PRÁCTICO N 4. Análisis de fertilidad del suelo

Transcripción

1 PRÁCTICO N 4 Análisis de fertilidad del suelo

2 OBJETIVOS Conocer las técnicas actuales de recuento de microorganismos. Conocer la importancia del monitoreo de abundancia, actividad y diversidad de los microorganismos edáficos. Obtener dominio en el análisis de grupos funcionales microbianos que intervienen en la fertilidad del suelo. Adquirir habilidades y/o destrezas para la siembra y cultivo de microorganismos. Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para fomentar una eficiente labor grupal.

3 Técnicas mas utilizadas para estimar la abundancia microbiana Recuento de células totales (células vivas y muertas). Recuento de células viables (células que aún presentan capacidad para reproducirse).

4 Técnicas para determinar abundancia de microorganismos Recuento de células totales Método directo (Cámara de Petroff Hausser) Forma de calcular el número de células por ml de muestra 12 células x 25 cuadrados x 50 x 10 3 Número x mm 2 Sitio donde se coloca la muestra. Espacio entre cubre y porta 0,02 mm (1/50 mm). La rejilla tiene 25 cuadrados grandes, un área de 1 mm 2 y un volumen total de 0,02 mm 3 Observación microscópica: todas las células son contadas dentro de un cuadrado grande (16 cuadrados pequeños). Ej. 12 células Número x mm 3 Número x cm 3 o /ml

5 Método turbidimétrico (Espectrofotómetro) Luz incidente Filtro (filtra diferentes longitudes de onda) Muestra con células Luz no dispersada Fotocélula (mide la luz no dispersada)

6 Recuento de células viables Recuento en medio sólido a) Siembra por inmersión o embebido Colonias creciendo en superficie El inóculo es pipeteado dentro de una placa estéril Medio estéril es adicionado y mezclado con el inóculo Solidificación e incubación Colonias creciendo embebidas en el agar b) Siembra en superficie Colonias creciendo en superficie Incubación Se coloca una alícuota (0,1 ml) sobre la superficie del agar Se esparce el inóculo con espátula de Drigalsky UFC/mL o UFC/g = colonias contadas x (1/factor de dilución) x (1/volumen de inóculo)

7 Recuento en medio líquido Método del número más probable (NMP) Diluciones seriadas Suspensión o inóculo a sembrar Batería de tres tubos bact./ml o bact./g = NMP x (1/factor de dilución) x (1/volumen de inóculo)

8 Tabla de Mc. Grady Nº Característico NMP Nº Característico NMP Nº Característico NMP

9 Recuento de células viables aplicadas a grupos funcionales Grupo funcional: conjunto de microorganismos que realizan procesos metabólicos semejantes, independientemente de su taxonomía. Procedimiento para determinar abundancia de grupos funcionales 1) Suspensión y dilución de suelo 2) Siembra en medios selectivos líquidos y sólidos 3) Determinación del crecimiento (lectura)

10 Análisis de grupos funcionales 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml X g suelo en X ml de solución salina estéril Suspensión/dilución 10-1 Agitar 2 o 3 minutos Recuento en medio sólido (Embebido) Recuento en medio líquido (NMP) Organismos fijadores de N Nitrificadores Celulolíticos Amonificadores ESTUFA LECTURA

11 Suspensión y dilución del suelo Material de trabajo Agregar 10 g de suelo en 90 ml de solución salina estéril Tapar y agitar durante tres minutos Suspensión y dilución del suelo

12 Preparación de las diluciones Flamear un porta-pipeta Extraer una pipeta estéril Extraer 1ml de la suspensión de suelo

13 Preparación de las diluciones Poner el ml en el tubo 10-2 Mezclar y extraer 1 ml Poner el ml en el tubo 10-3 Continuar igual con todos los tubos

14 Siembra en medios específicos: Amonificadores Diluciones: -9, -8, Siembrar en medio con asparagina Incubación C, 7días

15 Siembra en medios selectivos: Celulolíticos Diluciones: -6,-5, Sembrar en medio líquido con papel de filtro Incubación C, 15 días

16 Siembra en medios selectivos: Fijadores Dilución: Sembrar en medio sólido sin N Incubación C, 5 días

17 Siembra en medios selectivos: Nitrificadores Dilución: -4,-3, Sembrar en medio líquido con sulfato de amonio Incubación C, 21 días

18 Siembra de grupos funcionales Batería de grupos funcionales Suspensión/dilución de suelo gradilla de diluciones gradilla de nitrificadores gradilla de celulolíticos gradilla de amonificadores caja de fijadores de N Estufa de incubación

19 Lectura: Amonificadores (ejemplo) Agregar reactivo Nessler El color ocre detecta presencia de amonio Contar los tubos positivos Buscar el número en la tabla de Mc. Grady Número característico Número Mas Probable (NMP) = 15

20 Lectura: Celulolíticos (ejemplo) Observar alteración del papel Número característico Número Mas Probable (NMP) = 15 Tipos de alteración del papel

21 Lectura: Fijadores (ejemplo) (-4) Contar colonias (entre ) Número de colonias (UFC) = 120

22 Lectura: Nitrificadores (ejemplo) Agregar H 2 SO 4 más difenilamida El color azul detecta presencia de nitrato Contar los tubos positivos Buscar el número en la tabla de Mc. Grady Número característico Número Mas Probable (NMP) = 15

23 Actividades 1. Siembra de grupos funcionales: nitrificadores, celulolíticos, amonificadores y fijadores de N Recuento de grupos funcionales 3. Actividad extra para trabajar en el Práctico Nº 5