5 MATERIALES Y MÉTODOS

Transcripción

1 5 MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 Preparación del inoculo Se obtuvo del Laboratorio de Microbiología de Alimentos de la Universidad de las Américas, una cepa de Escherichia coli (ATCC 35218). Esta cepa se hizo crecer en un caldo Caso (Merk, Alemania) a 35 C durante 24 horas, para obtener una población aproximada de 10 6 UFC/ml. 5.2 Preparación del sistema modelo Se elaboró una solución buffer con 34 gr de fosfato de Potasio, Dibásico (S.T. Backer, México) en 1 lt de agua y se esterilizó. Se tomó 0.7 ml de la solución buffer en 500 ml de agua destilada. Se partió de sistema modelo sencillo en el cual no se contempló el contenido de sólidos, para el segundo sistema modelo se añadió azúcar refinada para ajustar a 15 Brix mediante un refractómetro digital (Atago CO., LTD, PR- 1, Japón); previamente calibrado con agua destilada y se volvió a esterilizar. Se ajustó el ph con HCl 1N (esterilizado por filtración en membrana) hasta un ph 3.5 (primer sistema modelo) y 3.0 (segundo sistema modelo), y una vez alcanzado el ph se mezcló con 0.5 ml de E. Coli en caldo Caso (Merk, Alemania) para tener una población inicial aproximada de 10 6 UFC/ml 24

2 5.3 Ultrasonido Equipo de Ultrasonido Se empleó un homogeneizador ultrasónico (Cole-Parmer Instrumental Company, CPX-400,USA) con una punta de 25.4 mm, que opera a una amplitud de 120 µm (100%) Tratamiento ultrasónico El tratamiento se realizó colocando el sistema modelo en un vaso de doble pared de 500 ml (previamente esterilizado). El sistema para mantener la temperatura constante fue un baño (Polystat, , México D.F.), y el medio fue agua, manteniendo así una temperatura constante de 38 ± 2 C, la cual fue medida por medio de un termómetro de mercurio. Se introdujó la punta de 25.4 mm del homogeneizador ultrasónico en el vaso (Guerrero et al., 2001). El arreglo del equipo se muestra en la Fig. 3. Figura 3. Arreglo del equipo de ultrasonido 25

3 5.4 Ultravioleta Equipo de Luz Ultravioleta Se empleó una lámpara Philips de luz ultravioleta de 70 cm de longitud y 0.75 cm de radio con una intensidad de µw/cm 2, siendo el área de contacto de cm 2 y el volumen de la muestra a tratar es igual a 140 cm 3. El tratamiento se realizó mediante la recirculación del sistema modelo previamente colocado en un vaso refrigerante de doble pared de 500 ml. El sistema para mantener la temperatura constante fue un baño (Polystat, , México D.F.), y el medio fue agua, manteniendo así una temperatura constante de 38 ± 2 C, la cual fue medida por medio de un termómetro de mercurio. La recirculación se realizó usando una bomba peristáltica (Master Flex, , U.S.A.) en la cual se ajustaron los flujos de 5ml/s, 10ml/s y 15ml/s Tratamiento con luz UVC El sistema modelo fue colocado en un vaso de doble pared de 500 ml, previamente esterilizado. Se introdujo un agitador magnético, previamente esterilizado junto con un termómetro de mercurio en el sistema modelo. El vaso se conectó a un baño con circulación de agua. Se introdujo la manguera que conecta la entrada del esterilizador UV en el fondo del vaso para hacer recircular el sistema modelo con la bomba peristáltica a diferentes velocidades de flujo, teniendo contacto con la lámpara de luz UV (Poblano, 2002). El arreglo del equipo se muestra en la Fig

4 Figura 4. Arreglo del equipo de UVC 5.5 Tratamiento combinado de ultrasonido con luz UVC El tratamiento se realizó colocando el sistema modelo en un vaso de doble pared de 500 ml (previamente esterilizado) con el fin de mantener una temperatura constante en el interior del mismo. Se colocó un termómetro de mercurio conectado al aparato de ultrasonido para poder medir constantemente la temperatura. Se introdujó la punta de 25.4 mm del homogeneizador ultrasónico en el vaso refrigerante. El sistema modelo que recibió el tratamiento ultrasónico fue el mismo que tomó la manguera que conecta la entrada del esterilizador UV en el fondo del vaso para hacer recircular el sistema modelo con la bomba peristáltica a diferentes velocidades de flujo, teniendo contacto con la lámpara de luz UV. El arreglo del equipo para el tratamiento combinado se muestra en la Fig

5 Figura 5. Arreglo del equipo del tratamiento combinado 5.6 Evaluación microbiológica Medio de cultivo Se prepararó agar Eosina Azul de metileno (Oxoid LTD., Basingstoke, Hampshire, England) para el recuento de Escherichia coli. Se esterilizó a 121 C por 15 min; y se vertió en cajas Petri de 100 X 15 mm Inoculación de los medios Se tomaron muestras de 1.0 ml cada 60 s para el tratamiento con ultravioleta durante 10 min, cada 90s para el tratamiento de ultrasonido durante 30 min y cada 60 s 28

6 para el tratamiento combinado durante 15 min, colocando la muestra en tubos de dilución los cuales contenían agua peptonada estéril (Merck, Alemania), para posteriormente realizar siembra a profundidad. Las cajas Petri se incubaron a 35 C por 48 h Conteo de UFC/ml La enumeración de las colonias se realizó mediante un cuenta colonias Québec. 29