TEMA 7: EL NÚCLEO. Estructura:

Transcripción

1 TEMA 7: EL NÚCLEO Estructura: 1) Envoltura nuclear Tiene complejos donde se controlan molécs que entran y salen del núcleo. En cara interna: lámina nuclear, formada por filamentos intermedios, y cromatina. En parte citosólica, prolongaciones que forman complejos del poro nuclear, con simetría octogonal con prots distintas (nucleoporinas; existen más de 30) y un canal central (hacia exterior filamentos, hacia interior filamentos que se unen en una cesta nuclear). Estos macrocomplejos tienen gran tamaño. La parte interna del canal ocupada por dominios filamentoso llamadados FG por repeticion de fenilalanina y glicina => entramado que regula flujo de molécs en ambas direcciones: para atravesarlo, prots tienen que interaccionar con los filamentos Así, las partículas de menos de 60kDa pueden difundir a través del complejo, pero para las de mayor tamaño, necesitan mecanismos de transporte activo. Tráfico núcleo <-> citoplasma Bidireccional: a) Dirección citoplasma -> núcleo Histonas, snrnps (snrnas + prots), prots ribosómicas y maquinarias de replicación y transcripción. b) Dirección núcleo -> citoplasma: subunidades ribosómicas y RNAs: mrnas, trnas y snrnas (small nuclear RNAs que participan en el proceso de splicing: eliminar exones para empalmar intrones del RNA mensajero) NOTA: otros tipos de RNAs son: snornas = small nucleolar RNAs, para modificación de rrnas (no participan en splicing); scarnas = small cajal RNAs, que aparecen en céls en transcripción y modifican snornas y snrnas (activan estos últimos para participar en el splicing) Secuencia de localización nuclear: -Para citoplasma -> núcleo: secuencia de aa cargados positivamente (no es una secuencia consenso porque no son los mismos aa en el mismo orden siempre) que no tiene localización precisa en proteína (puede estar en cualquier posición dentro de la cadena). NOTA: la diapositiva sirve para explicar que si mutáramos un aa, en vez de ir al núcleo, iría al citoplasma -Secuencia de exportación: para núcleo -> citoplasma hay secuencia de aa hidrófobos, que tampoco tiene una posición fija en cadena. Carioferinas: proteínas de dos tipos, según importación o exportación celular. Citosol->núcleo: importina Núcelo->citosol: exportinas IMPORTACIÓN Y EXPORTACIÓN NUCLEAR Proteína Ran es una GTPasa con bajo peso molecular que tiene capacidad de unir GTP e hidrolizarlo a GDP. Al tener pequeño tamaño, atraviesa poro nuclear. Puede tener dos conformaciones según esté unida a GTP (núcleo) o GDP (citoplasma). Se genera así un

2 gradiente: más RanGTP en núcleo y más RanGDP en citoplasma. RanGEF (significa guanin exchange factor) intercambia en el núcleo el GDP por GTP. Por contra, el RanGAP activa función GDPasa en el citoplasma => Ran hidroliza GTP y queda unido a GDP. Por ello RanGTP siempre se mueve de núcleo -> citoplasma y RanGDP de citoplasma -> núcleo. a) Importación: citoplasma -> núcleo Importina reconoce en citoplasma proteína con señal de importación => unión => atraviesan la red de filamentos de FG => llegan al núcleo, donde la RanGEF aumenta la concentración de Ran GTP en núcleo, gracias a la fosforilación del GDP. Esta última se une a importina => importina sufre cambio conformacional y pierde afinidad por proteína de importación. Así, importina vuelve al citoplasma y RanGAP desactiva RanGTP para dar lugar a RanGDP. b) Exportación: núcleo -> citoplasma Unión RanGTP a exportina => aumenta afinidad por proteínas con señal de exportación celular => unión exportina, RanGTP y proteína a transportar => RanGTP se transporta a favor de gradiente a citoplasma, por lo que la proteína a la que va unida atraviesa complejo nuclear. Allí, RanGAP hidroliza GTP para liberar RanGDP de exportina => cambio de afinidad => se libera proteína transportada en citosol. Exportina vuelve al núcleo, al igual que RanGTP La manutención del gradiente implica el gasto de energía, proporcionado por la hidrólisis del grupo P cuando GTP->GDP. Es por este motivo por el que se trata de transporte activo. Las importinas y exportinas pueden atravesar libremente el complejo en ambas direcciones 2) LÁMINA NUCLEAR [NOTA: la diapositiva con formas verdes y azules: lo verde es la lámina nuclear y lo azul, el núcleo] Síndrome de envejecimiento prematuro: enfermedad provocada por la formación incorrecta de la lámina 3) CROMATINA Máxima condensación en metafase -Composición: 1/3 DNA, 1/3 histonas y 1/3 proteínas no histonas (polimerasa, etc)

3 Histonas Empaquetan el DNA en todos los eucariotas Formadas por aa básicos (Arg, Lys...) Afinidad por el extremo negativo del DNA (por el fosfato) 5 tipos: H2A, H2B, H3, H4 (las cuatro empaquetan ADN) y H1 [NOTA: ignorar tabla de tamaños de histonas] -Niveles de organización de cromatina: Para determinar la compactación de fibra de 11nm (collar de cuentas)-> fibra de 30nm: enzima degradasa (degrada DNA), en alta concentración salina => disociamos proteínas de DNA (luego enlaces no covalentes porque puentes de H se rompen por fuerza iónica). Determinaron así que había octámeros de 4 pares de histonas: H2A, H2B, H3 y H4. Fibra de 11nm: octámeros y DNA a su alrededor (147 pares de bases); las unidades entre sí están conectadas por DNA espaciador. Nucleosoma: octámero de histonas con 200 pares de bases de DNA (de los cuales 147 están enrollados en torno a un octámero de histonas, y el resto pertenecen a DNA espaciador). Esto supone un acortamiento de la longitud en un 700% (es decir, 7 veces) Fibra de 30nm: interviene la histona H1, que se une a DNA espaciador => acercamiento entre nucleosomas => empaquetamiento de la fibra hasta alcanzar un grosor de 30nm. Esto supone un empaquetamiento del 4.000% del DNA (es decir, 40 veces con respecto al DNA original, no con respecto a la fibra de 10nm) Bucles (700nm) Cromosoma (1400nm) Conclusión: se empaqueta veces. Así se asegura integridad de DNA en mitosis Resumen: doble hélice (2nm) -> collar de cuentas (11nm) -> fibra de 30nm -> bucles de 700nm -> cromosoma mitótico (1400nm) Tipos de cromatina: Eucromatina: estado laxo => accesible a maquinarias de transcripción. Se puede determinar gracias a que es sensible a DNasas, como la DNasa I, que corta secuencias internas de molécula => obtenemos fragmentos de longitud variable, desde uno hasta muchos nucleosomas. Esto se debe a que la DNasa I solo corta en sitios accesibles (no donde hay heterocromatina), lo cual se puede comprobar al hacer una electroforesis Heterocromatina: estado compactado => no se transcribe, no es codificante. Está adosada a la membrana nuclear.tipos: Constitutiva: nunca se expresa (forma parte de centrómeros y telómeros) Facultativa: condensada en algunos tipos celulares o en ciertos estados del desarrollo => cuando los genes no se expresan, se compactan en heterocromatina facultativa y los que sí se expresan en una célula, están en forma de eucromatina. Ejemplo de heterocromatina facultativa: cuerpos de Barr. Se forman por la inactivación aleatoria de un cromosoma X. Los cuerpos de Barr son neutrófilos (células sanguíneas) que se forma en hembras de mamífero, donde cada una tiene 4 lóbulos que son el cromosoma X inactivo (observable al microscopio). Esta inactivación se produce de forma temprana en el desarrollo y se mantiene a lo largo de varias mitosis => se forma un conjunto de células así.

4 [NOTA: la diapositiva supercuqui de la gata sirve para explicar que un gato macho no puede ser tricolor porque el color blanco está en un autosoma y el color negro y marrón dependen de un gen del cromosoma X (un alelo negro y otro alelo marrón). Así, como la inactivación es al azar, en algunas zonas se inactivará el alelo negro y en otros el alelo marrón, por lo que el pelaje será a franjas blancas, negras y marrones. Por este motivo, dos gatas que sean clones y tengan el mismo DNA exactamente podrán tener distinta coloración del pelaje, porque este fenómeno se da al azar y en cada caso ocurrirá en distintas áreas][meiosis, SÉ QUE TE SERÁ ÚTIL ESTA EXPLICACIÓN, DADO QUE ESTÁS EN LA PARRA] CROMOSOMAS Telómeros en extremos para estabilización Centrómeros: constricción primaria al que se unen proteínas de cinetocoro. Con cromatina constitutiva y una variante de la histona H3 que recluta proteínas del cinetocoro, donde se ensamblan microtúbulos del huso mitótico. [NOTA: la diapositiva muestra el centrómero del cromosoma de una levadura] También hay una constricción secundaria en los extremos, donde se localizan genes que codifican para el rdna. La constricción secundaria delimita una porción terminal llamada satélite (en un cromosoma metacéntrico habría 4) Clasificación: metacéntricos (centrómero justo divide dos y dos brazos de forma simétrica), submetacéntricos (longitud de dos y dos brazos desigual), acrocéntricos (dos brazos muy cortos) y telocéntricos (centrómero en extremos). Cariotipo Distintivo de cada especie, pues recoge el número, tamaño y forma de cromosomas en metafase (es decir, el patrón cromosómico) Los autosomas son designados con números (del 1 al 22) Para la identificación de cada par de cromosomas homólogos: Chromosome painting: cada cromosoma es coloreado de forma distinta mediante sondas fluorescentes. Separamos cromosomas según tamaño y fabricamos sondas (fragmentos de DNA) marcados con sustancias fluorescentes. Así encontramos el cromosoma del que proviene Patrón de bandas G (Giemsa) : nos proporciona una serie de regiones con pares de A-T Preparación de cromosomas: Suspendemos una muestra de sangre en cultivo con sustancias que estimulan la mitosis => proliferan los glóbulos blancos (porque eritrocitos no tienen núcleo). Al cabo de 72 horas hacemos tratamiento con colchicina, para sincron izar las céls en metafase porque impedimos que se forme el huso mitótico => no se separan los 2 brazos de cada cromosoma. Al suspender las céls en medio hipotónico, se hinchan y para fijarlas usamos ácido acético. Al inclinar el plano, encontramos céls en distintas posiciones. SERVIR FRÍO Cromosomas plumosos: Hay bucles de cromatina dispersa Son cromosomas meióticos que se encuentran en los oocitos de anfibios durante el desarrollo, pues en diploteno de meiosis I hay una parada => aparecen bucles que corresponden a zonas de genoma que se están transcribiendo activamente (la cromatina está descondensada). Esto ocurre porque fecundación es externa => no aporte constante de nutrientes por parte de madre => se transcriben genes, para sintetizar productos que

5 acumular durante el desarrollo embrionario. NOTA: los cromosomas están unidos por quiasmas Cromosomas politénicos: Son cromosomas interfásicos, lo cual es difícil de ver porque los cromosomas se condensan en mitosis y es más fácil verlos. Endorreplicación: varias copias sin separación (~1024 copias) Se encuentran en glándulas salivales de dípteros Se reconocen por un patrón de bandas e interbandas (cromatina laxa). 4) NUCLEOLO Visible al microscopio óptico Lugar de transcripción de genes ribosómicos, de maduración de transcrito primario -> rrna. Estos genes están en constricciones secundarias de ciertos cromosomas (de 5 cromosomas: 13, 14, 15, 21 y 22) Proceso: gen -> transcrito primario rrna 45S -> rrna 18S, 5'8S y 28S. Además, el gen rrna 5S no se encuentra ahí, sino que se transcribe fuera del nucleolo (en el cromosoma 1 de humanos, distinto de cromosomas de otros genes ribosómicos) Genes ribosómicos: lo que varía entre especies son las secuencias espaciadoras, que se encuentran entre regiones que codifican para rrnas, pero 18S, 5'8S y 28S se mantienen entre especies El nucleolo es la expresión morfológica de transcripción de RNApolimerasa I, porque esta enzima transcribe rrnas en nucleolo. RNApolimerasa II: transcripción de RNAs y otros genes. RNApolimerasa III: transcribe rrna 5S y otros genes Tenemos 5 pares de cromosomas con genes ribosómicos. Cada región de los cromosomas mencionados da lugar a un pequeño nucleolo que, según avanza la interfase, se van agrupando hasta formar el nucleolo. Así, el número de nucleolos va variando a lo largo del ciclo celular Ribosomas La demanda de ribosomas depende de tasa de actividad de la célula. Ej: una muy activa necesita del orden de 10^6 ribosomas por cada ciclo celular (es decir, un millón, tres millones...). Para ello, dos mecanismos de amplificación de los genes ribosómicos: Múltiples copias de genes ribosómicos en constricciones secundarias Múltiples complejos de RNA polimerasa I en cada gen => cada gen es copiado simultáneamente por varios complejos [NOTA: la imagen de diapositiva "El nucleolo es la fábrica de ribosomas" muestra una molécula de DNA de forma horizontal con dos genes en transcripción. Las zonas engrosadas se deben a la RNApolimerasa] Funciones del nucleolo: -Transcripción de los genes ribosómicos: gen -> rrna 45S (gracias a rrna polimerasa I) -Maduración del transcrito primario => snornas y rrnas 18S, 5.8S y 28S -Formación de partículas ribosómicas por proteínas importadas del citoplasma : 40S (rrna 18S con proteínas) y 60S (rrna 5S, 5'8S y 28S con proteínas). Ensamblaje de telomerasa: enzima con RNA (secuencia idéntica a telómeos) y hace de molde para que se copien los

6 extremos del telómero. Además, es un indicador de envejecimiento porque su actividad disminuye con la edad, mientras que en células cancerosas permanece siempre activa y por tanto son inmortales. Ultraestructura del nucleolo: 3 componentes, distinguibles desde el punto de vista morfológico, asociados a las distintas funciones. En plantas: distinta magnitud de componentes, aunque se necesita el mismo número de ribosomas. [NOTA: la segunda diapositiva de ultraestructura del nucleolo es de una planta]. Los complejos de transcripción están más compactados. Aspecto granular porque hay partículas pre-ribosómicas. Nucleolo muy activo porque subunidades comienzan a formarse tanto hacia fuera como hacia dentro. Consenso: Centros fibrilares: rdna inactivo Componente fibrilar denso: transcripción de genes ribosómicos y procesamiento del rrna 45S Componente granular: originado por ensamblaje de las unidades ribosómicas. Comparación ribosomas procariotas y eucariotas: subunidades tamaño y número de proteínas