COLEGIO MEXICANO DE INGENIEROS BIOQUÍMICOS, A. C.

Transcripción

1 EFECTO DE LA VELOCIDAD DE AIREACIÓN SOBRE LA PRODUCCIÓN DE BIKAVERINA EN UN BIORREACTOR AIRLIFT Chávez Parga, Ma. del Carmen a ; Negrete Rodríguez, Maria de la Luz X. b ; González Ortega, Omar b y Escamilla Silva, Eleazar M. b a Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. b Instituto Tecnológico de Celaya. a Facultad de Ingeniería Química, Edificio M CU, Francisco J. Mújica S/N, Col. Felicitas del Río, Morelia Mich., Tel/fax: e- mail: INTRODUCCION La bikaverina es una quinona de color rojo con fórmula química C 2 H 14 O 8 (punto de fusión: C). Se aisló de fermentaciones con Gibberella fujikuroi y Fusarium oxysporum (Balan y col., 197). La bikaverina presenta actividad antiprotozoaria contra Leishmania brasiliensis y antitumoral. La bikaverina se sintetiza por la condensación de unidades de la acetil-coa. La acetil- CoA es también un precursor de todos los terpenoides fúngicos. En Gibberella fujikuroi la biosíntesis de los grupos principales de terpenoides, tales como esteroles, carotenoides y giberelinas, se encuentra separada en compartimientos celulares diferentes y usan fuentes de sustrato independientes (Domenech y col. 1996). La bikaverina es un coproducto indeseable de las giberelinas en la industria y es necesario desarrollar conocimientos orientados a determinar los factores que inducen la formación de bikaverina de manera que pueda excluirse de las fermentaciones industriales. DESARROLLO EXPERIMENTAL Y METODOLOGÍA En este trabajo se utilizó el hongo Gibberella fujikuroi cepa CDBB-H984 mantenida en medio PDA (agar de papa y dextrosa) no comercial a 4 ºC. El micelio totalmente desarrollado en una caja petri se removió del medio PDA por adición de una solución

2 isotónica (.9% NaCl), la mezcla resultante se inocula en un matraz Erlenmeyer de 5 ml con 3 ml de medio de cultivo. El medio de cultivo utilizado para la propagación del hongo, la composición del medio para la fermentación y las condiciones de operación son reportadas por Chávez (25). El biorreactor airlift MTB (Modular Tower Bioreactor) Applikon de 4 L empleado está instrumentado para el control y monitoreo de temperatura, oxígeno disuelto y ph. La velocidad de aireación estudiada se varió de.3 a 1.8 vvm, los experimentos se realizaron por duplicado. Durante el tiempo de fermentación se realizó un muestreo cada 12 horas. A la muestra obtenida se le determinaron concentración de biomasa, azúcares reductores y nitrógeno amoniacal de acuerdo a lo descrito por Chávez (25). Para la determinación de bikaverina primero se realizó una extracción de ésta del micelio con cloroformo y del medio de cultivo con acetato de etilo (en este caso se evapora completamente el acetato de etilo y se resuspende el residuo en cloroformo para su cuantificación). La curva de calibración se preparó con bikaverina purificada en columnas con silica gel. El procedimiento de purificación empleado es una adaptación del método reportado por Valadon y Chapman (1983), la técnica propuesta se detalla por Chávez (25). RESULTADOS Y DISCUSION En la Figura 1 se presentan los resultados para las cinéticas de crecimiento de los experimentos realizados para algunas de las diferentes velocidades de aireación estudiadas. Se observa también que la máxima concentración de biomasa obtenida fue para la fermentación con el mayor flujo de aire (1.8 vvm) y la menor fue para la cinética correspondiente al menor flujo de aire (.3 vvm), siendo más prolongada la fase de crecimiento exponencial en la de flujo de 1.8 vvm. El resto de las cinéticas de crecimiento son similares.

3 En la Figura 2 se presentan las cinéticas de consumo de nitrógeno para los diferentes flujos de aire empleados, observándose el agotamiento del nitrógeno en todas las fermentaciones durante las primeras 33 horas. Aparentemente, la velocidad de consumo de nitrógeno aumenta conforme se incrementa el nivel de aireación. 12 Biomasa, g/l Tiempo, h.3 vvm.8 vvm 1.3 vvm 1.8 vvm.25 Figura 1. Cinéticas de crecimiento..2 Nitrógeno, g/l Tiempo, h.3 vvm.8 vvm 1.3 vvm 1.8 vvm Figura 2. Cinética de consumo de nitrógeno.

4 En la Figura 3 se presentan las cinéticas de consumo de dextrosa para las fermentaciones a diferente flujo de aire. En estas cinéticas se observa que en las fermentaciones con los flujos de aire bajos se consumió más rápido la dextrosa y a flujos de aire altos el consumo fue más lento. Este comportamiento es el mismo que se observó en los experimentos en matraz (estos resultados no se muestran). En la Figura 4 se presentan las cinéticas de producción de bikaverina, observándose que la producción de este metabolito secundario se inicia un poco antes de la agotación de nitrógeno en el medio de cultivo. La mayor producción observada fue a un flujo de aire de.8 vvm, las fermentaciones a.3 y.5 vvm presentaron una producción similar. La menor producción se obtuvo en las fermentaciones con mayor flujo de aire (1.6 y 1.8 vvm). 6 5 Dextrosa, g/l Tiempo, h.3 vvm.8 vvm 1.3 vvm 1.8 vvm Figura 3. Cinética de consumo de dextrosa.

5 Bikaverina, mg/l Tiempo,h.3 vvm.5 vvm.8 vvm 1. vvm 1.3 vvm 1.6 vvm 1.8 vvm Figura 4. Cinética de producción de bikaverina. En la Figura 5 se presentan las cinéticas de oxígeno disuelto para cada uno de los experimentos realizados. Se observa que el oxígeno disuelto disminuye durante la fase de crecimiento exponencial para todas las fermentaciones. Para flujos de aire bajos se tiene la presencia de condiciones de oxigenación críticas para el microorganismo. Se observa también que las fermentaciones con alto flujo de aire tienden a alcanzar el máximo valor de oxígeno disuelto en menor tiempo comparadas con las fermentaciones con flujo de aire bajo. Para la mayoría de los experimentos, después de las 24 h aproximadamente, se observó el cambio de coloración del medio de cultivo de amarillo a rosa tenue. En la Figura 6 se presentan un promedio de las máximas producciones de bikaverina para cada experimento estudiado y la producción de GA 3 a las 96 horas de fermentación. Como se observa en la Figura 6 existe una relación inversa entra la producción de giberelinas y bikaverinas con respecto al flujo de aire, para flujos mayores a 1. vvm, esto es, a mayor nivel de aireación se produce una mayor concentración de GA 3 y una menor concentración de bikaverina. Por debajo de un flujo

6 de 1. vvm se favorece tanto la producción de bikaverina como la de GA 3, conforme aumenta el nivel de aireación. Oxígeno disuelto, % Tiempo, h.3 vvm.5 vvm.8 vvm 1. vvm 1.3 vvm 1.6 vvm 1.8 vvm Figura 5. Cinéticas de oxígeno disuelto para los diferentes flujos de aire durante la fermentación. Era de esperarse que altos niveles de aireación favorecieran la producción de GA 3 ya que la biosíntesis de giberelinas involucra muchas etapas oxidativas catalizadas por monooxigenasas, dioxigenasas y deshidrogenasas. Giordano y Domenech (1999) estudiaron el efecto de la aireación en la producción de bikaverina y GA 3 a nivel matraz y encontraron que a mayor aireación se favorecen tanto la producción de bikaverina como de GA 3. Este mismo resultado se encontró en el presente trabajo en experimentos a nivel matraz. Para el caso de los experimentos en biorreactor, lo anterior sigue siendo cierto para flujos de aire menores a 1. vvm, sin embargo, como ya se mencionó, la producción de bikaverina desciende drásticamente cuando se incrementa el flujo de aire por arriba de 1. vvm. Lo anterior tiene implicaciones importantes ya que, como se mencionó anteriormente, la bikaverina es un producto indeseable en la producción de GA 3. Los resultados indican

7 claramente que niveles altos de aireación inhiben, casi por completo, la producción de bikaverina mientras que la producción de GA 3 se ve altamente favorecida. Al disminuir la producción de bikaverina se facilita el proceso de purificación de GA Bikaverina, mg/l GA 3, mg/l Flujo de aire, vvm Bikaverina GA 3 Figura 6. Máxima producción de bikaverina y producción de GA 3 a las 96 horas en función del flujo de aire. En la Tabla 1 se presentan los resultados de los parámetros cinéticos encontrados del ajuste de los datos experimentales a modelos matemáticos reportados por Chávez-Parga y col. (25). Tabla 1. Parámetros cinéticos estimados para la producción de bikaverina. Flujo de aire (vvm) μ máx. h -1 k Y x/n g bio/g nit. Y x/s g bio/g dex. m s g dex./g bio h. α β

8 La constante específica de velocidad de crecimiento máxima (μ máx ) parece ser constante para los diferentes flujos de aire estudiados. El coeficiente de rendimiento de consumo de nitrógeno, Y x/n, también se mantiene constante y del mismo orden de magnitud para los flujos estudiados esto debido a que se tiene el mismo medio de cultivo y a que la velocidad de consumo es similar. El coeficiente de rendimiento del consumo de dextrosa, Y x/s, tiende a aumentar conforme aumenta el flujo de aire, esto debido en parte a que la velocidad de consumo de dextrosa es mayor a flujos bajos. CONCLUSIONES El presente trabajo establece el marcado efecto de la velocidad de aireación del medio de cultivo en la producción de bikaverina. La cinética de consumo de dextrosa también se afecta significativamente y es favorecida a bajas velocidades de aireación. De acuerdo a los resultados se puede implicar un cierto tipo de regulación por parte de la concentración de oxígeno ya que de acuerdo a las cinéticas obtenidas, la producción de bikaverina cesa cuando se alcanza un determinado valor de concentración de oxígeno disuelto Agradecimientos: al CONACYT (33973-B) y al COSNET (648-P) por el apoyo financiero otorgado durante el desarrollo de esta investigación, así como, su apoyo para la retención número 598, en el programa de consolidación de grupos de investigación. BIBLIOGRAFÍA Balan, J., Fuska, J., Kuhr, I. and Kuhrová, V. (197). Bikaverin, an antibiotic from Gibberella fujikuroi, effective against Leishmania brasiliensis. Folia Microbiológica. 15:

9 Chávez Parga, Ma. del C. (25) Producción de ácido giberélico en un biorreactor airlift. Tesis de Doctorado en Ciencias en Ingeniería Química, Instituto Tecnológico de Celaya, Celaya, Gto. Chávez-Parga, Ma. del C., González-Ortega, O., Sánchez-Cornejo, G., Negrete- Rodríguez, Ma. De la L. X., González-Alatorre, G., and Escamilla-Silva, E. M. (25). Mathematical description of bikaverin production in a fluidized bed bioreactor. World J. of Microb. & Biotech. 21: Domenech, C. E., Giordano, W., Ávalos, J. and Cerdá-Olmedo, E. (1996). Separate compartments for the production of sterols, carotenoids and gibberellins in Gibberella fujikuroi. Eur. J. Biochem. FEBS. 239: Giordano, W. and Domenech, C. E. (1999). Aeration effects acetate destination in Gibberella fujikuroi. FEMS Microbiol. Lett. 18: Valadon, L. R. G. and Chapman, D. J. (1983) The nafthoquinones (fungal vacuolation factor) of Verticillium agaricinum. Microbiol. Lett. 24: