Caracterización morfológica, patogénica y molecular de aislamientos de Ceratocystis spp. en las distintas regiones cafetaleras de Costa Rica

Transcripción

1 Caracterización morfológica, patogénica y molecular de aislamientos de Ceratocystis spp. en las distintas regiones cafetaleras de Costa Rica BARQUERO, Miguel; CORDERO-VEGA, María José INSTITUTO DEL CAFÉ DE COSTA RICA CENTRO DE INVESTIGACIONES EN CAFÉ

2 Objetivo general Determinar la morfología, la patogenicidad y la identificación molecular de aislamientos de Ceratocystis sp. provenientes de las regiones cafetaleras del Valle Occidental, Los Santos, Turrialba, Pérez Zeledón, Coto Brus y el Valle Central de Costa Rica

3 Objetivos específicos Establecer una muestra de cultivos axénicos de la población de Ceratocystis spp. Caracterizar morfológicamente una muestra de la población de Ceratocystis spp. estudiando el tamaño del peritecio, las ascosporas, las clamidiósporas y las conidias, así como diferencias en la coloración de la colonia y las distribuciones de los peritecios. Evaluar la patogenicidad de aislamientos de Ceratocystis spp. en troncos ortotrópicos de plantas de café var. Catuaí. Identificar molecularmente diferencias o similitudes genéticas entre aislamientos que presenten diferencias similares en su morfología y patogenicidad.

4 Introducción La Organización Internacional del Café (OIC, 2014) considera que el café es uno de los productos primarios de mayor valor, superado únicamente por el petróleo. Tiene influencia en la economía y la política de los países productores del grano. Ceratocystis spp. es considerado uno de los patógenos más agresivos, con disminuciones entre el 20 %-40 % de plantas. Ceratocystis spp. puede mantener un alto grado de especialización tanto por sus hospederos como por el área geográfica donde se localizan.

5 Introducción 1890 Saccardo: Sphaeronaema 1923 Elliott: Ceratostomella 1934 Melin y Nannfeldt: Ophiostoma 1935 Davidson: Endoconidiphora 1950 Mundialmente: Ceratocystis*

6 Introducción Se encuentra en la mayoría de suelos cafetaleros. Requiere de una herida previa para infectar al huésped. Diseminación: podas, herramientas contaminadas, terrenos con alta pendiente, insectos de la familia Curculionidae como agentes vectores.

7 Introducción Síntomas externos Síntomas internos

8 Metodología Muestreo de las plantas enfermas a nivel de campo Inspección de 74 fincas con síntomas en las 6 regiones cafetaleras de Costa Rica: *Coto Brus-CB ( m.s.n.m) *Pérez Zeledón-PZ ( ) *Los Santos- LS ( ) *Turrialba-T ( ) *Valle Central-VC ( ) *Valle Occidental-VO ( )

9 Metodología: Recuperación del aislamiento Se colocaron secciones de tejido de la zona interna de avance de la lesión en papa dextrosa agar y rodajas de zanahoria. Obtención de los aislamientos axénicos.

10 Metodología Caracterización morfológica Entre días de colonización del patógeno en el medio de cultivo (presencia de peritecios), se realizó un raspado y se colocó en un porta objetos. Se prepararon tres repeticiones por aislamiento (correspondientes a tres distintas placas petri). Se realizó la caracterización mediante observaciones y mediciones con la utilización un microscopio óptico (Olympus CX31), el cual poseía un lente ocular con micrómetro para medir las variables cuantitativas.

11 Metodología Variables Cuantitativas Ascosporas Clamidiósporas Conidias Variables Cualitativas Ostiolo Base y diámetro de peritecio

12 Metodología Evaluación de la agresividad Var. Catuaí Segmentos tronco: 10 cm largo-2 cm de diámetro Lesión de 1 cm lesión 10 µl solución suspensión de esporas 1x10 6 esporas/ml

13 Metodología Crecimiento final de la colonia a los 15 DDI (con evaluaciones cada 2 días). Incidencia. Esporulación (esporas/lesión). Periodo de incubación. Evaluación de la agresividad Periodo de latencia. Índice de agresividad (FI*LA*SC)/(IP*LP)

14 Metodología Identificación molecular Se seleccionaron 4 aislamientos. Crecimiento micelio en medio líquido. Extracción de ADN. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) con tres regiones de genes: ITS (1-4), B-tubulina y el Factor de Elongación 1-α. Secuenciamiento Alineamiento, programas y especies

15 Resultados Se muestrearon un total de 74 puntos y se obtuvo únicamente 30 muestras positivas para Ceratocystis spp. Población de aislamientos Valle Central 30% Valle Occidental 13% Coto Brus 7% Pérez Zeledón 17% Los Santos 20% Turrialba 13%

16 Resultados Población de aislamientos Plantas aisladas Podas Parches

17 Resultados: Muestreo Puntos de muestreo de Ceratocystis spp. en las distintas regiones cafetaleras de Costa Rica,

18 VC23 VO34 VC21 VO56 LS4 VC1 VC19 LS65 LS63 VC14 PZ46 VO52 PZ3 LS10 VC22 T41 VC18 LS12 LS64 VC15 CB72 PZ28 PZ51 T39 VO68 T43 VC16 PZ67 CB57 T40 Tamaño ascosporas (µm) Resultados: Caracterización morfológica, Ascosporas Tamaño de las ascosporas (µm) 5,43-6, LS LI Normal Aislamiento Frecuencia ,6 6,0 6,4 Tamaño áscosporas (µm) 6,8 Mean 6,244 StDev 0,3905 N 30 Frecuencia poblacional para el tamaño (µm) 3,3 % (5,43) 87 % (5,7-6,8) 10 % (6,9)

19 PZ46 VO56 PZ51 T39 LS12 PZ67 VC1 PZ28 T40 CB57 VC19 LS63 PZ3 VC23 VC21 T41 VC14 VC18 VO68 LS64 VO52 CB72 VC22 VO34 LS65 T43 LS4 LS10 VC16 VC15 Tamaño Conidia (µm) Resultados: Tamaño de las conidias (µm) 20,7-29,2 Caracterización morfológica, Conidias LS LI Frecuencia Normal Tamaño conidia (µm) Mean 25,20 StDev 2,078 N 30 Aislamiento Frecuencia poblacional para el tamaño (µm). 3,3 % (20) 87 % (21-27) 10 % (28)

20 LS64 VC18 VC21 PZ46 LS63 VC23 VO52 VC16 VO34 PZ3 T39 VC15 VC19 PZ51 VC1 CB57 LS4 T41 CB72 VO68 VO56 LS65 PZ28 LS12 LS10 VC14 VC22 PZ67 T40 T43 Tamaño Clamidióspora (µm) Resultados: Caracterización morfológica, Clamidiósporas Tamaño de las clamidiósporas (µm) 13,7-16, LS LI Frecuencia ,6 Normal 14,4 15,2 Tamaño clamidiósporas (µm) 16,0 Mean 14,62 StDev 0,6248 N 30 Aislamiento Frecuencia poblacional para el tamaño (µm) 7 % (13) 90% (14-15) 3,3 % (16)

21 LS10 VO56 VC1 LS12 PZ3 PZ28 PZ46 VC18 VC19 PZ51 VC21 VO52 VC14 LS4 CB57 VO68 VC23 T40 CB72 VC15 T39 VO34 VC22 VC16 T41 LS63 PZ67 T43 LS65 LS64 Base del peritecio (µm) Resultados: Caracterización morfológica, Base de peritecio Tamaño de la base del peritecio (µm) 34,2-71, LS LI 10 0 Frecuencia Normal Tamaño base peritecio (µm) 70 Mean 47,00 StDev 8,438 N 30 Aislamiento Frecuencia poblacional para el tamaño (µm) 13,3 % (34-36) 83% (37-63) 3,3% (71)

22 VO56 LS12 VC15 LS63 PZ51 VC14 VC21 PZ67 PZ46 CB57 PZ3 VC19 VC16 LS64 LS10 T40 VC18 T39 CB72 T43 VO68 VO34 LS65 VO52 LS4 PZ28 VC1 VC23 VC22 T41 Cuello del peritecio (µm) Resultados: Caracterización morfológica, Cuello de peritecio Tamaño del cuello del peritecio (µm) LS LI Frecuencia Normal Tamaño cuello peritecios (µm) 700 Mean 554,8 StDev 98,78 N 30 Aislamiento Frecuencia poblacional para el tamaño (µm) 3,3 % (307) 80 % ( ) 17 % ( )

23 VO52 CB72 VO56 CB57 VC23 PZ46 PZ51 VO68 T40 LS12 T39 LS10 PZ67 VC16 VC18 PZ28 T43 VC22 LS64 VC14 LS65 VO34 LS63 VC21 T41 VC19 VC15 VC1 PZ3 LS4 Diámetro del peritecio (µm) Tamaño del diámetro del peritecio (µm) Resultados Caracterización morfológica, Diámetro de peritecio LS LI Frecuencia Normal Mean 211,7 StDev 34,91 N 30 Aislamiento Frecuencia poblacional para el tamaño (µm) 3,3 % (147) 93 % ( ) 3,3% (297) Tamaño diámetro de peritecios (µm)

24 CB72 VC21 LS12 PZ67 T43 VC16 T39 PZ51 PZ46 VC18 VO52 VO56 T40 VC19 VO34 VC3 T41 PZ28 VO68 VC23 LS64 LS63 LS10 VC22 VC1 CB57 VC15 LS65 VC14 LS4 Ostiolo (µm) Resultados: Caracterización morfológica, Ostiolo de peritecio 70 Tamaño del ostiolo del peritecio (µm) LS LI 10 0 Frecuencia Normal Tamaño ostiolo (µm) 60 Mean 40,56 StDev 8,634 N 30 Aislamiento Frecuencia poblacional para el tamaño (µm) 43 % (24-37) 53 % (38-55) 3,3 % (63)

25 Color Resultados Caracterización morfológica, Distribución peritecios y coloración colonia 40 % (12 aislamientos): Anillos concéntricos 57 % (17 aislamientos): Todo el medio 3 % (1 aislamiento): Grupo central N de aislamientos Amarillo 1 Olivo 18 Pardo grisáceo oscuro 1 Gris olivo 1 Marrón grisáceo 2 Marrón amarillento 1 Marrón 1 Gris olivo claro 1 Olivo pálido 3 Gris olivo oscuro 1

26 Crecimiento de la lesión (cm) Resultados Evaluación de la agresividad: Crecimiento final colonia LS LI Aislamiento ,7

27 Resultados Evaluación de la agresividad: Frecuencia poblacional de crecimiento final colonia Normal 9 8 Mean 7,542 StDev 1,270 N 30 7 Frecuencia % (6,4) 70 % (7-8,8) 10 % (9,6-10) ,8 5,6 6,4 7,2 8,0 8,8 Tamaño final de lesión (cm) 9,6 10,4

28 Resultados Evaluación de la agresividad: Índice de Agresividad 7 % (30000)-Bajos 6 Mean StDev N % ( )-Mode. bajos 33 % ( )-Mode-altos 10 % (160000)-Altos Frecuencia poblacional Índice de agresividad

29 Resultados Evaluación de la agresividad Agrupamiento de los aislamientos de Ceratocystis spp. en cantones según variables morfológicas, patogénicas y climáticas (lluviatemperatura-humedad) correspondientes al I y II semestre año

30 Resultados Identificación molecular: Morfología-Agresividad

31 Resultados Identificación molecular: Morfología-Agresividad Aislamiento Región Cantón/ Distrito Altura (m.snn. m) Diámetro del peritecio (µm) Base del peritecio (µm) Cuello del peritecio (µm) Variable de selección Tamaño del ostiolo (µm) Color micelio Distribución de peritecios en PDA Índice de agresividad LS4 Los Santos Santa María , ,3 Olivo amarillo Todo el medio moderadamente bajo LS63 Los Santos Santa María , Olivo pálido Anillos concéntricos alto T43 Turrialba Santa Cruz ,1-33,6 Amarillo Todo el medio moderadamente alto PZ67 Pérez Zeledón Cajón ,9 469,4 32,8 Marrón Todo el medio moderadamente bajo

32 Resultados Identificación molecular: Comparación variables morfológicas otras especies en café Tamaño (µm) Especie Áscosporas Conidias Clamidiósporas Diámetro peritecio Base del peritecio* Cuello del peritecio Ostiolo Ceratocystis fimbriata s.l Ceratocystis colombiana Ceratocystis papillata Ceratocystis spp. (CR) No reportado hasta los

33 Resultados Identificación molecular: regiones ITS, B-tubulina y el Factor de Elongación 1-α. Árbol filogenético de consenso basado en los criterios de análisis Bayesiano.

34 Conclusiones Los síntomas ocasionados por patógenos de suelo como Rosellinea spp. y Fusarium spp. son similares a Ceratocystis spp. por lo que la verificación de una herida y la presencia de una lesión irregular es característico específico del género Ceratocystis. Existe una mayor presencia de la enfermedad en la región del Valle Central del país. Los aislamientos LS4, LS63, T43 y PZ67 presentan diferencias morfológicas entre ellos, pero mantienen las características similares del género y los aislamientos T43 y PZ67 muestran similitud con la especie C. papillata. Estos aislamientos presentan diferencias en su agresividad y no se muestra una relación directa de esta variable con aislamientos de la misma región geográfica cafetalera del país.

35 . Conclusiones Existen diferencias en la morfología, agresividad y genética de los aislamientos de Ceratocystis spp. en la regiones cafetalera de Costa Rica. Se cuenta con el aislamiento más agresivo (LS63) para estudios en mejoramiento de plantas con resistencia u tolerancia a este patógeno.

36 Gracias