Antagonismo in vitro de rizobacterias del garbanzo contra Fusarium oxysporum f. sp. ciceris

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1 Antagonismo in vitro de rizobacterias del garbanzo contra Fusarium oxysporum f. sp. ciceris Rizobacterias in vitro antagonism chickpea against Fusarium oxysporum f. sp. ciceris Luz del Carmen Oliva Ortiz, Teresa de Jesús Velázquez Alcaraz, Tomás Díaz Valdés, Julio Arciniega Ramos, Universidad Autónoma de Sinaloa, CP 80000, teléfono: ; Rogelio Sosa Pérez, Centro de Ciencias de Sinaloa, CP 80010, teléfono: ; Leopoldo Partida Ruvalcaba, Universidad Tecnológica de Culiacán, CP 80014, teléfono: Correspondencia: Recibido: 25/09/2015 Aceptado: 13/12/2016 RESUMEN La actividad antagónica de rizobacterias nativas de suelos de Culiacán cultivados con garbanzo, fue evaluada contra F. oxysporum f. sp. ciceris. Las bacterias fueron identificadas bioquímicamente mediante el empleo del Sistema API 50CHB y API 20NE. La capacidad antagónica de los aislados se determinó mediante el Porcentaje de Inhibición del Crecimiento Radial del fitopatógeno. B. subtilis y A. radiobacter causaron la inhibición de más de 55% de crecimiento de la colonia del patógeno. Palabras clave: Biocontrol, fusariosis vascular, Bacillus subtilis, Agrobacterium radiobacter ABSTRACT The antagonistic activity of native soil rhizobacteria Culiacan cultivated with chickpeas was assessed against F. oxysporum f. sp. ciceris. The bacteria were identified biochemically by using the system API 50CHB and API 20NE. The antagonistic ability of the isolates was determined by the percent inhibition of radial growth of the pathogen. B. subtilis and A. radiobacter caused inhibition of more than 55% of colony growth of the pathogen. Keywords: Biocontrol, fusarium wilt, Bacillus subtilis, Agrobacterium radiobacter INTRODUCCIÓN La producción de garbanzo es afectada por diversas enfermedades. La fusariosis vascular es la enfermedad que más daño ocasiona, y Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Foc), es uno de sus principales agentes causales (Carrillo, 2010). En Culiacán, Sinaloa, el garbanzo es afectado por esta enfermedad, determinándose como principal fitopatógeno a Foc raza 5 (Velarde et al., 2009). El control de este patógeno mediante fungicidas químicos, aparte de dañar el medio ambiente y la salud humana, incrementan los costos de producción y reducen la formación de nódulos, pues afectan negativamente la población de bacterias fijadoras de nitrógeno del suelo, disminuyendo aún más, el rendimiento del cultivo. Día con día, el control biológico mediante 51

2 organismos antagonistas sugiere ser una herramienta valiosa para el control de enfermedades producida por fitopatógenos (Hernández et al., 2011). Por tanto, el objetivo de la investigación fue estudiar la capacidad antagónica in vitro de cuatro MATERIALES Y MÉTODOS Se evaluaron cuatro aislados bacterianos: T442 y T3141, 7AI y 751, obtenidos previamente a partir de suelo rizosférico sembrado con garbanzo, ubicados en Culiacán, Sinaloa; el laboratorio del Instituto Nacional de Investigación y Fomento Agrícola y Pecuario donó una cepa de Foc raza 5, para desarrollar las pruebas de antagonismo. Los aislados fueron sometidos a una distinción morfológica macroscópica, sembrándose por medio de asada, en cajas Petri con medio de cultivo (Agar nutritivo y Agar FLO) y fueron incubadas a 28 C por 24 horas. En las características microscópicas, se consideraron tinción Gram y presencia de esporas mediante la técnica de verde malaquita (Garassini, 1967). Para la identificación de los aislados se empleó el sistema API BioMérieux (API 50CHB complementado con API 20NE). Se realizaron bioensayos de confrontación in vitro para determinar el efecto antagónico de los aislados, siguiendo la metodología de cultivo dual RESULTADOS Y DISCUSIÓN Morfología colonial y microscópica. En forma general, los aislados presentaron las siguientes características: diámetro colonial de 2 a 3 mm; forma circular o irregular; bordes muy variados; superficie lisa; consistencia variada; color crema, blanquecina y blanca; color en UV amarillo cremoso y verdoso para los aislados 7AI y 751; olor a ácido láctico y heces; paso de luz, mate; rizobacterias autóctonas de Culiacán frente a Fusarium oxysporum f. sp. ciceris raza 5, agente causal de la fusariosis vascular del garbanzo, así como caracterizar bioquímicamente a estas bacterias. (Ezziyyani et al., 2004), en medios de cultivo PDA, FLO y AN. Un cm 2 del micelio de Foc raza 5 previamente crecido en PDA, fue sembrado a un cm de la orilla de la placa y se incubó durante siete días a 30 C; posteriormente, se sembró por asada gruesa al centro de la caja cada uno de los antagonistas y fueron incubadas a 28 C por 15 días. Se realizaron tres replicas por aislado. La evaluación de la capacidad antagónica de las rizobacterias fue determinada mediante el Porcentaje de Inhibición del Crecimiento Radial (PICR), empleando la fórmula utilizada por Suárez et al. (2008): PICR= [(R1-R2)/R1]*100; donde R1 es el radio mayor (radio del patógeno-testigo) y R2 es el radio menor (radio del patógeno en cultivo dual). Se utilizó el diseño experimental completamente al azar, con tres repeticiones por tratamiento. La unidad experimental consistió de una caja Petri con Foc raza 5 en confrontación con las rizobacterias nativas. Los datos se compararon con un análisis no paramétrico mediante la prueba de Kruskal-Wallis, para ello se empleó el paquete estadístico SAS Versión 9.1. elevación plana y ligeramente convexa. Los aislados T442 y T3141 presentaron tinción Gram positiva con presencia de esporas; 7AI y 751 resultaron Gram negativas y sin presencia de esporas; lo cual permitió identificarlos como Bacillus y Pseudomonales respectivamente, para proceder a su caracterización bioquímica. Conducta bioquímica. En base a los resultados anteriores, a las bacterias T3131 y T442 se les aplicó el API 50CHB, en 7AI 52

3 y 751 se empleó el API 20NE. Se encontró que los aislados de T3141 y T442 solo difirieron en tres pruebas: Galactoxa, N- Acetil Glucosamina y Gentobiosa, siendo negativas para T3141 y positivas para T442. Con respecto a los aislados 751 y 7AI, las diferenciaciones se presentaron en las pruebas de hidrólisis de la gelatina, asimilación de Ácido Cáprico, Ácido Adípico, Citrato y Ácido Fenil Acético; en la hidrólisis de la Gelatina, la reacción fue negativa para 7AI y positiva para 751, en las otras cuatro pruebas, 7AI presentó conductas positivas y 751 dio negativo a estas pruebas. Mediante el empleo de los sistemas API, los aislados pudieron ser ubicados con un alto porcentaje de identificación; la caracterización del aislado T3141 no fue concluyente (Cuadro 1). Cuadro 1. Identificación taxonómica de los aislados bacterianos. Aislado Taxón significativo % ID T442 T A1 Bacillus subtilis Bacillus megaterium Agrobacterium radiobacter Pseudomonas sp 96,6 50,8 99,9 90,0 Capacidad antagónica. En el Cuadro 2, se presentan los resultados de las confrontaciones realizadas entre las rizobacterias y Foc raza 5. Se aprecia que existen diferencias significativas del PIRC a los 15 días de confrontación. La inhibición varió según la cepa y el medio de cultivo. En PDA las cepas T442 y 751 mostraron la mayor actividad antifúngica, inhibiendo en un 58,1 y 56,8% respectivamente el crecimiento radial de Foc. En AN y FLO, el PIRC por T3141, T442 y 751 fue superior al 58%. Con respecto a la distancia de antagonismo, también se observaron diferencias significativas entre las medias de los tratamientos. La mayor distancia entre antagonista y patógeno se presentó con la cepa 751 en PDA (6.0 mm) y con la cepa T442 en AN (6.3 mm). Los resultados mostraron que las rizobacterias que ejercen mayor efecto antagónico al enfrentar al fitopatógeno fueron T442 y 751, las cuales se identificaron bioquímicamente como Bacillus subtilis y Agrobacterium radiobacter. Las bacterias del género B. subtilis, son de las más utilizadas como biofungicidas por ejercer diferentes mecanismos que influyen negativamente, de forma directa o indirecta, en el crecimiento de patógenos. Diversos autores han informado la actividad antagonista de este género sobre diferentes hongos fitopatógenos lo que se atribuye a la producción de antibióticos y enzimas, entre otros (Ruiz, et al., 2014; Zhao et al., 2010). Cuadro 2. Actividad antifúngica in vitro de cepas bacterianas frente a Fusarium oxysporum f. sp. ciceris raza 5 en diferentes medios nutritivos. Cepas de rizobacterias Crecimiento radial (cm) PICR (%) 15 días de confrontación Distancia de antagonismo (mm) 3 días de confrontación 53

4 T3141 (PDA) 5,6 24,3 ± 0,41 c 1,8 ± 0,29 c T442 (PDA) 3,1 58,1 ± 0,27 a* 3,7 ± 0,51 b 751 (PDA) 3,2 56,8 ± 0,15 ab 6,0 ± 0,19 a 7AI (PDA) 5,0 32,4 ± 0,28 c 1,7 ± 0,5 bc T3141 (AN) 2,8 62,2 ± 0,20 a 2,0 ± 0,73 b T442 (AN) 2,9 60,8 ± 0,15 a 6,3 ± 0,59 a 751 (FLO) 3,1 58,1 ± 0,32 a 1,0 ± 0,14 c 7AI (FLO) 3,5 52,7 ± 0,14 b 1,0 ± 0,13 c Testigo 7,4 - - Medias ± error tipo. *Valores con letras diferentes muestran diferencias significativas (P<0.05). Asimismo, se señala que el efecto antagónico de B. subtilis es producto de su alta velocidad de crecimiento, lo que le permite alcanzar rápidamente el estado estacionario y comenzar a producir metabolitos secundarios con actividad antifúngica y finalmente colonizar el medio de cultivo (Killani et al., 2011). También hay estudios que señalan buenos resultados de A. radiobacter como biocontrolador en CONCLUSIÓN Por su acción antagónica in vitro puede considerarse que las cepas nativas T442 y 751, serían agentes promisorios en el control biológico de la fusariosis vascular ocasionada por F. oxysporum f. sp. ciceris raza 5 en el cultivo de garbanzo. LITERATURA CITADA Carrillo-Fasio, J.A Manejo de la Rabia del Garbanzo. En: Memoria VII Jornada de Transferencia de Tecnología del Cultivo del Garbanzo. Fundación Produce Sinaloa-SAGARPA- Gob. Del Edo. De Sinaloa. Culiacán, Sinaloa. p Ezziyyani, M.; S.C. Pérez; M.E. Requena; L. Rubio and M.E. Candela Biocontrol por Streptomyces diversos cultivos por segregar sustancias bactericidas (Kawaguchi et al., 2008). Los resultados obtenidos por la cepa de Pseudomonas sp. no mostraron efecto antifúngico significativo, resultados que difieren a los obtenidos por Frías (2006), probablemente por el lugar del aislamiento y condiciones del cultivo, lo que determina en gran manera la capacidad de producir metabolitos con efecto antifúngico. Es necesario realizar en el futuro estudios a nivel de invernadero y campo, para avalar el uso de estas cepas en el control biológico de este patógeno, lo que representaría una vía económica y medio ambientalmente promisoria para disminuir la incidencia de la enfermedad. rochei Ziyani, de la podredumbre del pimiento (Capsicum annuum L.) causada por Phytophthora capsici. Anales de Biología 26: Frías, A Detección y aislamiento de metabolitos antimicrobianos producidos por Pseudomonas aeruginosa cepa PSS para el control de hongos fitopatógenos. Fitosanidad 10:

5 Garassini, L.A Microbiología Agrícola. Imprenta Universitaria. Venezuela. 646 p. Hernández-Suarez, M.; F.D. Hernández- Castillo; G. Gallegos-Morales; R.H. Lira-Saldivar; R. Rodríguez- Herrera and C.N. Aguilar Biocontrol of soil fungi in tomato with microencapsulates containing Bacillus subtilis. American Journal of Agricultural and Biological Sciences 6: Kawaguchi, A.; K. Inou and Y. Ichinose Biological control of crown gall of grapevine, rose, and tomato by nonpathogenic Agrobacterium vitis strain VAR031. Phytopathology 98(11): Killani, A.S.; R.C. Abaidoo; A.K. Akintokun and M.A. Abiala Antagonistic Effect of Indigenous Bacillus subtilis on Root- /Soilborne Fungal Pathogens of Cowpea. Researcher 3: Ruiz, S.E.; A.J. Cristóbal; R.A. Reyes; S.J. Tun; R.A. García and A.J. Pacheco In vitro antagonistic activity of Bacillus subtilis strains isolated from soils of the Yucatan Peninsula against Macrophomina phaseolina and Meloidogyne incognita. Rev. International Journal of Experimental Botany 83: Suárez, C.; R. Fernández; N. Valero; R. Gámez and A. Páez Antagonismo in vitro de Trichoderma harzianum Rifai sobre Fusarium solani (Mart.) Sacc. Asociado a la marchitez en maracuyá. Revista Colombiana de Biotecnología 10(3): Velarde-Félix, S.; M. Ramírez-Soto; F. Zamora-Galván; M.G. García- Camarena; A.O. Gaspar-Aguilar; J. Ureta-Téllez; H. Astengo-Cázarez; J. Valdez-Amaya Resistencia de Variedades de Garbanzo a Rabia. En: Memoria VI Jornada de Transferencia de Tecnología del Cultivo del Garbanzo. Fundación Produce Sinaloa-SAGARPA- Gob. Del Edo. de Sinaloa. Culiacán, Sinaloa. p Zhao, Z.; Q. Wang; K. Wang; K. Brian and C. Liu Study of the antifungal activity of Bacillus vallismortis ZZ185 in vitro and identification of its antifungal components. Bioresource Technology 101: