Sa c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e p a r a

Transcripción

1 Ev a l u a c i ó n d e c e p a s industriales d e Sa c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e p a r a l a o b t e n c i ó n d e e t a n o l a p a r t i r d e f u e n t e s q u e n o a f e c t a n l a p r o d u c c i ó n d e a l i m e n t o s Teresa Fe r n á n d e z, 1,2 Ca r l o s Ma r t í n 1 y Mo h a m m a d Ta h e r z a d e h 2 Resumen Se evaluaron una cepa de laboratorio (No.1) y dos cepas industriales (No.2 y No.3) de Saccharomyces cerevisiae para la producción de etanol a partir de hidrolizados ácidos de bagazo. Las cepas No.2 y No.3, aisladas de plantas procesadoras de sustratos lignocelulósicos, presentaron una alta velocidad de consumo de furfural y de HMF. Aunque las tres cepas pudieron fermentar un hidrolizado, para dos de ellas se observó una fuerte inhibición en la fermentación. La cepa No.3, aislada de una planta de producción de etanol a partir de licores al sulfito, presentó una mayor tolerancia a inhibidores que las otras dos. La inhibición del rendimiento de etanol en la fermentación del hidrolizado no fue de sólo 2,3 % con esa cepa, mientras que en las cepas No.1 y No.2 fue de 73,9 y 86,4 %, respectivamente. La alta productividad volumétrica y específica de etanol, mayor velocidad de consumo de glucosa y más rápida conversión del furfural, evidencian la superioridad de la cepa No.3, así como su factibilidad para fermentar hidrolizados sin necesidad de que medie una etapa de detoxificación. Introducción Durante los últimos años aumentó el interés por el etanol combustible debido al aumento de los precios del petróleo crudo, la inminencia del agotamiento de ese hidrocarburo y la necesidad de mitigar el efecto invernadero. El etanol se ha convertido en un importante producto en el mercado mundial de combustibles. Su comercialización creció de menos de un millardo de litros en 1975 a más de 39 millardos en 2006 y se espera que alcance los 100 millardos en 2015 (Licht, 2006). Los altos costos de las materias primas azucaradas y amiláceas, así como el debate alimentos versus combustibles, han motivado el interés por los materiales lignocelulósicos (MLC) como posibles materias primas para la producción de etanol (Hahn-Hägerdal et al., 2006). Se ha afirmado que la producción de etanol combustible podrá permanecer como una industria importante y como un sistema agrícola auto-sostenible en el siglo x x i solamente si la utilización de los MLC se convierte en una realidad comercial. El bagazo de caña de azúcar (Saccharum officinarum) es un MLC de gran interés para la producción de etanol en Cuba sin afectar la producción de alimentos. Aunque el bagazo se utiliza como combustible en los ingenios azucareros (Valdés y col., 2000), puede ser considerado una materia prima potencial para la producción de etanol, especialmente si se tiene en cuenta su contenido Palabras Clave: etanol celulósico, hidrolizado de bagazo, detoxificación, S. cerevisiae. 1 Departamento de Química e Ingeniería Química, Universidad de Matanzas, Matanzas 44740, Cuba. 2 School of Engineering, Borås University Collage, Borås, Sweden. ATAC No. 1/2009 5

2 de carbohidratos y su disponibilidad en forma concentrada en los ingenios azucareros. Los MLC contienen carbohidratos en forma de celulosa y hemicelulosas, los que mediante procesos de hidrólisis generan monosacáridos como, glucosa, xilosa y otros. A continuación, estos azúcares pueden ser convertidos en etanol por fermentación utilizando diferentes microorganismos. La hidrólisis de la celulosa puede ser catalizada por ácidos o por enzimas. Tanto en la hidrólisis ácida como en el pretratamiento para la hidrólisis enzimática ocurre la degradación de los azúcares con formación de subproductos inhibitorios de la fermentación alcohólica, tales como ácidos alifáticos, aldehídos furánicos y compuestos fenólicos (Taherzadeh y Karimi, 2007). Los microorganismos para ser empleados en la fermentación de hidrolizados lignocelulósicos deben producir etanol con un alto rendimiento y productividad y hacer resistencia a los inhibidores presentes en los hidrolizados (Martín y col., 2002). La búsqueda de organismos resistentes a los inhibidores se ha convertido en una tarea de máxima prioridad. En este trabajo se investigó la fermentación de hidrolizados ácidos de bagazo con la utilización de dos cepas industriales y una de laboratorio de S. cerevisiae. Las cepas industriales fueron aisladas de una planta de fermentación de licores al sulfito y de una planta demostrativa de producción de etanol a partir de residuos lignocelulósicos. Materiales y Métodos Obtención de los hidrolizados El bagazo de caña de azúcar, donado por el ingenio azucarero Mario Muñoz, de Matanzas, Cuba, fue secado al aire, molido y conservado en bolsas plásticas a temperatura ambiente. Los hidrolizados fueron obtenidos por hidrólisis ácida en dos etapas. En la primera etapa, muestras de bagazo fueron impregnadas con ácido sulfúrico a una concentración final de 0,5 % y una relación de 10 g de sólidos por 100 g de mezcla. El material fue colocado en un reactor presurizado, donde se calentó a 180 o C durante 7 minutos para hidrolizar las hemicelulosas. A continuación, el hidrolizado hemicelulósico fue separado del material fibroso por filtración a vacío. En la segunda etapa, la celulosa contenida en el material fibroso fue hidrolizada por calentamiento con ácido sulfúrico a 230 o C durante 7 minutos. La concentración de H 2 SO 4 fue 0,5 % y la carga de sólidos fue 12 g por 100 g de mezcla. Finalmente, el hidrolizado celulósico fue separado por filtración al vacío y se conservó congelado hasta usos posteriores. Detoxificación de los hidrolizados Los hidrolizados fueron s por tratamiento con Ca(OH) 2 al 20 % (w/w) hasta ph 10 y se mantuvieron bajo esas condiciones durante una hora. Luego resultaron filtrados, neutralizados a ph 5,5 y filtrados nuevamente. Cepas Se utilizaron tres cepas de S. cerevisiae. La cepa No. 1 (CBS 8066) es una cepa de laboratorio que se utilizó como referencia porque ha sido utilizada previamente en estudios similares (Talebnia y Taherzadeh, 2006). Las cepas No. 2 y No. 3 son cepas industriales. La No. 2 fue aislada de hidrolizados fermentados de astillas de pino en una planta demostrativa de producción de etanol (Domsjö fabriker AB, Örnsköldsvik, Suecia), mientras que la No. 3 fue aislada de una planta productora de etanol a partir de licores de pulpeo de madera por el proceso al sulfito (Mo Do, Suecia). Preparación del inóculo Las tres cepas fueron conservadas en cuñas de YPD-agar (10 g L -1 de extracto de levadura, 20 g L -1 de peptona, 20 g L -1 de glucosa y 20 g L -1 de agar). Una asada de la cepa a estudiar fue transferida a 100 ml de medio sintético (20 gl -1 de glucosa, 7,5 gl -1 de (NH 4 ) 2 SO 4, 3,5 gl -1 de K 2 HPO 4, 0,75 gl -1 de MgSO 4.7H 2 O, 1 ml de solución de vitaminas, y 1 ml de solución de trazas de metales. Esta última solución contiene en gl -1 : EDTA, 3; CaCl 2.2H 2 O, 0,9; ZnSO 4.7H 2 O, 0,9; FeSO 4.7H 2 O, 0,6; H 3 BO 3, 0,2; MnCl 2.H 2 O, 0,16; Na 2 Mo 4.2H 2 O, 0,08; CoCl 2.2H 2 O, 0,06; CuSO 4.5H 2 O, 0,06; KI, 0,02. La solución de vitaminas se preparó en gl -1 con: ácido p-aminobenzoico, 0,2; ácido nicotínico, 1; pantotenato de calcio, 1; piridoxina, 1; tiamina, 1; biotina, 0,05; m-inositol, 25 (Karimi et al., 2005). El volumen resultante fue incubado en un Erlenmeyer de 300 ml a 30 0 C, 120 rpm hasta alcanzar valores de densidad óptica (DO 620 ) entre 8 y 11. Fermentación de los hidrolizados La fermentación anaeróbica se realizó en Erlenmeyers de 300 ml equipados con tapas de goma, dos tubos capilares de cristal y una trampa de CO 2. Los capilares fueron usados para la toma de muestras después de 0, 2, 4, 8, 12 y 24 horas y para la inyección de N 2 (con menos de 5 ppm 6 ATAC No. 1/2009

3 de O 2 ). El volumen de trabajo fue 100 ml de hidrolizado, los cuales fueron enriquecidos con los mismos componentes del medio sintético usado en la preparación del inóculo y en iguales concentraciones. Se adicionó además 0,1 ml de ergosterol. La fuente de carbono fue la misma que poseían los hidrolizados. Los frascos se inocularon con 4 ml de inóculo de una concentración de células igual a 4 gl -1 y se incubaron a 30 0 C y 120 rpm durante 24 horas. La referencia se preparó con glucosa añadida, en igual concentración que los hidrolizados, como fuente de carbono. Se enriqueció también con las mismas sales y demás componentes utilizados en las muestras de estudio. Se realizaron dos réplicas en todos los casos. Como criterio de la fermentabilidad se tomaron: el rendimiento (Y E/G ), la productividad volumétrica (Q), y la productividad específica (q) de etanol, la velocidad de consumo de glucosa (VCG) y la inhibición del rendimiento (IY) y de la productividad volumétrica (IQ). Para calcular el rendimiento en etanol se dividió la concentración de etanol producido a las 24 h por la concentración de glucosa inicial. La productividad volumétrica (Q) se basó en los gramos de etanol producidos por litro de medio de cultivo por hora durante las primeras 8 h de fermentación y la productividad específica es la relación entre Q y la concentración inicial de células (masa seca). La biomasa seca se determinó centrifugando (2 minutos a 4000 rpm) 5 ml de cultivo en un tubo de ensayos previamente pesado. Las células fueron lavadas con agua destilada y centrifugadas nuevamente. Luego de expulsar el sobrenadante se secaron a C durante 48 horas. La velocidad de consumo de glucosa se calculó como la diferencia entre las concentraciones, inicial y luego de 8 h, dividida por 8 h. Por último, la inhibición del rendimiento de etanol (IY) se calculó mediante la siguiente expresión: Y ref - Y preh IY = x 100 Y ref Donde Y ref y Y preh son los rendimientos en etanol de la referencia y el prehidrolizado, respectivamente. De modo similar fue calculada la inhibición de la productividad de etanol. Análisis Los hidrolizados y medios de fermentación fueron analizados por HPLC. El efluente fue H 2 SO 4 5 mm a una velocidad de flujo de 0,6 ml/min. Para la separación de glucosa, ácido acético, etanol y glicerol se utilizó una columna Aminex HPX-87H (Bio-Rad, Richmond, CA, EE.UU.) y un detector RI (Jasco International Co., Tokyo, Japón). El furfural y el HMF fueron detectados con un detector UV/VIS a 210 nm. La composición de los hidrolizados se muestra en la tabla 1. Resultados y discusión Durante la hidrólisis se formaron inhibidores de la fermentación, tales como ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural y ácido fórmico. La alta concentración de aldehídos furánicos es comparable con la encontrada en hidrolizados de bagazo obtenidos por explosión con vapor, asistida con impregnación con ácido sulfúrico (Martín y col., 2002). Los hidrolizados fueron s con el objetivo de disminuir su toxicidad hacia las levaduras. El proceso de detoxificación permitió reducir la concentración de los principales inhibidores entre 11,1 y 15,0 % (Tabla 1). No obstante, el contenido de aldehídos furánicos (2,5 g/l) aún se mantuvo a un nivel inhibitorio para las levaduras. Tabla No. 1 Concentración de los principales componentes detectados en los hidrolizados, g/l. Medio no Glucosa Ácido acético Furfural HMF 11,2 1,7 0,7 1,8 12,1 2,0 0,8 2,0 Producción de etanol y consumo de glucosa durante la fermentación. La alta concentración de aldehídos furánicos exige una alta tolerancia a inhibidores por parte de la cepa de levadura a utilizar en la fermentación. El objetivo del trabajo fue evaluar dos cepas industriales que, por haber sido aisladas de plantas procesadoras de sustratos lignocelulósicos, han experimentado una adaptación a los inhibidores presentes en los hidrolizados. Además, la cepa No. 2 es floculante, lo que facilita su separación por sedimentación y permite ahorrar recursos, ya que se evita el uso de centrífugas (Purwadi et al., 2007). Para evaluar la capacidad de las cepas de levadura se hicieron fermentaciones del hidrolizado sin detoxificar, el hidrolizado y una solución de referencia en paralelo para cada cepa. La solución de referencia contenía glucosa en la misma concentración que los hidrolizados, pero no contenía inhibidores. ATAC No. 1/2009 7

4 Como era lógico esperar, la fermentación de los hidrolizados estuvo inhibida en comparación con la de la referencia. La inhibición del rendimiento de etanol fue menor que la de la productividad volumétrica (Fig. 1), lo que se debió a que los inhibidores impidieron una producción rápida de etanol durante las primeras horas, pero luego ocurrió un Figura No. 1 Inhibición del rendimiento (barras grises) y la productividad volumétrica de etanol (barras blancas) durante la fermentación de los hidrolizados s y Inhibición, % sin detoxificar. 0 Cepa -1 Cepa 1-No Cepa 2- Cepa 2-No Cepa 3- Cepa 3-No Detoxificado Detoxificado Detoxificado Detoxificado Detoxificado Detoxificado proceso de adaptación de las cepas, lo que, relativamente, llevó a altos rendimientos de etanol al final de la fermentación. Para ilustrar este fenómeno en la figura 2 se muestra la dinámica de formación de etanol y consumo de glucosa en la fermentación de los hidrolizados con la cepa No. 1, la cual fue la más sensible a la inhibición. A pesar de que la remoción de inhibidores durante la detoxificación fue relativamente baja (Tabla 1), el efecto en la fermentabilidad de los hidrolizados s fue muy marcado. La inhibición de la fermentación fue mucho menor en el hidrolizado que en el hidrolizado sin detoxificar (Fig. 2). El rendimiento de etanol en la fermentación del hidrolizado fue comparable al rendimiento en la referencia (Tabla 2), por lo que la inhibición de ese parámetro fue inferior a 2 % para las tres cepas, e incluso fue nula para la cepa No. 3 (Fig. 1). La velocidad de consumo de glucosa, así como las productividades volumétrica y específica de etanol se incrementaron con la detoxificación, aunque sin llegar a los valores de la referencia. En lo referente al comportamiento de las distintas cepas, se debe resaltar la alta tolerancia a inhibidores de la cepa No. 3. Con esa cepa no se observó inhibición del rendimiento de etanol en la fermentación del hidrolizado, mientras que la inhibición en el hidrolizado sin detoxificar fue mínima y la inhibición de la productividad volumétrica fue comparable para ambos hidrolizados (Fig. 1). La velocidad de consumo de glucosa y la productividad Cepa No.1 No.2 No.3 específica de etanol también reportaron valores similares para ambos hidrolizados (Tabla 2). La mayor productividad específica en la fermentación del hidrolizado sin detoxificar fue obtenida con la cepa No. 3. Este resultado evidencia la superioridad de esa cepa con respecto a las demás, así como su factibilidad para fermentar hidrolizados sin necesidad de que medie una etapa de detoxificación. Figura No. 2 Consumo de glucosa (rombos) y formación de etanol (cuadrados) durante la fermentación del hidrolizado (símbolos vacíos) y del hidrolizado sin detoxificar (símbolos rellenos) con la cepa No Tabla No. 2 Parámetros de la fermentación Medio no YE/G 2 VCG 2 Q 2 q 2 g g -1 g L -1 h -1 g L -1 h -1 g g -1 h -1 0,45 0,94 0,50 1,66 0,12 0,06 0,19 0,63 Referencia 0,46 1,78 1,02 2,92 no 0,43 0,86 0,43 1,43 0,06 0,07 0,06 0,30 Referencia 0,44 1,61 0,73 2,43 no 0,44 0,93 0,46 1,53 0,43 0,94 0,46 1,53 Referencia 0,44 1,78 0,74 2,47 Y E/G, rendimiento de etanol por g de glucosa; VCG, velocidad de consumo de glucosa, Q, productividad volumétrica de etanol; q, productividad específica de etanol. Consumo de aldehídos furánicos Los parámetros del consumo de furfural y de HMF se muestran en la Tabla 3, mientras que la dinámica de la conversión de esos compuestos durante la fermentación con la cepa No. 3, la más 8 ATAC No. 1/2009

5 Tabla No. 3 Consumo de aldehídos furánicos durante la fermentación, % del contenido inicial Cepa Detoxificación Furfural-4 h, % resistente, se ilustran en la Figura 3. En la fermentación con las cepas No. 2 y No. 3 se logró una alta conversión de los inhibidores furánicos, la cual fue mayor en los hidrolizados s que en los no s. Con ambas cepas, en la fermentación de los hidrolizados s 85 % del furfural fue consumido en 24 h, mientras que con la cepa No. 1 sólo se consumió 52,3 % (Tabla 2). El consumo de furfural fue más rápido con la cepa No. 3, la cual logró altas conversiones de furfural incluso Figura No. 3 Dinámica del consumo de furfural (rombos) e HMF (círculos) durante la fermentación del hidrolizado (símbolos vacíos) y del hidrolizado sin detoxificar (símbolos rellenos) con la cepa No en el hidrolizado sin detoxificar. A las 4 h de fermentación, esa cepa ya había consumido tres cuartas partes del furfural contenido en el hidrolizado y casi la mitad del contenido en el hidrolizado no, mientras que el porcentaje de furfural consumido al final de la fermentación fue semejante para ambos hidrolizados. Aunque el consumo de HMF fue inferior, con todas las cepas se observó la misma tendencia que con el consumo de furfural (Tabla 2). La cepa No. 3 fue claramente superior a las demás, mientras que la No. 1 fue inferior. Evidentemente, la alta conversión de los aldehidos furánicos por la cepa No. 3 es la causa de la alta capacidad de esa cepa para fermentar los hidrolizados sin detoxificar. El consumo del furfural se debe a su reducción a alcohol furfurílico, lo que ha sido demostrado previamente. La capacidad de S. cerevisiae de reducir el furfural fue observada por primera vez por científicos del ICIDCA (Díaz de Villegas y col., 1992). Igualmente, se conoce que el HMF es reducido a alcohol hidroximetilfurfurílico. La reducción del furfural y del HMF en fermentaciones de hidrolizados de bagazo ha sido reportada previamente por este colectivo de investigadores (Martín et al., 2002). La dinámica de la conversión del furfural explica el comportamiento fermentativo de las cepas. Durante las primeras horas, cuando las concentraciones de furfural eran altas, las fermentaciones fueron lentas y la productividad de etanol fue baja, pero cuando el furfural fue convertido en el poco tóxico alcohol furfurílico las fermentaciones se activaron, conduciendo a altos rendimientos de etanol (Tabla 2). Por otra parte, las menores inhibiciones se observaron en las fermentaciones en las que se alcanzaron las mayores conversiones del furfural. Formación de glicerol El glicerol fue el principal subproducto formado durante la fermentación. La producción de glicerol fue mayor en los hidrolizados s que en los hidrolizados sin detoxificar (Fig. 4), y fue inferior en los hidrolizados que en las referencias (datos no mostrados). Se observó una estrecha Figura No. 4 Producción de glicerol durante la fermentación del hidrolizado (símbolos vacíos) y del hidrolizado sin detoxificar (símbolos rellenos) con las cepas No. 1 (A) y No. 3 (B) Furfural-24 h, % B HMF-4h, % HMF-4h, % No. 1 Sí 18,2 52,3 5,9 29,0 No 10,4 16,7 2,7 6,7 No. 2 Sí 23,7 85,5 0,0 58,3 No 0,0 22,7 0,0 7,3 No. 3 Sí 73,5 85,3 8,5 56,5 No 46,8 85,0 5,5 39, A ATAC No. 1/2009 9

6 correlación entre el consumo de furfural y la formación de glicerol. Un rápido consumo de furfural, como en la cepa No. 3, conllevó a una mayor formación de glicerol, mientras que un retraso en el consumo de furfural, como en la fermentación del hidrolizado sin detoxificar con la cepa No. 1, condujo a una baja formación de glicerol. Este fenómeno ha sido observado previamente en fermentación de hidrolizados de bagazo obtenidos por explosión con vapor seguida de hidrólisis enzimática. Conclusiones El empleo de una cepa de Saccharomyces cerevisiae aislada de una planta de fermentación de licores de pulpeo al sulfito permitió fermentar hidrolizados ácidos de bagazo con una inhibición mínima, debido a la alta capacidad de la cepa para convertir los inhibidores furánicos en formas menos tóxicas. La cepa aislada puede fermentar hidrolizados sin necesidad de detoxificación, lo que permite disminuir los costos del proceso. La fermentación de hidrolizados de bagazo de caña de azúcar permitiría obtener etanol combustible sin afectar la producción de alimentos. Agradecimientos Este trabajo fue posible gracias al apoyo de proyectos del Ministerio de Educación Superior de Cuba (contrato No ) y de la International Foundation for Science (contrato No. F/3563-1). enzymatic hydrolysates of sugarcane bagasse pretreated by steam explosion using different impregnating agents, Applied Biochemistry and Biotechnology 98/100: , Purwadi, R.; T. Brandberg; M. J. Taherzadeh: A possible industrial solution to ferment lignocellulosic hydrolyzate to ethanol: continuous cultivation with flocculating yeast, International Journal of Molecular Sciences 8: , Taherzadeh, M. J. and K. Karimi: Acid-based hydrolysis processes for etanol from lignocelulosic materials: a review, BioResources 2: , Talebnia, F. and M. J. Taherzadeh: In situ detoxification and continuous cultivation of dilute-acid hydrolyzate to ethanol by encapsulated S. cerevisiae, Journal of Biotechnology 125: , Valdés, A.; O. Almazán y H. Fiandor: Contribución de la biomasa cañera al incremento del valor agregado de la producción azucarera, International Sugar Journal 102: , Wahlbom, C. F.; B. Hahn-Hägerdal: Furfural, 5-hydroxymethyl furfural and acetoin act as external electron acceptors during anaerobic fermentation of xilose by recombinant Saccharomyces cerevisiae, Biotechnology and Bioengineering 78: , Bibliografía Díaz de Villegas, M. E.; P. Villa; M. Guerra; E. Rodríguez; D. Redondo and A. Martínez: Conversion of furfural into furfuryl alcohol by S. cerevisiae, Acta Biotechnologica 12: , Hahn-Hägerdal, B.; M. Galbe; M. F. Gorwa-Grauslund; G. Liden; G. Zacchi: Bio-ethanol the fuel of tomorrow from the residues of today, Trends in Biotechnology 24: , Karimi, K.; T. Brandberg; L. Edebo; M. Taherzadeh: Fed-batch cultivation of Mucor indicus in dilute-acid lignocellulosic hydrolyzate for ethanol production, Biotechnology Letters 27: , Licht, F.O.: Worlds ethanol markets: The Outlook to 2015, Tunbridge Wells, Agra Europe special report, UK, Martín, C.; M. Galbe; N. O. Nilvebrant and L. J. Jönsson: Comparison of the fermentability of 10 ATAC No. 1/2009