DIFERENCIAS DE SENSIBILIDAD A ESTROBIRULINAS EN POBLACIONES DE Mycosphaerella fijiensis

Transcripción

1 DIFERENCIAS DE SENSIBILIDAD A ESTROBIRULINAS EN POBLACIONES DE Mycosphaerella fijiensis Javier Torres, Leonardo Sepúlveda, Mauricio Guzmán & Rafael Arango Unidad de Biotecnología Vegetal UNALMED-CIB Corporación Bananera Nacional Santa Marta, Colombia Agosto 2017

2 Mycosphaerella fijiensis Patógeno de mayor importancia económica en el cultivo del banano de exportación. Se controla mediante el uso de fungicidas químicos. Más del 30% del total de la producción (Churchill, 2011). Perdida de sensibilidad a diferentes fungicidas sistémicos

3 Inhibidores de la Oxidación de Quinona (QoIs)

4 Inhibidores de la Oxidación de Quinona (QoIs) Inhiben la respiración mitocondrial mediante la unión en el sitio Qo (the outer quinoloxidation site) del complejo de la enzima citocromo bc1 (Veloukas et al., 2014; Avila- Adame y Köller, 2003; Kim et al., 2003; Fernández-Ortuño et al., 2010). Fungicidas del grupo Qol se han usado en el cultivo de banano: Se ha encontrado en diferentes hongos fitopatógenos incluyendo Mycosphaerella fijiensis que un único cambio de aminoácidos en el citocromo b confiere resistencia a los fungicidas QoI (G143A) (Grasso, et al., 2006; Fernández-Ortuño et al., 2010; Villani y Cox, 2014; Kim et al., 2003).

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6 Resistencia Cruzada Pyraclostrobin

7 Objetivo General Determinar la presencia de resistencia cruzada a fungicidas del tipo estrobirulinas en M. fijiensis

8 DISEÑO METODOLÓGICO

9 Se emplearon muestras vegetales obtenidas durante los años 2014 y 2015 desde 17 fincas bananeras de Colombia (Urabá y Santa Marta). 4 fincas comerciales 1 Finca Testigo 11 fincas comerciales 1 Finca Testigo Sensibilidad Evaluada: Pyraclostrobin Azoxystrobin 0 ppm 1 ppm 10 ppm Variables experimentales. 1) Porcentaje de germinación 2) Media de la longitud del de tubo germinativo 3) % de inhibición de tubo germinativo

10 A partir del monitoreo de sensibilidad, se procedió al aislamiento monoascosporico de M. fijiensis. 50 aislamientos Crecimiento en medio Sabouraud x 20 días Extracción de DNA genómico CTAB 2X Análisis de secuencias en GENEIOUS Ver 7.1 Primers específicos cyt b, codón 143 (amplicon 400pb)

11 Mediante la participación de CORBANA se analizaron poblaciones Costarricenses de M. fijiensis Monoascosporicos de P. fijiensis colectados en Costa Rica por Corbana 64 muestras de ADN de M. fijiensis Amplificación por PCR del gen CytB (350PB) EC 50 Trifloxistrobin Azoxistrobin Piraclostrobin Comparación de resultados Análisis de secuencias G143A F129L G137R

12 RESULTADOS

13 EVALUACIONES DE SENSIBILIDAD % de germinación En las fincas comerciales los porcentajes de germinación se encuentran sobre el 74%, contrastando con los resultados obtenidos para Piraclostrobin, en los cuales los porcentajes de germinación se encuentran por debajo del 36 %. I.A Azoxistrobin Piraclostrobin Variable % Longitud (µm) % Longitud (µm) mg/l Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Silvestre (1) Silvestre (2) Cuadro 1. Comparación entre los porcentajes de germinación (%) y la longitud promedio en micrómetros alcanzada por los tubos germinativos de esporas que germinaron a 1 y 10 mg/l de de cada ingrediente activo (I.A) azoxistrobin y piraclostrobin, en 15 fincas o poblaciones comerciales y en dos silvestres.

14 Inhibición del tubo Germinativo a 10 mg/l Azoxistrobin % de Inhibición Piraclostrobin Porcentaje Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Finca Testigo (1) Testigo (2) Cuadro 4. Distribución de frecuencias que agrupan los individuos de una finca en porcentajes poblacionales de acuerdo a si se observó a 1 y 10 mg/l de azoxistrobin y piraclostrobin una inhibición entre 0-10; 10-30; 30-50; 50-70; y %.

15 EVALUACION MOLECULAR La mutación G143A se presento en 38 de los 50 aislamientos monoascosporicos. En solo 12 de ellos la mutación no se presenta.

16 EVALUACIÓN MOLECULARES Los individuos que presentan el alelo G143, corresponden en su mayoría a individuos monoascosporicos obtenidos de fincas sin aplicación tradicional de fungicidas. Las mutaciones F129L y G137R no están presentes en ninguno de los aislados Finca I.A µm G143 A143 Finca I.A µm G143 A143 Finca 6 Sin 238 x Finca 4 Sin 293 x Finca 6 Sin 61 x Finca 4 Azo 142 x Finca 6 Azo 213 x Finca 4 Azo 86 x Finca 6 Azo 25 x Finca 4 Pir 106 x Finca 6 Pir 35 x Finca 4 Pir 91 x Finca 6 Pir 177 x Finca 4 Pir 121 x Finca 6 Pir 25 x Finca 10 Sin 202 x Finca 12 Pir 35 x Finca 10 Sin 248 x Finca 12 Azo 253 x Finca 10 Azo 192 x Finca 2 Sin 76 x Finca 10 Azo 197 x Finca 2l Azo 51 x Finca 10 Pir 127 x Finca 14 Sin 66 x Finca 10 Pir 81 x Finca 14 Azo 20 x Finca 11 Sin 147 x Finca 14 Azo 40 x Finca 11 Sin 283 x Finca 13 Sin 71 x Finca 11 Sin 344 x Silvestre 1 Azo 25 x Finca 11 Pir 86 x Silvestre 1 Azo 40 x Finca 11 Pir 106 x Silvestre 1 Sin 116 x Finca 5 Sin 278 x Silvestre 1 Sin 152 x Finca 5 Sin 177 x Silvestre 1 Sin 61 x Finca 5 Azo 253 x Silvestre 1 Sin 157 x Finca 5 Azo 228 x Silvestre 1 Sin 167 x Finca 5 Pir 25 x Silvestre 1 Pir 162 x Silvestre 2 Azo 86 x Silvestre 1 Pir 162 x Silvestre 2 Pir 157 x Silvestre 1 Pir 162 x Silvestre 2 Pir 61 x Cuadro 6. Detección molecular de la mutación G143A en el gen cyt b. Una (x) muestra la presencia de la mutación (A143) o su ausencia (G143), en cada aislamiento monospórico proveniente de una finca o población. Además se muestra si este aislamiento se originó de una espora que germinó en presencia de azoxistrobin (Azo), piraclostrobin (Pir) o en ausencia de fungicida (Sin), así como la longitud que alcanzó el tubo germinativo de esa espora.

17 Alineamiento en secuencia de proteínas de un fragmento del gen codificante del CytB en aislamientos de M. fijiensis. Palacios_1_tran Zent_2.3_transl Zent_2.8_transl Zent_5.1_transl ZTSC_5_translat ZTSC_18_transla ZTSC_27_transla ZTSC_3_translat ZTSC_11_transla ZTSC_6_translat ZTSC_7_translat ZTSC_13_transla ZTSC_12_transla Sincelejo_2_tra Balatana_10_tra Balatana_2_tran Balatana_3_tran Balatana_5_tran Balatana_1_tran Cartagena_9_tra Cartagena_5_tra Cartagena_1_tra Cartagena_8_tra Cartagena_2_tra Encantos_10_tra Encantos_4_tran Encantos_5_tran Encantos_2_tran Encantos_5_tran Estrellares_2_t Estrellares_3_t Estrellares_4_t Estrellares_1_t Estrellares_5_t La_Teresa_4_tra La_Teresa_3_tra La_Teresa_1_tra La_Teresa_5_tra La_Teresa_2_tra Palacios_10_tra Palacios_13_tra Palacios_5_tran Palacios_6_tran Platanera_3_tra Platanera_5_tra Platanera_1_tra Platanera_4_tra Platanera_2_tra Rebusca_10_tran Rebusca_4_trans Rebusca_3_trans Rebusca_2_trans Rebusca_1_trans San_Pablo_2_tra San_Pablo_3_tra G143A

18 Proporción de aislamientos con la mutación G143A del gen cytb en las muestras de M. fijiensis analizadas.

19 Distribución de los aislamientos de M. fijiensis por mutación y valor de EC 50. Clasificación por EC50 Mutación Trifloxistrobin Azoxistrobin Piraclostrobin Sensible (EC50<25) Moderadamente sensible (EC50>25<175) Resistente (EC50>75) G G143A G G143A G G143A

20 Conclusiones No hay correlación clara entre la perdida de sensibilidad entre azoxystrobin y pyraclostrobin. En los controles silvestres se mantiene suceptibilidad a azoxystrobin y pyraclostrobin. La presencia de la sustitución de aminoácidos G143A, no parece estar relacionada con perdida de sensibilidad a pyraclostrobin en M. fijiensis.

21 Conclusiones No se encontraron otras mutaciones asociadas a resistencia a QoIs (F129L y G137R). Al correlacionar los resultados obtenidos con los valores de EC 50 para Trifloxistrobin, Azoxistrobin y Piraclostrobin es evidente la falta de relación entre la presencia de la mutación G143A y la resistencia al Piraclostrobin.

22 Perspectivas Evaluación de resistencia cruzada en campo experimental Análisis del gen completo para determinar otros puntos de mutación asociados a estrobirulinas.

23 Agradecimientos

24 GRACIAS POR SU ATENCIÓN THANKS