanismo donde participa H 4 ocurre cuando el anillo ciclohexánico del alcohol tiene forma de bote. Los iones bicíclicos sufren una descomposición posterior. La eliminación simultánea de agua y una olefina a partir de un alcohol primario se evidencia en los espectros de masas por un pico en M - (olefina + H 2 O) de acuerdo con el mecanismo siguiente: Figura 134. Esquema de la fragmentación de un alcohol cíclico donde se explica la formación del ion M-46 El ión olefínico continúa fragmentándose mediante eliminaciones sucesivas de etileno. En los espectros de masas de los alcoholes comúnmente se observan picos en m/z = 19 y 33, los cuales se deben a la abstracción de hidrógeno que ocurre durante la fragmentación y que usualmente produce iones tales como H 3 O + y CH 3 OH 2 +. En la Figuras 136 y 137 se muestran los espectros de masas de un alcohol primario y otro terciario. Figura 135. Espectro de masas IE de n-butanol.

59 Figura 136. Espectro de masas IE del terc-butanol. En la Figura 136 (butanol) el ion molecular M + se muestra débil en m/z = 74. Se presenta ruptura homolítica en α con picos en m/z = 31 y 73 y pérdida de agua representada en m/z = 56. En cambio, en la Figura 138 (tercbutanol) el ion molecular está ausente. El pico base formado por ruptura homolítica en α en m/z=59. Ejemplo 5: Los aldehídos y las cetonas sufren la pérdida de un electrón perteneciente a uno de los pares libres del átomo de oxígeno del grupo carbonilo y el ión molecular que se origina de esa forma puede fragmentarse bien a través de la ruptura homolítica en alfa: Figura 138. Esquema de ruptura homolítica en alfa en los grupos carbonilos.

60 o bien por la vía de un reordenamiento del tipo McLafferty cuando existe un hidrógeno en posición γ que pueda migrar: Figura 137. Reordenamiento tipo McLafferty en los grupos carbonilos. Estos mecanismos se encuentran entre los más importantes en los compuestos que poseen grupos carbonilos. El pico correspondiente al ion molecular es intenso en los aldehídos aromáticos debido a la estabilización por resonancia del ion molecular, mientras que esa intensidad decrece rápidamente en los aldehídos alifáticos con más de cuatro átomos de carbono en sus estructuras. También es usualmente intenso el pico en M-1, que se debe a la ruptura homolítica: Figura 138. Esquema de la ruptura homolítica en aldehídos para producir el ion M-1. Los aldehídos generalmente dan lugar a un pico intenso en m/z = 29 (H-C O + ) debido a la ruptura homolítica en alfa del enlace C-C. No obstante, en el caso de aldehídos de cadena larga la intensidad de este pico es aproximadamente el 40% de la correspondiente al pico de base, que se encuentra en M-29 y que tiene su origen en la ruptura heterolítica siguiente : Figura 139. Esquema de la formación del pico de base M-29 en aldehidos.

61 Este tipo de ruptura heterolítica también es común en algunos compuestos aromáticos en los cuales la estabilización por resonancia del ión resultante hace que muchas veces el pico en M - 29 sea el base en el espectro de masas. En el caso de aldehídos con cuatro o más átomos de carbono en una cadena recta, ocurre un reordenamiento de McLafferty que da origen a los picos en m/z = 44 o 58 o 72 en dependencia del sustituyente en el átomo de carbono α de la cadena: Figura 140. Esquema del reordenamiento tipo McLafferty producido en aldehidos. Otros picos de utilidad estructural se encuentran en M -18 (perdida de H 2 O), M-43 (pérdida de CH 2 =CH-O ) y M-44 (pérdida de CH 2 =CH-OH). En la medida en que la cadena de átomos de carbono se hace mayor, el patrón del hidrocarburo se torna dominante en el espectro de masas. En la Figura 143 se muestra el espectro de masas de un aldehido. Figura 141. Espectro de masas IE del 3-fenil-2-metil-2-Propenal.

62 De acuerdo con el espectro anterior se muestra que los aldehídos aromáticos se caracterizan por un pico correspondiente al ión molecular intenso M + (m/z=146) y por un pico en (M-1) + de m/z=145 que es también intenso que forma el pico de base del espectro. A partir del ión molecular y del (M -1) + se elimina CO para dar los iones de m/z=118 y m/z=117 respectivamente. El ion m/z=131 y m/z=128 se forman por la eliminación de un CH 3 y de H 2 O del ion molecular respectivamente. El ion m/z=103 el cual se forma por la eliminación de 43 unidades que corresponden a CH 2 =CHO. Los iones débiles m/z=58, m/z=57, m/z=72 producidos por los reordenamientos tipo McLafferty. Los correspondientes iones fragmento del radical fenilo o bencilo m/z=91 ion tropilio, m/z=77, m/z=65, m/z=51 y m/z=39. Si quiere observar animaciones de la espectrometría de masas puede dirigirse a la siguiente dirección electrónica:

63 Ejercicios (Unidad 3 Capítulo 7) 1. El esquema básico para un espectrómetro de masas con dos analizadores y de control de retroalimentación llevado a cabo por un sistema de datos es: a. Fuente de iones; introducción de la muestra; analizador de masas 1; detector; analizador de masas 2; amplificador de la señal; espectro; computador. b. Introducción de la muestra; analizador de masas 1; fuente de iones; amplificador de la señal; analizador de masas 2; espectro; computador. c. Analizador de masas 1; introducción de la muestra; amplificador de la señal; fuente de iones; analizador de masas 2; computador; espectro. d. Introducción de la muestra; fuente de iones; analizador de masas 1; analizador de masas 2; amplificador de la señal; computador; espectro. 2. Calcular la energía cinética que adquiriría un ion monovalente (z=1) si fuese acelerado mediante un potencial de 5*10 2 V en una fuente de impacto de electrones. a. 1,6 * b. 6,1 * c. 1,8 * d. 8,0 * Una ventaja de utilizar una fuente de impacto de electrones para producir la ionización de una muestra en espectrometría de masas es: a. Identificación inequívoca del analito en cuestión.

64 b. Corrientes de iones elevadas y extensa fragmentación. c. Selección inequívoca entre varios fragmentos lo que por ende produce a la técnica una alta resolución. d. Alto poder de detección con una cantidad pequeña de muestra lo que produce una alta sensibilidad. 4. Una transposición tipo McLafferty se puede producir en la siguiente molécula: a. CH 3 CH 2 OCH 3 b. CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 COCH 3 c. CH 3 CH 2 COOH d. CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 OH 5. El siguiente espectro de masas pertenece un compuesto de fórmula condensada C 9 H 10 O. Dicho compuesto es: a. 4-(2-propenil)-fenol.

65 b. Bencil metil cetona. c. 1-fenil-1-propanona. d. 2,4-dimetilbenzaldehido.

66 CAPITULO 8: ESPECTROSCOPÍA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR Introducción Aunque la falta de vocalización al hablar o una parálisis parcial pueden ser simplemente indicios de un ataque o una migraña, también pueden ser síntomas de un infarto cerebral. Los infartos cerebrales son la tercera causa de muerte en los Estados Unidos y una de las principales causas de discapacidad grave. Más de 3 millones de personas que han sobrevivido a un infarto cerebral han quedado incapacitadas para trabajar o cuidar de sí mismos. Por esta razón, cuando un paciente entra en una sala de urgencias con estos síntomas, los médicos deben realizar un diagnóstico crucial sin perder un segundo. Aunque el número es aún reducido, son cada vez más los hospitales que pueden realizar una resonancia magnética ultrarrápida del cerebro del paciente mediante una técnica denominada resonancia magnética funcional. En tan sólo unos minutos, el escáner revela no sólo si el paciente ha sufrido un infarto cerebral sino también qué parte del cerebro corre peligro. La urgencia de este diagnóstico no se debe subestimar. Como dijo una vez un neurólogo "Tiempo es cerebro. Cuanto antes se realice el diagnóstico y comience el tratamiento, mayor será la parte del cerebro que se podrá salvar." Esta herramienta para el diagnóstico de infartos cerebrales representa la primera aplicación clínica importante de la resonancia magnética funcional. Desde principios de la década de 1990, la resonancia magnética funcional ha ayudado a los investigadores en neurología a aprender más sobre el funcionamiento del cerebro, ya que les permite observar los cambios que se producen en la composición química de distintas zonas, así como los cambios que se producen en la circulación de los fluidos en cuestión de segundos o minutos. La resonancia magnética funcional también se puede utilizar para comprender mejor la fisiología de otros órganos. La resonancia magnética convencional, que proporciona imágenes detalladas de la estructura anatómica, también cumple una función esencial en la observación de otras partes del cuerpo. Permite detectar síntomas de esclerosis arterial en el corazón, así como hernias de disco, cartílagos rotos y tumores en la columna vertebral, los huesos y las articulaciones. En todos estos casos, la resonancia magnética se realiza sin necesidad de dolorosas intervenciones. Las investigaciones básicas que dieron lugar a la resonancia magnética y a la

67 resonancia magnética funcional se iniciaron en una serie de laboratorios de física en las primeras décadas del siglo XIX. El siguiente artículo describe el camino, con frecuencia tortuoso, que se ha recorrido durante los últimos 70 años desde el trabajo que realizaron una serie de científicos que simplemente investigaban la naturaleza de la materia hasta las aplicaciones actuales que permiten en última instancia salvar numerosas vidas.

68 Lección 35: Teoría de la Resonancia magnética nuclear Señales de núcleos vibratorios Las imágenes del cerebro humano obtenidas por resonancia magnética funcional representan el avance más reciente en un campo que nació hace un poco más de 20 años. Actualmente, los científicos utilizan la resonancia magnética funcional para estudiar los cambios que se producen en la actividad del cerebro de pacientes que han sufrido un infarto cerebral y que comienzan a recuperar aptitudes perdidas, con el objetivo de desarrollar tratamientos y terapias más eficaces. La resonancia magnética funcional permite investigar el desarrollo de las redes neuronales de los sistemas motriz, visual, auditivo y del habla de un bebé al escuchar la voz de su madre. También puede ayudar a comprender las sutiles anomalías en la activación del cerebro en niños con problemas de falta de atención por hiperactividad y los problemas de memoria de pacientes con esquizofrenia. El fenómeno que hace posible todo esto se denomina resonancia magnética nuclear y el camino hacia su descubrimiento comenzó con las primeras investigaciones sobre la naturaleza del átomo. Aunque el concepto de átomo se remonta hasta la Grecia antigua, ha sido en los últimos cien años aproximadamente cuando se ha adquirido un conocimiento objetivo de su existencia y de las partes que lo forman. En 1897, el físico J. J. Thomson, de la Universidad de Cambridge (Inglaterra), descubrió el electrón. Durante las dos décadas siguientes, una serie de destacados físicos, entre los que se incluyen Max Planck, Ernest Rutherford, Niels Bohr, Erwin Schrodinger y Werner Heisenberg, se basaron en los trabajos de unos y otros para avanzar en el estudio de la estructura y propiedades del átomo y las partículas atómicas. Con ello, revolucionaron la física y elaboraron una teoría y un lenguaje nuevos conocidos como mecánica cuántica.

69 Los experimentos de I. I. Rabi En 1929, Isidor Isaac Rabi comenzó a impartir clases de mecánica cuántica en la Universidad de Columbia. Durante la década siguiente, su equipo de investigación utilizó una técnica denominada resonancia de haces moleculares para estudiar las propiedades magnéticas de los átomos y las moléculas. En la época en la que Rabi realizó estos experimentos, los físicos sabían que los núcleos atómicos estaban compuestos por dos tipos de partículas: protones con carga positiva y partículas neutras denominadas neutrones. Alrededor de este núcleo formando como una especie de nube se encontraban los electrones, cuya carga era negativa. Los físicos también habían descubierto que los electrones, los protones, los neutrones y, en muchos casos, los núcleos en sí, se comportaban como si giraran sobre su eje, al igual que los planetas. Esto llevó al descubrimiento de una propiedad denominada momento angular de espín, que cuenta con magnitud y dirección. Una partícula giratoria de este tipo genera un campo magnético y un "momento magnético" asociado y actúa como una pequeña barra magnética con polos positivo y negativo. Si se coloca en un campo magnético externo potente, el "momento magnético" de un núcleo tiende a alinearse con (en paralelo) o contra (en sentido antiparalelo) el campo externo. La alineación paralela corresponde a un estado de energía inferior a la alineación antiparalela. Durante la década de 1930, Isidor Isaac Rabi y su grupo de investigación de la Universidad de Columbia desarrollaron la resonancia magnética de haces moleculares como técnica para estudiar las propiedades magnéticas y la estructura interna de las moléculas, los átomos y los núcleos, trabajo por el que le fue otorgado el premio Nobel de física en (Barton Silverman, The New York Times). Los experimentos de Rabi consistían en hacer pasar un haz de moléculas de cloruro de litio a través de una cámara de vacío y manipular el haz con distintos campos magnéticos. Al estudiar cómo afectaba el campo magnético a la trayectoria de las moléculas, Rabi pudo adquirir nuevos conocimientos acerca de las magnitudes del momento magnético del núcleo. Rabi previó que, con el estímulo apropiado, los momentos magnéticos de los núcleos podían invertirse o cambiar su orientación en relación al campo magnético. En 1937, siguiendo los consejos del físico holandés Cornelius J. Gorter, Rabi y su equipo añadieron un nuevo elemento a sus experimentos: sometieron un haz molecular a ondas de radio (señales electromagnéticas dentro del intervalo de la radiofrecuencia o la radiodifusión) mientras variaban la potencia del campo magnético.

70 Figura 142. Fenómeno de precesión La resonancia magnética utiliza algunas propiedades fundamentales de los núcleos atómicos, en particular los "momentos magnéticos", ya que se parecen a diminutas barras magnéticas con polos: positivo y negativo. Cuando se colocan en un campo magnético externo potente, la dirección del momento magnético "oscila" o cambia según la dirección del campo con una frecuencia proporcional a la fuerza del campo externo. La resonancia magnética se produce cuando la fuerza del campo magnético se manipula hasta que la frecuencia de precesión de la partícula coincide con la de la frecuencia de radio aplicada. Esto hace que el momento magnético de la partícula cambie de orientación en relación al campo magnético externo, una señal detectable que revela la estructura interna y la actividad de cualquier cosa, desde elementos químicos hasta el cerebro humano. Rabi y su equipo ajustaron la potencia del campo magnético hasta hacer que los momentos magnéticos de los núcleos se invirtieran, lo que sucede cuando la frecuencia de la señal de radio coincide con la frecuencia precesional característica de los núcleos. Cuando se produce esta coincidencia (la frecuencia de resonancia), un núcleo absorbe energía de la señal de radio igual a la diferencia entre sus dos estados de energía y, por tanto, salta al estado superior. También se produce una inversión cuando un núcleo emite dicha energía al pasar de nuevo del estado superior de energía al inferior. Rabi podía detectar la transición tanto si el núcleo saltaba al estado de energía superior como si descendía al inferior. Esta técnica se denomina en la actualidad resonancia magnética o, de forma más precisa, resonancia magnética de haces moleculares.

71 El equipo de Rabi empleó esta nueva técnica para deducir detalles hasta ahora desconocidos acerca de las interacciones internas de las moléculas. Descubrieron una serie de resonancias dentro de una molécula simple que les permitió "ver" cómo los átomos individuales están unidos entre sí y cómo sus núcleos se ven afectados por los átomos vecinos. Estos extraordinarios experimentos y el desarrollo de la resonancia magnética de haces moleculares como técnica de estudio de las propiedades magnéticas y la estructura interna de moléculas, átomos y núcleos le valieron a Rabi el premio Nobel de física en Varios meses después de realizar estos experimentos, el equipo de Rabi intentó una variación: manipular la frecuencia de radio en lugar de la potencia del campo magnético. Este método, que amplía el espectro de las señales resultantes al igual que se amplía el espectro de la luz visible al pasar por un prisma, es la base de la espectroscopia de radiofrecuencias, que revolucionaría el análisis químico y resultaría ser un componente esencial en el desarrollo de las exploraciones mediante resonancia magnética como herramienta de diagnóstico médico Un tipo diferente de resonancia Aunque el comienzo de la Segunda Guerra Mundial interrumpió las investigaciones sobre resonancia magnética nuclear, en los años posteriores a la guerra se produjo un gran número de avances. En Estados Unidos, dos grupos de físicos se propusieron por separado desarrollar un método más simple para observar la resonancia magnética en los núcleos de moléculas de líquidos y sólidos en lugar de en moléculas aisladas como en los experimentos de Rabi. Edward Purcell, de cuyo equipo formaban parte Henry Torrey y Robert Pound, fue el encargado de dirigir la investigación de la Universidad de Harvard y Felix Bloch, de cuyo equipo formaban parte William Hansen y Martin Packard, fue el encargado de dirigir la investigación de la Universidad de Stanford. En 1945, dos grupos de investigación independientes, uno dirigido por Edward Purcell de la Universidad de Harvard y el otro por Feliz Bloch de la Universidad de Stanford, detectaron "resonancia magnética nuclear en materia condensada". En 1952, Bloch y Purcell compartieron el premio Nobel de física por estos experimentos históricos. (Harvard University News Office, Cambridge, Massachusetts y Stanford University News Service). Tanto Purcell como Bloch decidieron estudiar el protón, el núcleo del átomo de hidrógeno (H). Al estar compuesto por un único protón, el núcleo del hidrógeno posee un momento magnético considerable. El hidrógeno se convertiría en el

72 elemento más importante para la resonancia magnética debido a sus propiedades nucleares favorables, su presencia casi universal y su abundancia en el cuerpo humano como parte del agua (H2O). El equipo de Purcell utilizó un bloque de 90 g de parafina como fuente de hidrógeno, mientras que el equipo de Bloch empleó unas gotas de agua contenidas en una esfera de cristal. Los dos equipos de investigación colocaron las muestras en un campo magnético y esperaron a que los núcleos alcanzaran un equilibrio magnético y térmico, un estado magnetizado en el que los núcleos se alinean ligeramente más en paralelo al campo externo que en sentido antiparalelo. A continuación, al igual que hizo el equipo de Rabi, los equipos de investigación aplicaron ondas de radio para provocar que los momentos magnéticos de los núcleos de las muestras se invirtieran. Purcell y Bloch esperaban detectar resonancia magnética al observar la energía que los núcleos en precesión absorbían o cedían al campo de frecuencia de radio cuando se propiciaban las condiciones de resonancia. En 1945, ambos grupos lograron crear, con tres semanas de diferencia, las condiciones necesarias para observar el fenómeno. Sus experimentos demostraron lo que técnicamente se conoce como resonancia magnética nuclear en materia condensada (actualmente abreviado como RMN), para distinguirlo del descubrimiento de Rabi, la resonancia magnética de haces moleculares. En 1952, Bloch y Purcell compartieron el premio Nobel de física por estos experimentos. Las investigaciones en resonancia magnética nuclear siguieron avanzando. Los investigadores que formaban parte de los laboratorios de Purcell y Bloch pronto comenzaron a utilizar la espectroscopia de la resonancia magnética nuclear para investigar la composición química y la estructura física de la materia. Uno de los primeros avances en este sentido fue la medición de las cantidades denominadas tiempos de relajación, T1 y T2. T1 es el tiempo que tardan los núcleos de las muestras experimentales en volver a su alineación original; T2 es la duración de la señal magnética obtenida de la muestra. Uno de los primeros alumnos de Purcell en graduarse, Nicolaas Bloembergen, que había llegado a Harvard desde Holanda en 1946, jugó un papel decisivo junto a Pound y Purcell en esta investigación. Bloembergen fue el primer investigador en medir los tiempos de relajación de forma precisa y, junto a Purcell y Pound, también midió el modo en que estos tiempos cambiaban en gran variedad de líquidos y sólidos. Afortunadamente para futuras investigaciones y aplicaciones, los tiempos de relajación pueden medirse en segundos o fracciones de segundo, convirtiendo a la resonancia magnética nuclear en una herramienta de investigación enormemente práctica. Bloembergen, Purcell y Pound publicaron un artículo en 1948 que ejerció una gran influencia en varias ramas de la física. La manipulación de los tiempos de

73 relajación ha proporcionado un método de gran eficacia en química y biología para analizar la estructura de las moléculas y, como otros investigadores descubrirían más tarde, resulta esencial para producir el contraste necesario para la obtención de imágenes de tejidos del organismo humano Cronología Esta cronología muestra la cadena de investigaciones que condujeron al desarrollo de la resonancia magnética y la resonancia magnética funcional Michael Faraday investiga las propiedades magnéticas de la sangre seca Linus Pauling y Charles D. Coryell descubren que el estado magnético de la hemoglobina cambia según su estado de oxigenación I.I. Rabi y sus colegas desarrollan la resonancia magnética de haces moleculares al hacer pasar un haz de moléculas de cloruro de litio a través de un campo magnético y, a continuación, someterlo a ondas de radio Con tres semanas de diferencia, los grupos de investigación dirigidos por Edward Purcell y Felix Bloch demuestran de forma independiente el fenómeno conocido como "resonancia magnética nuclear en materia condensada" Nicolaas Bloembergen, Edward Purcell y Robert Pound publican un estudio sobre la "relajación magnética nuclear" Erwin Hahn descubre el fenómeno del eco de espín en las mediciones de resonancia magnética nuclear. Década de 1960

74 Richard Ernst y Weston Anderson aplican el análisis de Fourier a las señales de impulso para aumentar la sensibilidad de la resonancia magnética nuclear Godfrey Hounsfield construye el primer escáner de tomografía computerizada, la base de casi todos los sistemas de obtención de imágenes que se usan en la actualidad Paul Lauterbur combina la idea del gradiente con la idea del escáner de tomografía computarizada para realizar varias proyecciones y reconstruirlas para obtener la primera imagen por resonancia magnética Peter Mansfield concibe la técnica ecoplanar, capaz de explorar todo el cerebro en unos segundos Mansfield y sus colegas de Inglaterra publican la primera imagen de un dedo humano obtenida por resonancia magnética Seiji Ogawa detecta variaciones en la oxigenación del tejido local al utilizar contraste dependiente del nivel de oxígeno de la sangre John W. Belliveau, Peter Bandettini y Seiji Ogawa publican de forma independiente sus estudios sobre la respuesta cerebral a la estimulación sensorial para los que utilizan imágenes obtenidas por resonancia magnética funcional.

75 Lección 36: Resonancia magnética nuclear de protones La Resonancia Magnética Nuclear, puede ser considerada como una herramienta que permite obtener una gran cantidad de información sobre la estructura molecular. Fue desarrollada en la década de los cuarenta ( ), en forma simultánea, por dos grupos de investigadores en física teórica: H. C. Torrey y R. V. Pound, dirigidos por E. M. Pursell en la universidad de Harvard y W. W. Hansen junto con F.Bloch en la Universidad de Stanford Teoría básica de la resonancia magnética nuclear de protones ( 1 H-NMR) Los núcleos de numerosos átomos presentan el fenómeno de RESONANCIA MAGNETICA cuando son colocados en un campo magnético y a su vez irradiados con energía proveniente de un oscilador de radio frecuencia. Sin embargo, solo aquellos núcleos atómicos que poseen la propiedad física llamada espín (I) diferente a cero, mostrarán absorción y emisión de energía en esas condiciones. Los núcleos que tengan valores de masa (M) y/o número atómico (Z) impar presentarán valores de espín (I) útiles en espectroscopia de resonancia magnética nuclear. Así, por ejemplo, un átomo que posea: Masa atómica (M) Número atómico (Z) Espín Impar Par o impar 1/2, 3/2, 5/2 Par Impar 1, 2, 3,.. Sin embargo, si (M) y (Z) son ambos pares, el valor del número de espín (I) será cero, y ellos no presentarán espectro de resonancia magnética. Como ejemplo de núcleos atómicos del primer grupo están los isótopos:

76 Isótopo Espín 1 H 1/2 13 C 1/2 17 F 1/2 31 P 1/2 etc. etc. En el segundo grupo están los isótopos del nitrógeno (M = 14), y flúor (M = 18), etc. Entre aquellos con número de espín = 0, están el isótopo del oxígeno (M = 16) y el carbono (M = 12), etc. como los más importantes para la química orgánica El espín y el fenómeno de la resonancia magnética nuclear Haciendo una gran simplificación, puede considerarse un núcleo atómico (por ejemplo: el núcleo del átomo de hidrógeno), como una esfera, con una carga positiva distribuida sobre su superficie de una manera no homogénea, y poseyendo un movimiento de rotación simple alrededor de un eje imaginario, que lo atraviesa de lado a lado como se ve en la Figura 145. Figura 143. Dibujo imaginario de un núcleo de hidrógeno girando en torno a un eje Estos núcleos, cuando se les coloca en un campo magnético intenso, crean su propio momento magnético, y se comportan en consecuencia como un imán, orientándose espacialmente según la dirección del campo magnético externo H 0 en (2*I+1) modos, donde I es el valor del espín. Para el núcleo de hidrógeno o protón con un valor de espín I = 1/2, su momento magnético i tomará solo dos orientaciones, una a favor y otra en contra del campo magnético externo H 0.Estas orientaciones nucleares están asociadas a niveles discretos de energía, (niveles cuánticos) correspondiendo por tanto a

77 aquella orientación en igual sentido al campo magnético principal al nivel de baja energía. Figura 144. Separación de niveles de energía cuánticos para protones en un campo magnético de intensidad H 0 La diferencia de energía E entre ambos niveles puede expresarse matemáticamente como: ( ) ( ) Ecuación 3.5 Donde es la constante de Planck ( ) ( ) ( ) ( ) Ecuación 3.6 es la intensidad del campo magnético externo o del instrumento y ( ) es la frecuencia de la radiación necesaria para producir la excitación de un protón de un nivel de energía al otro. La separación entre los niveles es proporcional a la intensidad del campo magnético aplicado y por lo tanto si: ( ) Ecuación 3.7 En ausencia del campo magnético, los espines de los núcleos involucrados estarán orientados al azar y presentarán estadísticamente un valor semejante a cero y un aspecto semejante al de la Figura 147.

78 Figura 145. Orientación de espines, momentos magnéticos nucleares y distancia entre niveles de energía de los núcleos al variar la magnitud del campo magnético H 0. El vector momento magnético (i), que coincide con el eje de rotación imaginario del protón (espín), forma un ángulo con las líneas de fuerza del campo magnético H 0. La representación de esta configuración puede ser lograda examinando la semejanza que hay entre un núcleo atómico colocado en un campo magnético y un trompo casero en un campo gravitacional: Si usted tiene la ocasión de observar bailar un trompo, se dará cuenta que este nunca baila con su eje de rotación perpendicular a la superficie de la mesa o del piso, y forma un ángulo con la línea de acción de las líneas de fuerza del campo gravitacional G 0. orbita de precesión H 0 4a G 0 trompo girando Figura a. Trompo bailando en un campo gravitacional G 0 ; 4b. Protón girando en un campo electromagnético H 0 Ahora, si uno fija la mirada en la cabeza del trompo, se ve claramente que este describe una órbita circular, marcando un plano perpendicular a la dirección del campo magnético H 0. El desplazamiento circular de la cabeza del trompo sobre esa superficie perpendicular se conoce como movimiento de precesión. 4b nucleo con espín

79 El número de veces que la cabeza del trompo pasa por un punto imaginario "P" y por unidad de tiempo, es su frecuencia de precesión. Una situación similar se observa para el caso de un protón inmerso en un campo magnético H o. El extremo de su vector magnético (i), describe también una órbita de precesión con una frecuencia de paso del orden de los de ciclos por segundo o 60 Mhz al estar sometido a una intensidad de campo magnético H 0 de aproximadamente Gauss ó 1.4 T. ( T = 1 Tesla = Gauss). En resumen, un protón colocado en un campo magnético externo de intensidad H 0 estará precesionando a una frecuencia v(i), según la relación: ( ) ( ) Ecuación 3.8 Para excitarlo desde el nivel cuántico de menor energía al de mayor energía, tendrá que ser irradiado con una energía de frecuencia v(o) igual a: ( ) Ecuación 3.9 La condición necesaria y suficiente para que el núcleo entre en resonancia, y se produzca un intercambio de energía entre un núcleo y el equipo es: ( ) ( ) Ecuación 3.10 Dicho de otra manera, el intercambio de energía se producirá cuando la frecuencia de la radiación generada por el oscilador del instrumento v(o), sea idéntica a la frecuencia de precesión natural v(i) del núcleo de hidrógeno.

80 Figura 147. Representación simplificada de la transferencia de energía entre un protón y el instrumento