LAURA DANIELA VARGAS RAYO ANA MARIA VICTORINO MANRIQUE

Transcripción

1 LAURA DANIELA VARGAS RAYO ANA MARIA VICTORINO MANRIQUE Director Cesar Alfonso Ariza Castillo Ing. agrónomo M.sc ciencias agrarias con énfasis en fitomejoramiento INGENIERÍA AGRONÓMICA GRUPO DE INVESTIGACIÓN PROSAFIS 2016

2 INTRODUCCION Región pacifica posee 533 especies de orquídeas La región caribe posee una riqueza media de orquídeas La región caribe posee una riqueza media de orquídeas La región andina posee 2542 especies que representan el 77% de orquídeas en Colombia La región Orinoquia posee 143 especies de orquídeas Pero: 3000 especies están en peligro de extinción.

3 DEFINICION DEL PROBLEMA Las semillas de orquídeas carecen de endospermo Reservas energética, necesarias para su germinación. Todas las orquídeas necesitan de hongos formadores de micorrizas Para la germinación y establecimiento en medio natural Conservación de orquídeas en peligro de extinción Desconocimiento de las relaciones simbiótica hongo orquídeas.

4 JUSTIFICACION Colombia posee el 15%, es decir, mas de 3500 spp. del total de las especies del mundo. Se reportan aproximadamente 3000 especies en peligro de extinción. La simbiosis hongo planta permite brindar a la orquídea los nutrientes principales para germinar y desarrollarse. Promover desarrollo y conservación de estas bioindicadoras de diversidad.

5 OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Caracterizar morfológicamente y las secuencias ITS de aislamientos de hongos asociados a raíces de orquídeas en la región del Sumapaz. OBJETIVOS ESPECIFICOS 1. Aislar diferentes muestras de hongos asociados a raíces de diferentes tipos de orquídeas en la región del Sumapaz. 2. Obtener cultivos monomiceliales de los aislamientos realizados y caracterizar dichos cultivos monomiceliales hasta género. 3. Extraer y amplificar la secuencia del DNA de los cultivos monomiceliales con primers o cebadores universales para hongos. 4. Secuenciar los fragmentos de DNA amplificados. 5. Comparar las secuencias obtenidas con las secuencias del GenBank. 6. Construir un árbol filogenético entre los aislamientos obtenidos de los hongos asociados a las raíces de orquídeas.

6 LAS ORQUIDEAS Reino: Plantae División: Magnoliophyta Clase: Liliopsida Orden: Orchidales Familia: Orchidaceae (Juss., nom. cons.)

7 CARACTERÍSTICAS DE LAS ORQUÍDEAS

8 GERMINACIÓN Y RELACIÓN SIMBIÓTICA EN ORQUÍDEAS Semillas de orquídeas polvosas. Pocas reservas de alimento Tienen que ser infectadas las raíces por un hongo formador de micorriza Provee a las plantas jóvenes y nutrientes

9 DIFERENCIAS ENTRE ENDÓFITOS Y HONGOS FORMADORES DE MICORRIZAS ENDOFITOS Microorganismos que crecen dentro de los tejidos. No causan síntomas de enfermedad. Describe donde vive un organismo. HONGOS FORMADORES DE MICORRIZAS Simbiosis formada por hongos y raíces de plantas. Plantas obtienen nutrientes. Relación mutualista.

10 PROCESO DE INFECCION El hongo degrada la cubierta de la semilla Libera la semilla de la dormancia Inicia la germinación Establecimiento de micorrizas orquidioides Emite filamentos y órganos subterráneos

11 CLASIFICACION TAXONOMICA DE Rhizoctonia REINO Fungí PHYLUM Basidiomycota CLASE Basidiomycetes ORDEN ceratobasidiales FAMILIA ceratobasidiaceae GÉNERO Rhizoctonia

12 IDENTIFICACION MORFOLOGICA MICROSCOPICA DE Rhizoctonia Células monilioides Constricción hifal Identificación por medio del la clave taxonómica para hongos imperfectos (Barnett y Hunter, 1998) Bifurcación hifal

13 IDENTIFICACION MORFOLOGICA MACROSCOPICA DE Rhizoctonia Color café de micelio Presencia de esclererocios Crecimiento abundante

14 GEOREFENCIACION

15 GEOREFENCIACION

16 Reserva natural Quinini Parque natural San Rafael COLECTA DE MUESTRAS METODOLOGIA Recorrido en transeptos Identificación orquídea Colecta de raíces

17 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS Almacenamiento de muestras Obtención de explantes de 5mm*5mm a partir de raíces. Siembra, en cámara de flujo laminar. Protocolo de desinfección propuesto por Otero (2002). Incubados a temperatura ambiente 27 c.

18 AISLAMIENTO Montajes directos Observados en el microscopios Identificación de Rhizoctonia Repique de las muestras

19 AISLAMIENTO MONOMICELIAL Obtener cultivo genéticamente puro Micelio esteril Metodología propuesta por el CIAT (2001) Se hace a partir de puntas de hifas.

20 PROCESAMIENTO MOLECULAR Muestras enviadas a CORPOGEN Secuencia consenso NCBI y Unite Extracción de ADN Limpieza por medio de cromatogramas Alineamiento de secuencias múltiples Amplificación de la IT S 1 e IT S 4 Secuenciación Árbol filogenético

21 RESULTADOS MORFOLOGICOS ORQUÍDEAS MUESTREADAS Se colectaron un total de 25 muestras, donde 11 de estas muestras fueron tomadas de la Reserva Natural San Rafael y las 14 restantes en el Parque Natural Quinini, tras este proceso de recolección cada muestra fue tomada de orquídeas diferentes. Las raíces de plantas de orquídeas recolectadas a individuos silvestres que no presentaban señales visibles de enfermedad

22 CENTIMETROS CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE LOS AISLAMIENTOS MUESTRAS

23 CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE LOS AISLAMIENTOS

24 CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE LOS AISLAMIENTOS

25 CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE LOS AISLAMIENTOS

26 CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS DE LOS AISLAMIENTOS

27 CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS DE LOS AISLAMIENTOS

28 CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS DE LOS AISLAMIENTOS

29 RESULTADOS MOLECULARES

30 RESULTADOS MOLECULARES ALINEAMIENTOS DE LAS MUESTRAS

31 RESULTADOS MOLECULARES

32 RESULTADOS MOLECULARES ALINEAMIENTOS DE LAS MUESTRAS FRENTE A RHIZOCTONIA

33 RESULTADOS MOLECULARES

34 RESULTADOS MOLECULARES PHYLUM: Ascomycota Neofosicocum Parvum Colonias en PDA de color gris en estado maduro Reportado por Slippers y Wingfield, 2007 como endófito de plantas leñosas. Producción de pigmento amarillo que se difunden en el agar.

35 RESULTADOS MOLECULARES PHYLUM: Ascomycota Alternaria alternata Hongo filamentoso con conidióforo simples. En medio de cultivo es de color pardo Con septos transversales y verticales a disposición irregular.

36 RESULTADOS MOLECULARES Pleurotus sp. PHYLUM: Basidiomycota Algunas especies comestibles Especies de gran interés como el champiñón.

37 RESULTADOS MOLECULARES PHYLUM: Ascomycota Bipolaris sp. Producción de conidios marrón. Hifas septadas, condioforo café, recto geniculado. Unicelular Reportada como hongo endófito en especies de orquidioides. Colonias aterciopeladas marrón o grisáceas en estado maduro

38 CONCLUSIONES 1. Las orquídeas que se encuentran en la Reserva Natural del Quinini y el Parque Natural San Rafael generalmente presentan microorganismos fúngicos asociados a las raíces de las orquídeas, ya se han de carácter formador de micorrizas o no, o se presenten como hongos endófitos de las raíces de orquídeas. 2. Se aislaron hongos con características morfológicas macroscópicas y microscopias, correspondientes al genero Rhizoctonia.

39 CONCLUSIONES Al comparar las secuencias obtenidas con la base de datos del GenBank se encontró Neofosicocum Parvum, Alternaria alternata, Pleurotus sp. y Bipolaris sp. en la Reserva Natural del Quinini y el Parque Natural San Rafael. El árbol filogenético del alineamiento de las secuencias mostro que las muestras de Alternaria Alternata son muy cercanas o están alineadas, y que las dos muestras bipolaris sp se son muy cercanas alinearon lo cual indico que si representan el mismo genero. A pesar de que estas secuencias tienen un menor porcentaje de identidad con Rhizoctonia que es el hongo formador de micorriza orquidioide mas reportado, según las características microscópicas que presentaron si correspondía a este genero.

40 RECOMENDACIONES Para próximos estudios se recomienda realizar transeptos generalizados a la Región del Sumapaz con el fin de abarcar el mayor territorio posible. Para futuros estudios de micorrizas enfocados al hongo formador de micorriza Rhizoctonia, identificar los enrollamientos hifales en las raíces de las orquídeas (pelotones) y hacer siembra de estos, además amplificar las regiones IT S 5,8s e IT S 28s específicos para este género, teniendo en cuenta que los cebadores permitan la amplificación de estas regiones en amplitudes mayores a 1000pb.

41 RECOMENDACIONES Identificar las funciones ecológicas de los hongos endófitos asociados a las raíces de orquídeas encontrados en el presente trabajo. Para posteriores trabajos se recomienda rectificar la presencia de estos posibles hongos endófitos (Neofosicocum Parvum, Alternaria alternata, Pleurotus sp. y Bipolaris sp) presentes en las orquídeas. Para próximos estudios tomar varias muestras por género de orquídea encontrada y en lo posible en estados juveniles.

42 AGRADECIMIENTOS Al Grupo de Investigación PROSÁFIS, semillero SEMINAC de la Universidad de Cundinamarca. Al laboratorio de microbiología de la Universidad de Cundinamarca sede Fusagasugá, por brindarnos el espacio para desarrollar cada uno de los ensayos y procedimientos y su encargado Alberto Suarez por su colaboración y disposición. Gracias a los docentes Cesar Alfonso Ariza y Paola Moreno por su gran disposición, asesoría, por los conocimientos brindados y continuo apoyo durante el desarrollo de todo el trabajo de grado. A nuestras familias por impulsarnos para cumplir nuestras metas y ser la columna de cada decisión tomada.

43 GRACIAS