EFECTO DEL PH SOBRE LA PRODUCCIÓN DE ETANOL POR //S. CEREVISIAE// ITV01

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María Carmen Casado Camacho
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1 Clave: EFECTO DEL PH SOBRE LA PRODUCCIÓN DE ETANOL POR //S. CEREVISIAE// ITV01 Ortiz-Muñiz, Benigno 1 ; Guzman-Lagunes, Fernando 2 ; Gutiérrez- Rivera, Beatriz 1 ; Barradas-Dermitz, Dulce Ma. 2 ; Aguilar-Uscanga, Ma. Guadalupe 2. DIRECCIÓN DE LOS AUTORES 1 Instituto Tecnológico Superior de Tierra Blanca, Av. Veracruz s/n esq. Héroes de Puebla, Tierra Blanca, Veracruz, México. Tel: (274) ; fax: (274) Laboratorio de Bioingeniería, Unidad de Investigación y Desarrollo de Alimentos, Instituto Tecnológico de Veracruz, Av. Miguel Ángel de Quevedo #2779, Veracruz, Veracruz, México. CORREO ELECTRÓNICO mc.benigno@gmail.com

2 INTRODUCCIÓN En los últimos años, la búsqueda por fuentes alternas de energía se ha incrementado debido al agotamiento de las reservas de petróleo. Ante tal panorama, se ha propuesto que el etanol puede ser un combustible renovable. Aunque la fermentación alcohólica es una de las fermentaciones más estudiadas; la búsqueda de cepas de levaduras capaces de llevarla a cabo de una manera mas eficiente, continua exhaustivamente; pues los requerimientos son variados dependiendo del sustrato que se emplee para la fermentación. Se han establecido una serie de características deseables de las levaduras para la producción de etanol, como: osmotolerancia, resistencia a etanol, efecto Killer, resistencia a ph ácidos, entre otras (Panchal, 2002). Ante tal panorama, en el grupo de trabajo se aisló a S. cerevisiae ITV01 es una cepa aislada de melazas de caña de azúcar que presenta características de interés para la producción de etanol, tales como su osmotolerancia, tolerancia a etanol y el efecto Killer (Ortiz-Zamora, 2006). Posteriormente, Ancona (2006) estableció que esta cepa presentó un mayor rendimiento y productividad que las cepas empleadas en algunos ingenios en el Estado de Veracruz. Existen reportes en la literatura sobre el efecto del ph sobre la fermentación alcohólica, siendo recomendado trabajar en rango de ph de 4.0 a 5.5, sin embargo, valores cercanos a 4.5 o superiores son propicios para el desarrollo de microorganismos contaminantes de la fermentación que causan un detrimento en la productividad del proceso, por lo que ha sido recomendado trabajar en valores de ph menores (Panchal, 2002); Por lo que el objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto del ph sobre la producción de etanol en S. cerevisiae ITV01.

3 MATERIALES Y MÉTODOS Se realizaron cinéticas a diferentes valores de ph inicial desde un ph 2.0 hasta 6.5 a intervalos de 0.5 unidades de ph, todas las cinéticas se realizaron por duplicado. Para poder disminuir la fase de adaptación del microorganismo al medio de cultivo de fermentación, la levadura fue activada por medio de un precultivo. Se tomaron 3 asadas de los tubos inclinados que contienen Saccharomyces cerevisiae ITV01 en conservación y se inoculó un matraz Erlenmeyer de 500 ml que contiene 300 ml de medio de cultivo y se incubaron a 150 rpm y 30 C. Después de transcurridas 12 horas de incubación, un número de 3x10 6 células viables/ml fueron tomadas del precultivo para ser inoculadas a un segundo matraz, que fue incubado a las mismas condiciones, por 12 horas, y fueron tomadas 6x10 6 células viables/ml para ser inoculadas. El medio de cultivo empleado fue: Glucosa 150, g/l; extracto de levadura, 2 g/l; fosfato monobásico de potasio 8 g/l; sulfato de amonio, 4 g/l y sulfato de magnesio heptahidratado, 1 g/l. La densidad óptica (DO) fue medida a 620nm empleando un espectrofotómetro Cintra 10, en celdas de metacrilato con una trayectoria óptica de 10mm, se realizaron las diluciones adecuadas para tener valores de absorbencia menores a 0.8. El peso seco se obtuvo mediante filtración y secado de un volumen conocido de muestra (15 ml) sobre una membrana de porosidad determinada (Waters, acetato de celulosa 0.45 µm). La cuenta celular se realizó empleando una cámara de Thoma. Las muestras de cultivo son diluidas con el fin de contar cada vez un número máximo de 500 células. Cada conteo fue realizado a partir de 5 cuadros grandes de la cámara de Thoma. El conteo de células viables de levadura fue estimado por conteo al microscopio después de la coloración de azul de metileno (Lange et al., 1993). La concentración de sacarosa, glucosa, fructosa, etanol, glicerol y ácido acético se determinarán mediante HPLC utilizando una columna Aminex HPX-87H de Biorad, la fase móvil empleada fue H 2 SO 4 5 mm, con un detector de índice de refracción. Las condiciones fueron: 0.4 ml/min, 40 C. A su vez, el volumen inyectado fue de 20 µl utilizando un automuestreador Waters 1700 plus. Las muestras fueron centrifugadas a 10,000 rpm por 10 minutos a 4 C y congeladas. El software a utilizar es el Data Apex v.2.0 calculando el área del pico y la concentración de la muestra mediante una correlación con estándares previamente realizados.

4 RESULTADOS Dentro de los resultados se obtuvo a un valor de ph de 2.0 una fuerte inhibición sobre el crecimiento y la producción de etanol, sin embargo, al aumentar el ph se disminuyó el efecto inhibidor, obteniéndose la mayor productividad (1.84g/lh) a un ph de 3.5. Al aumentar el valor de ph se incremento la producción de glicerol. Para el intervalo de ph de 3.0 a 4.0 no se obtuvo una diferencia significativa en cuanto al rendimiento específico obtenido (ver Tabla I). La mayor productividad fue obtenida en el rango de ph (ver Tabla II). Tabla I: Efecto del ph sobre los rendimientos de biomasa (Yx/s), glicerol (Yg/s). etanol (Ye/s). ph Rendimientos (g/g) Yx/s Yg/s Ye/s Ye/x Al realizar los balances de carbono (Figura 1) se demostró que la mayor fracción de sustrato convertido a etanol fue obtenida a un ph inicial de 3.5 relacionada al completo consumo de la fuente de carbono. Para un ph de 6.5 también se obtuvo un consumo total de la fuente de carbono y el incremento en la productividad de etanol, lo cual podría indicar la presencia de una isoenzima de la alcohol deshidrogenasa que presenta una mayor actividad en un ph cercano a la neutralidad. En ambos casos, se obtuvieron las mayores fracciones e sustrato convertido a biomasa, lo que correlaciona con la mayor producción de etanol. El valor de ph de 3.5 se recomienda para la producción de etanol empleando a S. cerevisiae ITV01, aunado a que la levadura permaneció viable durante la fermentación.

Tabla II: Efecto del ph sobre las productividades de biomasa (Px), glicerol (Pg) y etanol (Pe). ph Productividades (g/lh) Px Pg Pe 2.0 0.01 0 0.07 2.5 0.09 0.08 0.93 3.0 0.17 0.13 1.83 3.5 0.16 0.

5 Tabla II: Efecto del ph sobre las productividades de biomasa (Px), glicerol (Pg) y etanol (Pe). ph Productividades (g/lh) Px Pg Pe Figura 1: Balances de carbono al final de las fermentaciones a diferentes valores de ph inicial. Glucosa ( ), biomasa ( ), glicerol ( ), etanol ( ) y CO 2 ( ).

6 CONCLUSIONES La cepa S. cerevisiae ITV01 es resistente a bajos valores de ph en el medio de cultivo; presentando su mejor actividad fermentativa en el rango de ph de , donde se obtienen las mayores fracciones de sustrato convertidas a etanol. Para un valor de ph inicial de 6.5 se obtuvo una alta fracción de sustrato convertida; sin embargo proponer trabajar a un ph 6.5 favorece la presencia de bacterias contaminantes de la fermentación alcohólica. Aunado a lo anterior, la resistencia a bajos valores de ph de la levadura fue evaluada observándose una baja tolerancia a ph inicial ; sin embargo, un pequeño aumento en el valor del ph inicial (3.0) favorece la actividad fermentativa de la levadura.

7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Ancona, A. (2006). Estudio del efecto del tipo de sustrato, la fuente de carbono y nitrógeno y la adición de sulfitos sobre la producción de etanol a partir de cepas de levaduras autóctonas e industriales, Tesis de Maestría, UNIDA-ITV, México. 2. Lange, H., Bavouzet, J.M., Taillandier, P. y Delorme, C. (1993): Systematic error and comparison of four methods for assessing the viability of Saccharomyces cerevisiae suspensions, Biotechnol. Tech., 7: Ortiz-Zamora, O. (2006): Aislamiento y Selección de Levaduras osmotolerantes y resistentes a etanol para la producción de etanol, Tesis de Maestria, UNIDA-ITV. 4. Panchal, C. (1990): Yeast strain selection, Biotechnology and Bioprocessing Series, CRC. pp Walker, M.G., (1998): Yeast Phisiology and Biotechnology, John Wiley & Sons, Inglaterra, pp. 350.

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