Memorias del XXXVI Encuentro Nacional de la AMIDIQ 5 al 8 de Mayo de 2015, Cancún, Quintana Roo, México

Transcripción

1 5 al 8 de Mayo de 215, Cancún, Quintana Roo, México PRODUCCIÓN DE β-glucosidasa MEDIANTE FERMENTACIÓN SUMERGIDA POR ASPERGILLUS NIGER CDBB-H-176 Cristian Alarid García a, Marcos Daniel González Llanes a, Jesús Raúl Ortiz del Castillo b, Eleazar Máximo Escamilla Silva a, * a Departamento de Ingeniería Química, Instituto Tecnológico de Celaya, Av. Tecnológico y García Cubas S/N, Celaya, Guanajuato, C.P. 381, México. cristian.alarid@iqcelaya.itc.mx b Facultad de Ciencias Químico-Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria, Ave. de las Américas y Josefa Ortiz de Domínguez, Culiacán, Sinaloa, C.P. 81, México. Resumen Se utilizó Aspergillus niger CDBB-H-176 para la producción de β-glucosidasa extracelular. Mediante la aplicación de un diseño experimental ortogonal (L 9 ) se optimizaron los parámetros del medio de cultivo que maximizara la actividad β-glucosidasa. Las condiciones óptimas una vez realizados 18 experimentos, fueron las siguientes: temperatura, 3 C; ph 6; agitación orbital, 2 rpm; concentración de sacarosa,.5% W/V. El valor máximo estadístico esperado con estas condiciones de trabajo fue de U/mL, obteniéndose un valor experimental confirmatorio de U/mL. Así mismo, se determinó la temperatura y el ph óptimo de la β-glucosidasa mediante ensayos enzimáticos; los cuales resultaron ser 6 C y un ph de 5.. Introducción La glucohidrolasa β-glucósido, más conocida como β-glucosidasa, pertenece a la familia de las β- glucanasas, y son responsables del catabolismo de una amplia gama de hidratos de carbono [1]. La β- glucosidasa ha sido ampliamente usada en la producción de bioetanol utilizando residuos agrícolas, tales como: rastrojo de maíz, paja y bagazo [2]. Diversos microorganismos (bacterias, hongos y levaduras) han sido empleados para producir la enzima β-glucosidasa [3]. En el presente trabajo se utilizó la cepa fúngica Aspergillus niger CDBB-H-176. El objetivo principal fue optimizar los parámetros de cultivo para la máxima producción de β-glucosidasa. Metodología Se utilizó Aspergillus niger CDBB H-176, (CINVESTAV-IPN), México. El hongo se conservó en tubo inclinado de agar papa dextrosa (PDA) no comercial a 4 C y se resembró cada dos meses. El medio de fermentación utilizado para la producción de β-glucosidasa está basado en el reportado por Riou et al [4]. Inoculación y fermentación: La fermentación se llevó a cabo en matraz agitado erlenmeyer de 5 ml, y con un volumen de trabajo de 25 ml. Cada matraz fue inoculado con 2 ml de una resuspensión de esporas de los tubos inclinados. El proceso se llevó a cabo en una agitadora con control automático de temperatura y velocidad de agitación marca Lab. Companion SI-6R. Se utilizó un diseño experimental ortogonal, L 9 (con una réplica por experimento). Los factores a estudiar fueron los siguientes: A- temperatura (28-32 C), B-pH inicial del medio de cultivo (5-7), C-velocidad de agitación (-2 rpm) y D-concentración de sacarosa ( % W/V), el resto de los nutrientes del medio de cultivo se mantuvieron fijos, y el tiempo de fermentación fue de 4 días. La variable de respuesta fue la actividad enzimática β-glucosidasa. Ensayos enzimáticos: El ensayo de actividad β-glucosidasa fue basado en el procedimiento descrito por Riou et al [4], sin embargo, en este trabajo se le hicieron algunas modificaciones. Se mezcló.9 ml de 215 Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química ISBN

2 5 al 8 de Mayo de 215, Cancún, Quintana Roo, México p-nitro phenyl β-d-glucopyranoside (pnpg) 5 mm y 1 ml de una solución buffer de acetato de sodio.1 M ph 5.; posteriormente se le agregó.1 ml de la fuente enzimática (medio de cultivo filtrado). Enseguida se incubó a 5 C durante 3 minutos, y finalmente, la reacción fue detenida adicionando 3 ml de carbonato de sodio 1 M. El producto formado (p-nitro fenol) fue monitoreado a 42 nm. Una unidad de actividad β-glucosidasa corresponde a la generación de 1 µmol de p-nitro fenol min -1 bajo las condiciones de ensayo mencionadas arriba. La actividad β-glucosidasa extracelular fue reportada en unidades/ml/min del filtrado (U/mL). Resultados Las mejores condiciones experimentales resultaron ser las siguientes: temperatura, 3 C; ph 6; agitación orbital, 2 rpm; concentración de sacarosa,.5% W/V. El valor estadístico máximo esperado de β-glucosidasa con dichas condiciones de trabajo fue de U/mL, obteniéndose un valor experimental confirmatorio de U/mL. Las superficies de respuesta muestran que a niveles medios de ph y temperatura se alcanza la mayor actividad enzimática (Figura 1). Por otro lado, a niveles altos de agitación y niveles medios de temperatura se obtendría también la mayor actividad β-glucosidasa. (Figura 2) Figura 1. Superficie de respuesta para la producción de β-glucosidasa en función de A y B. Figura 2. Superficie de respuesta para la producción de β-glucosidasa en función de A y C. Estos resultados muestran que el ph que reportó Riou et al [4] (ph 6), en su medio de cultivo, para la producción de β-glucosidasa también fue el mejor en este trabajo, a pesar de haber utilizado diferentes microorganismos. Así mismo, se puede observar que los valores más altos de actividad β-glucosidasa se obtienen al utilizar los niveles más bajos de concentración de sacarosa (Figura 3). Esto debido a que a menor concentración de fuente de carbono, los microorganismos agotan los nutrientes de manera más rápida; lo cual hace que A. niger CDBB-H-176 comience a producir enzimas que hidrolicen disacáridos y polisacáridos, buscando así su supervivencia. Finalmente, en la última superficie de respuesta de este trabajo, podemos apreciar que la manera de esperar la mayor producción de β-glucosidasa es con combinaciones de niveles altos de agitación y niveles bajos de sacarosa (Figura 4). Mediante este 215 Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química ISBN

3 5 al 8 de Mayo de 215, Cancún, Quintana Roo, México estudio se logró observar que a rpm de agitación orbital fueron demasiado bajos los valores de actividad β-glucosidasa, además que el crecimiento del hongo no fue homogéneo en el medio de cultivo; mientras que para las agitaciones de 15 y 2 rpm el crecimiento fue en forma de pellet, reflejado en una mejor producción enzimática (Tabla 1) Figura 3. Superficie de respuesta para la producción de β-glucosidasa en función de A y D. Figura 4. Superficie de respuesta para la producción de β-glucosidasa en función de C y D. Tabla 1. Efecto de los factores estudiados para la producción de β-glucosidasa. Agitación Temperatura, orbital, Sacarosa, C ph rpm % W/V Actividad β-glucosidasa, U/mL Exp Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química ISBN

4 5 al 8 de Mayo de 215, Cancún, Quintana Roo, México La Tabla 2 muestra el análisis de varianza para los datos de actividad β-glucosidasa, el cual arrojó que los cuatro factores estudiados fueron significativos en la variable de respuesta (confianza del 95%). El factor D (% W/W sacarosa) resultó el más significativo en el proceso; la siguiente variable en importancia fue el factor C (agitación orbital), seguida del factor B (ph); mientras que la variable con menor peso, pero significativa, fue el factor A (temperatura). Tabla 2. Análisis de varianza para la la producción de β-glucosidasa (diseño L 9 ). Factor SS df MS F p A-Temperatura B-pH C-Agitación D-% sacarosa Error Total SS Respecto a los ensayos enzimáticos, se trabajó con el filtrado del caldo de fermentación obtenido a los 4 días de haber iniciado el experimento. Esto con la finalidad de comparar los valores óptimos de ph y temperatura que habían obtenido otros autores al caracterizar la enzima β-glucosidasa producida por microorganismos diferentes al que se utilizó en este trabajo. Para encontrar el ph óptimo se prepararon diferentes buffers (2 ph 7) para llevar a cabo los ensayos enzimáticos; en la Figura 5 se puede apreciar que el mejor amortiguador para llevar a cabo la reacción catalítica enzimática es el buffer de ph 5.. Mientras que para los buffers cercanos al óptimo se observa que son aproximadamente el 8% de éste valor. Ac#vidad rela#va, % ph Figura 5. Efecto del ph sobre la actividad b-glucosidasa de A. niger CDBB-H Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química ISBN

5 5 al 8 de Mayo de 215, Cancún, Quintana Roo, México Así mismo, se llevó a cabo un barrido de temperatura desde 5 hasta 9 C para encontrar la temperatura óptima que reflejara la mayor actividad β-glucosidasa. Se determinó que a 6 C es donde mayor actividad enzimática se presentó (Figura 6); mientras que para temperaturas menores a 4 C y/o mayores a 8 C, la enzima β-glucosidasa presenta una muy baja actividad. Ac#vidad rela#va, % T, C Figura 6. Efecto de la temperatura sobre la actividad β-glucosidasa de A. niger CDBB-H-176 Conclusiones Los resultados muestran que el ph y la concentración de sacarosa que utilizaron Riou et al [4] en su trabajo, también son los óptimos para la producción de β-glucosidasa por Aspergillus niger CDBB-H El diseño experimental permitió observar que a 3 C y 2 rpm, se puede incrementar la producción de la enzima. Se estandarizó un método para la determinación de la actividad β-glucosidasa. Mediante la caracterización de la enzima, se pudo concluir que los valores óptimos de ph y temperatura para la actividad de β-glucosidasa producida por Aspergillus niger CDBB-H-176 son 5. y 6 C, respectivamente; valores muy similares a los reportados por Hui-Lei Yu et al [5]. Referencias 1. Schomburg D., Schomburg I., Class 3.2. Hydrolases VII. EC , Springer Handbook of Enzymes, Vol. 12, Ed. Dietmar Schomburg and Ida Schomburg, Bothast, R.J., Saha, B.C., Ethanol production from agricultural biomass substrates, Adv. Appl. Microbiol., Vol. 44, p , Saloheimo, M. et al, Enzymatic Properties and intracellular localization of the Noval Trichoderma reesei β-glucosidase BGL II (cel 1A), Applied and Environmental Microbiology, Vol. 68, p , Riou C. et al, Purification, characterization, and substrate specificity of a novel highly glucose tolerant β-glucosidase from Aspergillus oryzae, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 64, p , Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química ISBN