EFECTO DEL TAMAÑO DE INÓCULO SOBRE LA PRODUCCIÓN DE XILITOL POR LA LEVADURA IEC5- ITV EN HIDROLIZADO DE BAGAZO DE CAÑA.

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1 Clave: TITULO DEL PROYECTO: EFECTO DEL TAMAÑO DE INÓCULO SOBRE LA PRODUCCIÓN DE XILITOL POR LA LEVADURA IEC5- ITV EN HIDROLIZADO DE BAGAZO DE CAÑA. Belinda, Pérez-Bibbins 1 ; Elida, Gastélum-Martínez 1 ; Benigno, Ortíz-Muñiz 2 ; Ma. Guadalupe, Aguilar-Uscanga 1, Javier, Gómez- Rodríguez 1. DIRECCIÓN DE LOS AUTORES: 1 Laboratorio de Bioingeniería, Unidad de Investigación y Desarrollo de Alimentos, Instituto Tecnológico de Veracruz, Av. Miguel Ángel de Quevedo #2779, Veracruz, Veracruz, México. 2 Instituto Tecnológico Superior de Tierra Blanca, Av. Veracruz s/n esq. Héroes de Puebla, Tierra Blanca, Veracruz, México. Tel: (274) ; fax: (274) CORREO ELECTRÓNICO: pbbelinda@hotmail.com

2 INTRODUCCIÓN El xilitol es un polialcohol de la familia de las aldosas, el cual presenta un alto poder edulcorante equivalente al de la sacarosa. Posee propiedades edulcorantes y terapéuticas muy importantes que han sido de utilidad para la industria de alimentos y la farmacéutica. Dentro de sus propiedades terapéuticas se encuentran: que el consumo de xilitol es independiente del metabolismo de la insulina, fija el Ca +2 en los huesos combatiendo a la osteoporosis, previene infecciones del oído medio y ayuda en el tratamiento de las enfermedades de las vías respiratorias. El xilitol puede ser obtenido mediante la extracción sólido-líquido de frutas y vegetales, por síntesis química mediante la hidrogenación de la xilosa bajo condiciones elevadas temperatura ( ºC) y presión (P>50 atm) y por bioconversión bajo condiciones de temperatura y presión ambientales (30ºC y P=1 atm) utilizando como catalizadores a microorganismos, los cuales son capaces de metabolizar la xilosa a xilitol en un solo paso; dentro de los más estudiados se encuentran las levaduras del Género Candida, Debaryomyces y Hansenula, siendo las especies de Candida las mejores productoras de xilitol. Esta bioconversión puede ser llevada a cabo utilizando medios sintéticos e hidrolizados de residuos agroindustriales que contienen xilosa en su fracción hemicelulósica. El bagazo de caña es un residuo hemicelulósico que contiene 30% de xilosa, la cual puede ser liberada de la matriz hemicelulósica mediante una hidrólisis ácida para ser usada en la obtención de xilitol. Sin embargo, el uso del hidrolizado solo ha mostrado tener rendimientos bajos de producción por lo que para incrementarla (Y xilitol/xilosa, Q xilitol, Pmáx xilitol ) es necesario la adición de sales inorgánicas, fuente de nitrógeno, como el tamaño de inóculo en los medios de cultivo durante la fermentación. El tamaño de inóculo en medios de cultivo simples y complejos presenta un efecto positivo en la producción de xilitol por las levaduras, debido a que es un metabolito asociado al crecimiento. Felipe et al., (1996) observaron que a 3 g células/l mejoraban notablemente la utilización de sustrato y la producción de xilitol. Domínguez et al., (1997) reportaron que incrementando la concentración inicial de biomasa en Debaryomyces hansenii de 0.3 g/l a 3 g/l aumentó la productividad de xilitol de 0.68 a 2.25 g/lh, respectivamente. Debido a lo anterior, éste trabajo tiene como objetivo estudiar el efecto del tamaño de inoculo sobre la producción de xilitol en el hidrolizado de bagazo de caña con una cepa de levadura (IEC5-ITV).

3 MATERIALES Y MÉTODOS Microorganismo La cepa de levadura IEC5-ITV utilizada en éste trabajo fue aislada de bagazo de caña (Laboratorio de Bioingeniería, 2000) en la Unidad de Investigación y Desarrollo de Alimentos del Instituto Tecnológico de Veracruz. Medios para cultivo para conservación y crecimiento Medio de conservación La levadura se mantuvo en cultivo fresco en medio sólido donde se conservó en tubo de ensaye y en caja de petri bajo refrigeración a 4ºC. El medio sólido presentaba la siguiente composición: 20 gl -1 de agar-agar, 20 gl -1 de xilosa y 10 gl -1 de extracto de levadura. Medio de activación. El medio líquido sintético utilizado para activar la cepa de levadura IEC5-ITV fue preparado según lo indica la Tabla I. (Strehaiano et al,1983). Tabla I: Medio líquido sintético para precultivo (inóculo A). Componentes gl -1 Xilosa 20 KH 2 PO 4 5 (NH 4 ) 2 SO 4 2 MgSO 4 7H Extracto de Levadura 1 Ph 5.5 La adaptación de la cepa al medio hidrolizado se realizó en un medio complejo de hidrolizado de bagazo de caña para el inóculo B detallado en la Tabla II. Tabla II: Medio hidrolizado de bagazo de caña para precultivo (inóculo B) y para Fermentación Componentes gl -1 Xilosa (hidrolizado de bagazo de caña sin concentrar) 30 KH 2 PO 4 5 Urea 3 Mg(NO 3 ) 2 6H 2 O 0.4 Extracto de Levadura 1

4 Condiciones de cultivo Preinóculos La levadura se activó a través de dos medios de precultivo para disminuir su fase de adaptación (Tabla I y II), donde fueron inoculados 3E+6 células vivas/ml en 300mL de medio de fermentación en un matraz erlenmeyer de 500mL (Tabla II) a las siguientes condiciones de cultivo: 24 h, 250 rpm y 30 ºC. Para ello se utilizó una Incubadora con agitación/refrigeración marca: New Brunswick Scientific, modelo: C24KC. Fermentación Las cinéticas de fermentación se realizaron utilizando hidrolizado de bagazo de caña previamente filtrado. La preparación del medio de cultivo para la fermentación fué el siguiente: el hidrolizado se neutralizó a ph=5.5 con NaOH, se centrifugó a 4 ºC, rpm por 10 min utilizando la centrífuga marca Beckman, modelo J2-21; se tomaron 300 ml del sobrenadante en matraces de 500mL donde posteriormente se le adicionaron los nutrientes (Tabla II). Estos medios se esterilizaron a 121 ºC durante 15 min y se incubaron a 30 ºC, 250 rpm durante 5 días. La fermentación se monitoreó cada 8 h, donde se tomaron muestras, las cuales se les determinó cuenta celular y se cuantificaron los sustratos y productos por HPLC donde posteriormente se evaluaron los parámetros cinéticos (Y P/S, Q P y Pmáx) obtenidos en la producción de xilitol. Se estudió el efecto del tamaño de inóculo sobre la producción de xilitol. Para ello se evaluaron las siguientes concentraciones de células: 3E+6, 9E+6 1.8E+7 y 3.6E+7 células vivas/ml. El medio de cultivo con hidrolizado de bagazo de caña fué enriquecido con: 3 gl -1 urea, 2 mm de Mg(NO 3 ) 2 6H 2 0, 5 gl -1 de KH 2 PO 4 y 1 gl -1 de extracto de levadura. Hidrólisis del bagazo de caña La hidrólisis ácida del bagazo de caña se realizó utilizando una relación sólido-líquido de 1:5 (200 g de bagazo de caña+1 L de H 2 SO 4 2%) en matraces erlenmeyer de 2 L. Las condiciones de hidrólisis fueron: 122 ºC, 24 min utilizando la autoclave-pasteurizadora marca: Auriol Industrie No El bagazo de caña fue obtenido del Ingenio Lerdo de Tejada (zafra ). Posteriormente el hidrolizado contenido en cada matraz fue filtrado utilizando tela pañalina y después al vacío, donde su obtuvo un filtrado libre de residuos sólidos utilizando papel filtro Whatman No. 2. Métodos analíticos Análisis de biomasa. La medición del crecimiento celular fue determinada mediante densidad óptica (DO) a 620 nm en un espectrofotómetro marca Cintra10 UV visible GBC Spectrometer. Se determinó la correlación entre la densidad óptica y el peso seco de muestras tomadas a diferentes tiempos del crecimiento celular durante la fermentación, se realizó un análisis de regresión lineal a los datos obtenidos.

5 Para la determinación de peso seco se tomaron muestras cada 6 h; cada una se filtró al vacío mediante el uso de membranas de acetato de celulosa marca Millipore de 0.45 µm. Las membranas con y sin muestra se sometieron previamente a una etapa de secado al vacío (estufa modelo Gallenkamp) a 60 C durante 24 h, se midió el peso en una balanza analítica. La diferencia entre los pesos de la membrana con y sin muestra da como resultado el peso de la biomasa. La biomasa total se evaluó por conteo al microscopio del número de levaduras contenidos en un volumen conocido, empleando la cámara de Thoma (específica para conteo celular en levaduras) en un microscopio VELAB modelo VE-B2 (objetivo 40 X). La concentración de células (x) por mililitro de medio está representada por la ecuación: ND 6 x = ( 1x10 ) 4n donde : N = número D = dilución células totales (5 cuadros ) n = número de cuadros grandes El esquema de la cámara de Thoma se muestra en la Figura 1: de Figura 1: Cámara de Thoma El porcentaje de células viables de levaduras se estimó por conteo al microscopio después de la coloración con azul de metileno. La suspensión celular se mezcló en una proporción volumen/volumen con el colorante utilizado y después de 10 min de reacción se realizó el conteo celular en el microscopio para diferenciar las células vivas de las muertas, donde éstas últimas se teñían de azul de metileno. Esto puede ser debido a que la membrana de las levaduras muertas se debilita permitiendo que el azul de metileno penetre a la célula, mientras que las células vivas conservan la permeabilidad en su membrana. El azul de metileno, es un colorante de óxido reducción, el cual es reducido por una hidrogenasa que se vuelve incolora en su forma reducida en una célula viva.

6 El porcentaje de viabilidad (%) se determinó mediante la siguiente fórmula: CVT % V = ( ) CVT CM T donde : % V = CV T porcentaje de viabilidad = células viables totales CM T = células muertas totales El azul de metileno utilizado para conteo de células vivas se preparó mediante 1L de solución de (Na) 2 HC 6 H 5 O 7 donde se agregó 1 g de azul de metileno. Análisis de productos y sustratos (xilosa, xilitol, etanol, ácido acético, glicerol). La concentración de xilosa, xilitol, etanol, ácido acético y glicerol fueron cuantificados por cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Este equipo contiene una columna para la separación específica de azúcares, ácidos orgánicos y alcoholes con las siguientes propiedades: Columna Aminex HPX-87H Biorad H 2 SO 4 5mM 0.6 ml/min, a una temperatura de 48 ºC, con un detector de índice de refracción. Se prepararon estándares de xilosa (10 gl -1 ), xilitol (10 gl -1 ), etanol (10 gl -1 ), ácido acético (10 gl -1 ) y glicerol (10 gl -1 ),. Donde las ecuaciones lineales para cada uno de los estándares determinadas por el equipo fueron los siguientes: xilosa y= x; xilitol y= x; etanol y= x; ácido acético y= x; glicerol y= x. Todas las muestras provenientes de la fermentación del hidrolizado de bagaño de caña, se centrifugaron para precipitar la biomasa, donde posteriormente, se les realizó un tratamiento de defecación donde 0.8 ml de muestra se le agregó 0.1 ml BaO 0.3N y 0.1 ml ZnSO 4 5 % utilizando tubos eppendorf. Las muestras se dejaron reposar por 10 min y se centrifugaron a 10,000 rpm, 10 min en un equipo marca Eppendorf AG Centrifuge Luego se decantaron y se diluyeron con agua desionizada manteniendo la concentración de xilosa inicial de la fermentación menor a la de los estándares de calibración del HPLC. Análisis de los parámetros cinéticos. Los cálculos estadísticos de los parámetros cinéticos Y xilitol/xilosa, Q xilitol y Pmáx de xilitol como de Y etanol/xilosa, Q etanol y Pmáx de etanol se evaluaron con ayuda de la paquetería Minitab.

7 3. DESARROLLO Se evaluaron cuatro diferentes tamaños de inóculo (3E+6, 9E+6, 1.8E+7 3.6E+7 células/ml). Las cinéticas se realizaron en cultivo por lote por duplicado utilizando hidrolizado de bagazo de caña como medio de cultivo complementado con 0.4 g/l de nitrato de magnesio hexahidratado, 3 g/l de urea, 1 g/l de extracto de levadura y 5 g/l de fosfato dibásico de potasio en matraces de 500mL con 300mL, adaptando la levadura IEC5- ITV al medio hidrolizado de bagazo de caña. Se inoculó en mililitros las concentraciones iniciales de células: para 3E+6 células/ml se inoculó 6.02 ml; para 9E+6 células/ml se inocularon ml; para 1.8E+7 se inocularon ml y para 3.6E+7 células/ml se inocularon ml. Las condiciones de operación de la fermentación fueron: ph 5.5, 300 rpm y 30 C.

8 4. RESULTADOS A continuación se muestran los resultados obtenidos en la Figura 2. Figura 2: Cinética de consumo de xilosa, producción de xilitol, etanol y biomasa durante la fermentación de la levadura IEC5-ITV a diferentes concentraciones de células en HBC. 3E+6 células/ml ( ), 9E+6 células/ml ( ); 1.8E+7 células/ml ( ), 3.6 E+7células/mL (x). En todos los casos la concentración de xilosa inicial fue consumida completamente por la levadura IEC5-ITV a las 80 h (Figura 2). Se observó que el tratamiento con 36E+6 células/ml consumió por completo la xilosa antes de las 48 h donde después de éste tiempo los tratamientos con 3E+6 células/ml y 9E+6 células/ml presentaron una velocidad de consumo de xilosa mayor que con 3.6E+7 células/ml. Asimismo se observó que a mayor concentración inicial de células se incrementó el rendimiento y la productividad de xilitol y disminuyó en esa misma proporción el

9 rendimiento y la productividad de etanol. Sin embargo la producción de etanol fue mayor utilizando un tamaño de inóculo de 3E+6 células/ml. La producción de glicerol fue mayor con 9E+6 células/ml donde se alcanzó una concentración máxima de 1 gl -1 sin embargo después de 72 h disminuyó su producción como también la de etanol con 3E+6 células/ml. La concentración de biomasa fue mayor con 3E+6 células/ml y con 9E+6 células/ml alcanzando concentraciones de 40 gl -1 de biomasa a las 104 h y se observó que los tamaños de inóculo de 1.8E+7 y 3.6E+7 células/ml alcanzaron concentraciones de biomasa de gl -1 a las 112 h. La levadura IEC5-ITV presentó una velocidad de consumo de ácido acético similar para todos los tamaños de inóculo estudiados. Tabla III: Efecto del tamaño de inóculo sobre el rendimiento de biomasa, xilitol, etanol y sobre la productividad de xilitol y etanol así como consumo de ácido acético durante la fermentación de la levadura IEC5-ITV en HBC. células/ml Y x/s (gg -1 ) Y xilitol/xilosa (gg -1 ) Y etanol/xilosa (gg -1 ) Q xilitol/xilosa (gl -1 h -1 ) Q etanol/xilosa (gl -1 h -1 ) AcOH i (gl -1 ) AcOH c (gl -1 ) 112 h 3E E E E El rendimiento de xilitol se duplicó con 3.6E+7 células/ml iniciales comparado con el tratamiento con 3E+6 células/ml (Tabla III y Figura 2). Se encontró que a mayor concentración inicial de células se redujo el rendimiento de etanol y aumentó el rendimiento de xilitol. Los tratamientos con 3.6E+7 células/ml y 1.8E+7 células/ml presentaron la misma productividad de xilitol (Figura 3). Aunque el tratamiento con 9x10 6 células/ml iniciales presentó un rendimiento de xilitol menor (Y xilitol/xilosa =0.38 gg -1 ) que los tratamientos con 1.8E+7 células/ml (Y xilitol/xilosa =0.43 gg -1 ) y 3.6E+7células/mL (Y xilitol/xilosa =0.46 gg -1 ), sin embargo fue el más productivo (Q xilitol =0.13 gl -1 h -1 ). Se encontró que la levadura IEC5-ITV consumió aproximadamente de gl -1 de ácido acético contenido en el medio hidrolizado en todos los tratamientos a las 112 h.

10 0,5 0,4 Y(g/g), Q(g/Lh) 0,3 0,2 0,1 0,0 3,0E+06 9,0E+06 1,8E+07 3,6E+07 células/ml Figura 3:1 Efecto del tamaño de inóculo sobre el rendimiento y la productividad de xilitol y etanol durante la fermentación de la levadura IEC5-ITV en HBC. Y xilitol/xilosa (gg -1 ), Y etanol/xilosa (gg -1 ),Q xilitol (gl -1 h -1 ),Q etanol (gl -1 h -1 ).

11 DISCUSIÓN Se observó que a mayor concentración inicial de células (1.8E+7 y 3.6E+7 células/ml), el rendimiento y la productividad de xilitol fueron incrementados y disminuyeron en esa misma proporción el rendimiento y la productividad de etanol. El tratamiento con 9E+6 células/ml presentó un rendimiento de xilitol menor (0.38 g/g) que los tratamientos con 1.8E+7 células/ml y 3.6E+7 células/ml (0.43 y 0.46 g/g, respectivamente) donde éstos dos últimos presentaron la misma productividad de xilitol (0.105 g/lh). El rendimiento de xilitol fue el doble empleando un tamaño de inóculo de 3.6E+7 células/ml en comparación a 3E+6 células/ml (0.23 g/g) sin embargo, la producción de etanol fue mayor (0.22 g/g) con respecto a los demás tamaños de inóculo evaluados ( g/g). Cuando se inoculó con 1.8E+7 células/ml se observó que la levadura IEC5-ITV no dirigió su metabolismo hacia la producción de biomasa obteniéndose un menor rendimiento (0.77 g/g) con respecto a los demás tamaños de inóculo evaluados ( g/g). Cabe destacar que los tamaños de inóculos evaluados en éste trabajo se inocularon en volumen (células/ml) con el objetivo de iniciar la fermentación con células vivas a las concentraciones establecidas, sin embargo, el incoveniente de ésta metodología fue la dilución de la concentración inicial de los compuestos presentes en el medio de cultivo de Hidrolizado de Bagazo de caña (HBC). Por ésta razón se seleccionó a 1.8E+7 células/ml iniciales en lugar de 3.6E+7 células/ml como tamaño de inóculo para la evaluación del efecto de la concentración de xilosa, urea y magnesio sobre la producción de xilitol, ya que sólo se ocupó un volumen de 36 ml para inocular 300 ml de medio hidrolizado en un matraz de 500 ml además de que presentó un rendimiento de xilitol mayor en comparación con 3E+6 células/ml y con 9E+6 células/ml iniciales así como una producción de biomasa menor. Esto indicó que bajo ésta concentración inicial de células el metabolismo de la levadura IEC5-ITV no se dirigió hacia la producción de biomasa sino que incrementó el rendimiento de xilitol en comparación con los demás tamaños de inóculo estudiados. Domínguez et al., (1997) reportaron que el incremento en la concentración inicial de biomasa con Debaryomyces hansenii de 0.3 gl -1 a 3 gl -1 incrementó la productividad de 0.68 a 2.25 gl -1 h -1. Cabe mencionar que la edad del inóculo tiene un efecto positivo tanto en el consumo de sustrato como en el rendimiento de biomasa, en éste estudio la edad del inóculo utilizada fué de 36 h. Du Preez et al., (1994) reportó que un inóculo de 24 h tiene un rendimiento de xilitol de 0.24 gg -1 y uno de 72 h tiene un rendimiento de xilitol de 0.13 gg -1.

12 6. CONCLUSIONES De los tamaños de inóculo evaluados (3E+6, 9E+6, 1.8E+7 y 3.6E+7 células/ml) el rendimiento de xilitol fué duplicado con 3.6E+7 celulas/ml (Y xilitol/xilosa = 0.46 gg -1 ), comparado con 3E+6 celulas/ml (Y xilitol/xilosa = 0.23 gg -1 ). Se concluye que al aumentar la concentración inicial de inóculo se incrementa el rendimiento y la producción máxima de xilitol y disminuye el rendimiento de etanol; con 3.6E+7 células/ml (0.46 g/g) y la productividad más alta de xilitol se obtuvo con un tamaño de inóculo de 9E+6 células/ml (0.127 g/lh). Se seleccionó 1.8E+7 células/ml como mejor tamaño de inóculo por presentar la misma productividad (Q xilitol =0.43 gl -1 h -1 ) que con 3.6E+7 células/ml(q xilitol =0.46 gl -1 h -1 ) además de que representó un volumen menor de inóculo (ml) evitando así la dilución de los nutrientes en el medio de cultivo.

13 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Aguilar R., Ramírez J.A., Garrote G., Vázquez M. (1998). Kinetic study of the acid hydrolysis of sugar cane bagasse. J. Food Eng. 55: Domínguez J.M, Gong, C. S. & Tsao, G. T. (1997). Production of xylitol from D-xylose by Debaryomyces hansenii. Appl. Biochem & Biotech : Du Preez J.C., (1994). Process parameters and environmental factors affecting D- xylose fermenting by yeasts. Enzyme Microbiol. Technol. 16: Felipe M.G.A, Alves L.A., Silva S.S. Roberto I.C., Mancilla I.A., Almeida e Silva J.B. (1996). Fermentation of eucalyptus hemicellulosic hydrosylate to xylitol by Candida guilliermondii. Bioresour. Technol. 56: Strehaiano (1983). Effect of initial substrate concentration on two wine yeasts: Relation between glucose sensitivity and ethanol inhibition. Am. J. Enol. Vitic. 34:1:1-5.