Identificación y caracterización de genes involucrados en mecanismos de resistencia a patógenos virales y fúngicos en papa cultivada y silvestre.

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2 Identificación y caracterización de genes involucrados en mecanismos de resistencia a patógenos virales y fúngicos en papa cultivada y silvestre. Las enfermedades causadas por fitopatógenos provocan grandes pérdidas de producción en el cultivo de la papa. El objetivo de nuestro grupo es identificar y caracterizar genes candidatos para resistencia a patógenos virales y fúngicos en papa y desarrollar estrategias de control de dichas enfermedades basadas en Ingeniería Genética. Asimismo, resulta fundamental conocer los mecanismos moleculares involucrados en la resistencia para que ésta sea efectiva y duradera. Director: Dra. Cecilia Vazquez-Rovere Investigadores participantes: Lic. Natalia I Almasia, Dr Esteban Hopp Caracterización del mecanismo de resistencia a PLRV y PVY en plantas transgénicas Existen más de 27 virus descriptos capaces de infectar el cultivo de papa, de los cuales el virus del enrollamiento de la hoja (PLRV), el virus Y (PVY), y el virus X de la papa (PVX) son los más perjudiciales y de mayor distribución alrededor del mundo. La reducción del rendimiento en el cultivo debido a infecciones con PLRV puede alcanzar un 80-90% en cultivares susceptibles, pero se pueden esperar pérdidas aún mayores cuando ocurren infecciones simultáneas con PVY o PVX. Por las características particulares del cultivo, el uso de la ingeniería genética es una alternativa atractiva y prometedora para la introducción de resistencia a enfermedades virales en papa. En este contexto en el grupo se han obtenido y caracterizado plantas transgénicas que expresan la replicasa viral de PLRV que presentaron resistencia a la infección en condiciones controladas. Se demostró que la resistencia está mediada por RNA y que el silenciamiento post-transcripcional está involucrado en el mecanismo de resistencia [Vazquez Rovere y col., 2001; Vazquez Rovere y col., 2002]. Por otro lado, el descubrimiento de supresores de silenciamiento presentes en casi todas las familias virales y el hecho de que la supresión del silenciamiento no es específica para un determinado transgen plantean el desafío biotecnológico de obtener líneas transgénicas resistentes a diferentes virus que puedan coexistir en el campo. Con este objetivo se han obtenido también líneas transgénicas que expresan el gen de la replicasa de PLRV y la proteína de cápside (CP) del virus del mosaico de lechuga (LMV). Esta última confiere resistencia heteróloga al virus Y de la papa (PVY) (Hassairi y col., 1998) aunque se desconoce el mecanismo por el cuál la CP otorga dicha resistencia. En ensayos de desafío en condiciones controladas de invernadero se encontraron líneas que exhibieron inmunidad a PLRV, líneas que mostraron ausencia de infección con PVY y líneas que presentaron inmunidad a ambos virus.

3 Con el fin de caracterizar el mecanismo de resistencia en los distintos grupos de plantas transgénicas descriptos se está realizando un estudio comparativo de expresión de los transgenes y se están llevando a cabo ensayos de transformación transitoria con construcciones que simulan infecciones con PLRV en dos condiciones: sin infectar e infectadas con PVY (portador de uno de los supresores de silenciamiento más caracterizados). Asimismo, con el objetivo de evaluar dichas plantas transgénicas considerando la performance agronómica y la preservación de la identidad del cultivar (crecimiento, vigor, rendimiento) se realizó un ensayo de multiplicación y obtención de minitubérculos de las líneas pre-seleccionadas en colaboración con el grupo del Dr Ricardo Masuelli del INTA- La Consulta y estableciendo un convenio con el Ing Guillermo Aguado, productor de papa de Malargüe, Mendoza. El ensayo se realizó en dicha localidad bajo normas y aprobación de la Comisión Nacional Asesora en Biotecnología Agropecuaria (CONABIA) dependiente de la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentación (SAGPyA). Actualmente se encuentra para su aprobación en la CONABIA un pedido de reiteración de ensayo de multiplicación y obtención de tubérculos. Finalmente, el estudio de la interacción entre distintos virus coinfectantes en condiciones naturales de infección a campo, se realizará en una tercera etapa sobre las plantas brotadas de los tubérculos obtenidos de este segundo ensayo. Estudio de la función y regulación del gen snakin-1 en plantas transgénicas de Solanum tuberosum Las plantas han desarrollado una gran variedad de mecanismos de defensa entre los que se encuentra la producción de péptidos antimicrobianos. Recientemente, se ha aislado de tubérculos de plantas de papa (Solanum tuberosum cv. Desireé) el péptido codificado por el gen snakin-1 (SN1) y se ha demostrado que presenta actividad in vitro frente a patógenos fúngicos y bacterianos de papa y otras especies. (Segura et al., 1999). La secuencia aminoacídica de SN1 comparte homología con genes caracterizados de numerosas especies de plantas, sin embargo la función de estas proteínas no está aún dilucidada. El objetivo de este proyecto es profundizar en la caracterización estructural y funcional del gen snakin-1 mediante el estudio de plantas transgénicas.

4 En la primera etapa de este trabajo se realizó una prospección y estudio de variantes génicas presentes en especies nativas. Fue posible amplificar por PCR, a partir del DNA genómico proveniente de las distintas especies de Solanum (S. commersonii, S.chacoense, S bulbocastanum, S tuberosum cv Kennebec) secuencias homólogas al péptido antimicrobiano snakin-1. Los valores de identidad de las secuencias encontrados dentro del género oscilaron entre el 91 y el 98 %. Esta etapa del proyecto formó parte de un proyecto más amplio, financiado por Comunidad Económica Europea y en colaboración con el grupo de G Jach (Max Plank Institute- Cologne) y de E Ritter (Neikker- Vitoria) que abarcó a otros genotipos de especies silvestres de Solanum encontrando valores de identidad comprendidos entre los valores descriptos. Finalmente los altos porcentajes de similitud encontrados sugieren que el gen snakin-1 podría ser un componente importante de las defensas de las plantas en el género estudiado resultando entendible el alto grado de conservación dentro del marco de la selección natural. En una segunda etapa, nuestro grupo ha obtenido y caracterizado líneas transgénicas que presentan distintos niveles de expresión del gen snakin-1. Con el fin de evaluar los niveles de protección de dichas líneas frente a infecciones fúngicas se puso a punto un ensayo de desafío frente a Rhizoctonia solani en condiciones controladas de invernadero. En estos bioensayos el comportamiento de las líneas sobreexpresantes en suelo infectado respecto a las plantas no transformadas indicaron que el gen snakin-1 está involucrado in-vivo en la defensa frente a infecciones fúngicas. Finalmente, con el objetivo de evaluar el potencial antibacteriano de SN1 se puso a punto un ensayo de desafío a infecciones provocadas por la bacteria Erwinia caratovora. Se realizaron dos desafíos en los cuáles se observó un fenotipo tolerante en las mismas líneas transgénicas que habían mostrado tolerancia en bioensayos de infecciones fúngicas. Estos resultados indican que el gen snakin-1 es un buen candidato para conferir protección contra patógenos de importancia comercial en papa. En forma paralela, con el objetivo de estudiar la región regulatoria del gen snakin-1 se aisló y secuenció, a partir de DNA genómico de Solanum tuberosum, un fragmento de 1400 pb río arriba del codón iniciador de la traducción de dicho gen. El estudio in silico de esta región reveló la presencia de varios elementos regulatorios posiblemente involucrados en el nivel de expresión y en la posible expresión tejidoespecífica del mismo. Con el objetivo de realizar un análisis funcional dicha secuencia fue clonada río arriba del gen reportero que codifica para la enzima betaglucuronidasa. En ensayos de expresión transitoria fue posible detectar la expresión de la proteína reportera en catáfilas de cebolla, ápices, yemas axilares y tubérculos de papa confirmando que la secuencia aislada corresponde a una región

5 promotora. Asimismo en ensayos de agroinfiltración de hojas de N. benthamiana fue posible detectar la expresión de dicha proteína. Actualmente se están llevando a cabo ensayos de transformación estable de papa y de Arabidopsis con el fin de generar plantas transgénicas y caracterizar in-vivo dicha región promotora. Se espera con estos estudios poder determinar los elementos regulatorios responsables de la expresión temporal y espacial del gen snakin-1 y aportar al conocimiento de la función y regulación de esta nueva familia de péptidos.