Métodos y técnicas clásicas aplicadas al estudio de la regulación de la expresión de genes

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Rocío Río Navarrete
hace 6 años
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1 BIOQUIMICA Biología molecular 2018 Bases Moleculares de la regulación de la Expresión génica en eucariontes Métodos y técnicas clásicas aplicadas al estudio de la regulación de la expresión de genes Bibliografía: Lodish, Molecular Cell Biology, 4ta-7ma Edición Watson, J. Molecular Biology of the gene, 5ta Edición, cap 17. Epigenetics and MicroRNAs PA L SÆTROM, OLA SNØVE JR, AND JOHN J. ROSSI. (Pediatr Res 61: 17R 23R, 2007). DOI: /pdr.0b013e e Kouzarides, T. Chromatin Modifications and their function, CELL (2007) 128: Karp s Cell And Molecular Biology 8th Edition ebook Free Download: CAP 12 Protocol Plant Gene Transfer and Expression Protocols. Volume 49 of the series Methods in Molecular Biology pp Nuclear Run-On Transcription Assays. John Gatehouse, Andrew J. Thompson. DOI: / X:229. The RNase Protection Assay. MF. Carey, CL. Peterson and ST. Smale. Cold Spring Harb Protoc. DOI: /pdb.prot G-less Cassette In Vitro Transcription Using HeLa Cell Nuclear Extracts. MF. Carey, CL. Peterson and ST. Smale. Cold Spring Harb Protoc; doi: /pdb.prot5387. Nuclear Run-on Assays. N Bates, H Hurst. ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES 2002, DOI: /npg.els Nuclear Run-On Assay. ST. Smale. Cold Spring Harb Protoc; doi: /pdb.prot5329 Edgardo Guibert

2 Organización de las clases de regulación 1: Bloque generalidades 2: regulación del inicio de la transcripción 3: organización de la cromatina 4: procesos post transcripcionales 5: control de inicio de síntesis proteica 6: epigenesis 7: integración BM-bioquimica2018 Guibert E 2

Expresión diferencial de genes Todas las células en un organismo son genéticamente iguales Diferencias en tipos celulares resultan de expresión diferencial de genes: La

3 Expresión diferencial de genes Todas las células en un organismo son genéticamente iguales Diferencias en tipos celulares resultan de expresión diferencial de genes: La expresión de diferentes genes por células con un mismo genoma. Anormalidades en la expresión de genes lleva a patologías. La expresión de genes se regula a diferentes niveles 3

4 Concepto actual de regulación de la expresión de genes 2 características claves: Procesos asociados bifuncionalidad de los pre-mrnas ELEMENTOS CIS: Secuencia de bases del ADN ELEMENTOS TRANS: Proteínas de unión al ADN -30 a -35pb 4

5 Organización de las clases de regulación 1: Bloque generalidades 2: regulación del inicio de la transcripción 5

En los genes de las inmunoglobulinas en los linfocitos B, hay un enhancer dentro del segundo intrón pero funciona solo en linfoc B.

6 Características de los enhancers Se han encontrado a más de 50 kilobases del promotor que controlan. Pueden estar: hacia el extremo 5 o hacia el extremo 3 del promotor, dentro de un intrón o de un exón o hasta después del último exón. Algunos son específicos de un tipo celular. En los genes de las inmunoglobulinas en los linfocitos B, hay un enhancer dentro del segundo intrón pero funciona solo en linfoc B. Hay genes que no presentan ni caja TATA, ni Iniciador Se presenta generalmente en genes de mantenimiento (housekeeping) Es una región de 20 a 200 pares de bases Da origen a mensajeros con extremos 5 múltiples. Son genes que generalmente se transcriben a bajas tasas. Presentan las ISLAS GC regiones de unas 200pb con más de un 55% de CpG y existen en el 45% de los promotores en mamíferos. Este sitio es reconocido por un factor de transcripción llamado SP1 (specific promoter 1) y susceptible de modificaciones químicas (metilación) 6

7 Esquema lineal de la representación del control de genes eucariotas Ensayos de expresión que sirven para detectar regiones regulatorias de genes eucariotas 7

Elementos TRANS (proteínas, factores de transcripción) que actúan

PROT-PROT: Dominio ácido (aa ácidos), Dominio rico en Prolina y

de acuerdo a distintos tipos estructurales Homeodomain proteins

8 Elementos TRANS (proteínas, factores de transcripción) que actúan sobre secuencias regulatorias del ADN 1) DOMINIOS de interacción PROT-PROT: Dominio ácido (aa ácidos), Dominio rico en Prolina y Dominio Básico (aa básicos) Dominios de Unión a DNA: se clasifican de acuerdo a distintos tipos estructurales Homeodomain proteins Zinc-finger proteins Leucine-zipper proteins Helix-loop-helix proteins Ring 8

Control of COP1 in Arabidopsis Helix-loop-helix motif GT-element binding protein of phytochromeregulated genes Leucine zipper motif Fos &

1 Basic zipper (bzip) motif G box factors of phytochrome-regulated genes, others RING Really Interesting New Gene : 40 to 60 residuos

9 Helix-turn helix motif e.g. anthocyanin biosynthesis regulation, especially famous for control of homeotic genes Zinc finger motif -- several types in this family Control of COP1 in Arabidopsis Helix-loop-helix motif GT-element binding protein of phytochromeregulated genes Leucine zipper motif Fos & Jun in animals TZ Table 14.1 Basic zipper (bzip) motif G box factors of phytochrome-regulated genes, others RING Really Interesting New Gene : 40 to 60 residuos conservados en un entorno de dominio rico en cisteínas. Dominio de unión a zinc y un sistema de ligación (Ubiquitina). N-terminal region of BRCA1, con dos variantes: C3HC4 y C3H2C3, involucrados en interacciones Proteína-Proteína. Una asociación es con BARD1, la cual se distorsiona en mutaciones del BRCA1, generando cambios en el mecanismo de reparación del DNA. 9

10 EMSA e sayo de a io e la ovilidad ele torforéti a o Gel Shift Assay Provee información acerca de las interacciones DNA-Proteínas. Método in vitro para el análisis de interacciones ADN-Proteínas de interés. El ADN es generalmente una región regulatoria. La proteína es, generalmente, un factor de transcripción. Se resuelve en un gel de Poliacrilamida en condicones desnaturalizantes DNA + proteina + Ab PM DNA DNA + [Protein] + DNA+Prot+AB Ab DNA + proteina DNA solo

11 Análisis de Interacción ADN-Proteína: cambio en la movilidad electroforética o de geles de retardo Ensayo de competición para analizar especificidad y fuerza de la interacción DNA-Proteína Requiere que exista SIEMPRE DNA en exceso

Ensayo de protección a la DNAsa o footprint o experimento de

proteínas La PROTEINA debe estar SIEMPRE en exceso respecto del

proteína interacciona (regulación trans) * Protección a DNAsa o

12 Ensayo de protección a la DNAsa o footprint o experimento de huellas: Identifico secuencias del ADN que interaccionan con proteínas La PROTEINA debe estar SIEMPRE en exceso respecto del DNA * EMSA o cambio de banda o retardo en geles: determina qué proteína interacciona (regulación trans) * Protección a DNAsa o ensayo de huellas: determina la secuencia del ADN que interacciona (regulación cis)

13 * EMSA o cambio de banda o retardo en geles: determina qué proteína interacciona (regulación trans) * Protección a DNAsa o ensayo de huellas: determina la secuencia del ADN que interacciona (regulación cis)

14 Organización de las clases de regulación 1: Bloque generalidades 2: regulación del inicio de la transcripción 3: organización de la cromatina 14

La expresión de genes es regulada a diferentes niveles.

con otros componentes nucleares. Lo más actual es el concepto de cromosomas compartamentalizados en territorios definidos.

Esto es conocido como concepto topológico de la regulación de genes.

15 La expresión de genes es regulada a diferentes niveles. Probablemente, uno de los menos conocidos es cómo la organización nuclear influencia la expresión de genes, a través de la organización y arreglos de la cromatina y con las interacciones dinámicas con otros componentes nucleares. Lo más actual es el concepto de cromosomas compartamentalizados en territorios definidos. La localización de un gen dentro de un territorio cromosomal influencia su acceso a la maquinaria responsable de las funciones nucleares, como trascripción y splicing, o reparación del ADN. Esto es conocido como concepto topológico de la regulación de genes. * Las interacciones de largo alcance de la cromatina pueden ocurrir sobre muchos millones de bases, entre regiones del mismo cromosoma (cis) o entre regiones de diferentes cromosomas (trans). * Muchos eventos que incluyen grupos (clusteres) de cromatina implican interacciones preferenciales entre los loci genómicos y son específicos para cada tipo celular, lo que indica un papel funcional de la organización del genoma en la regulación de la expresión génica. * Muchos mecanismos están implicados en el establecimiento de la organización global, incluyendo la transcripción por conjuntos específicos de factores de transcripción o represión de genes entre dominios similares desde el punto de vista epigenético. Regulación de la estructura de la cromatina Genes que poseen la cromatina altamente empaquetada generalmente no se expresan Las modificaciones químicas a las histonas y al DNA influencian (generan cambios) tanto al DNA como a la estructura de las histonas 15

16 Enhancer Promoter Control elements Albumin gene Crystallin gene Available activators LIVER CELL NUCLEUS Available activators LENS CELL NUCLEUS Albumin gene expressed Albumin gene not expressed (a) Liver cell Crystallin gene not expressed Crystallin gene expressed (b) Lens cell 16

MODIFICACIONES EN LAS HISTONAS - Se modifican residuos en las colas y en los dominios globulares - El momento de la aparición de las modificaciones depende de señales celulares - Las modificaciones

1) MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE LAS HISTONAS 2) COMPLEJOS REMODELADORES DE LA CROMATINA ATP-dependientes Como actúan las modificaciones de histonas? 1) Eliminación de contactos ADN-histonas.

desencadenar una determinada acción biológica o establecer una determinada estructura en una región del genoma 3) A su vez impiden que se recluten otras proteínas o complejos con acción antagónica al

18 MODIFICACIONES EN LAS HISTONAS - Se modifican residuos en las colas y en los dominios globulares - El momento de la aparición de las modificaciones depende de señales celulares - Las modificaciones son dinámicas por medio de enzimas que remueven las modificaciones Cambios en el DNA y en las Histonas SNF/SWI Complejos remodeladores de la cromatina Cómo se remodela la cromatina? 1) MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE LAS HISTONAS 2) COMPLEJOS REMODELADORES DE LA CROMATINA ATP-dependientes Como actúan las modificaciones de histonas? 1) Eliminación de contactos ADN-histonas. Ej.: acetilación (neutralización de cargas básicas de lisinas) 2) 2) Reclutamiento de proteínas que reconocen una modificación específica, a través de dominios especializados Y estas proteínas podrán desencadenar una determinada acción biológica o establecer una determinada estructura en una región del genoma 3) A su vez impiden que se recluten otras proteínas o complejos con acción antagónica al mismo residuo o vecinos La hipótesis del Codigo de Histonas propone que: combinaciones específicas de modificaciones, y el orden en el cual ocurren estas modificaciones determinan la configuración de la cromatina e influencian la transcripción de genes.

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