Lab. De Aves y Porcinos-Instituto de Virología
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- Sergio Moya Godoy
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1 Lab. De Aves y Porcinos-Instituto de Virología GTA-13 de Noviembre de 2015 Dr. Bessie Craig
2 Porque es importante conocer una secuencia genómica? Da información de importancia médica, ecológica, fisiológica, epidemiológica y evolutiva. Detección de polimorfismos en enfermedades- Medicina forense Ecología Molecular: principal objetivo es la aplicación de marcadores de ADN que son estables, discretos y heredables a fin de identificar individuos, poblaciones o especies y estudiar las relaciones que se establecen entre éstos. Enfermedades metabólicas por cambios en la secuencia aa de enzimas Diversidad genética- Determinación de ancestros (genoma humano)
3 2006- Lab. Aves y Porcinos (INTA) La caracterización molecular constituye una poderosa herramienta para realizar estudios epidemiológicos.
4 Porque se avanza más rápidamente en algunos virus y no en otros? (2300 pbs) (30,000pbs) ( pbs) (155,000 pbs) -Tamaño del genoma -Tipo de genoma (DNA vs RNA) -Constitución proteica con importancia inmunológica (nº de proteinas) -Sitio o regiones genómicas variables o hipervariables
5 Gallid Herpesvirus 1 (Herpesviridae-Alfaherpesvirinae-Iltovirus) Lee et al. BMC Genomics 2011, 12:197 DNA dc 155kpb
6 Que herramientas existen para estudiar genomas como el de ILTV? Corta secuencias nucleotidicas en fragmentos de diferente tamaño mediante la utilización de enzimas de restricción Una enzima de restricción (o endonucleasa de restricción) es aquella que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio de restricción. Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 6 pares de bases, con las que son reconocidos. EcoR I SmaI
7
8 E 1 E2
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10 AMPLIFICACION- PCR M1 M2 M3
11 Menendez K, et al, Avian Pathol. 2014;43(2): doi: / (2014)
12 AMPLIFICACION- PCR Purificación Ventaja Lectura nucleótido a nucleótido de la región de interés. No se requieren grandes paneles de enzimas de restricción No se pierde informacion
13 Como analizamos ILTV? gj Se eligieron regiones: Propuestas en otros trabajos como informativas Potencialmente informativas PCR y secuenciación sobre: TK gb gc ICP4 gd gj
14 TK y gc no presentaron diferencias nucleotidicas ICP4 solo diferencia entre vacuna CEO y TCO (pos. 3875, 3927, 3951, 3982, 4017,4309). Haplotipo (Variante) Es un conjunto de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) que están estadísticamente asociados. Posisción nucl. (ATG) gb gd gg gj Haplotipo ER0701 T C T T A C G* T G 5 ER0803 T C C T A C A T A* 4 ER0805 T C C T A C A T A 4 ER0807 T C C T A C G T G 5 ER0806 T C C T A C G T G 5 ER0902 T C C T A C A T A 4 ER0903 T C C T A C A T A 4 RN0909 T C C T A C A T G 2 ER1001 T C C T T* C A T G 3 ER0801 T C C T A C G T G 5 ER0601 T C C T A C A T G 2 BA0907 T C C T T C A T G 3 ER1006 T C C T A C A T G 2 ER0602 T C C T A C A T G 2 ER0603 T C C T A C G T G 5 TCO C T C G A T* A C* G 1 CEO T T C G A C A T G 2
15 TCO CEO TCO ATACG 1 BA10_149_647 ATACG 1 BA10_149_672 ATACG 1 ER11_162_094 ATACG 1 CEO ACATG 2 NQ09_103 ACATG 2 RN09_109.9 ACATG 2 RN1006 ACATG 2 BA10_141 ACATG 2 MzA12_203 ACATG 2 BA10_154(740) ACATG 2 BA10_154 (741) ACATG 2 BA10_152 ACATG 2 BA09_068 ACATG 2 BA11_195(300) ACATG 2 BA11_195(349) ACATG 2 ER0802 ACATG 2 ER06_02 ACATG 2 ER08_04 ACATG 2 ER06_01 ACATG 2 BA11_176 ACATG 2 BAA210 ACATG 2 BA224 GNA ACATG 2 Cba12_245 ACATG 2 BA10_111 TCATG 3 BA09_ 096 TCATG 3 BA156 (BA11_156) TCATG 3 BA149_675 (BA10_ ) TCATG 3 BA09_092 TCATG 3 BA0071 TCATG 3 BA08_057 TCATG 3 BA11_ TCATG 3 BA11_180 TCATG 3 ER10_01 TCATG 3 ER09_01 TCATG 3 ER09_08 TCATG 3 BA156 (BA11_156) TCATG 3 BA08_051 TCATG 3 A TCATG 3 BA09_097 TCATG 3 A TCATG 3 BA11_163 TCATG 3 A196 TCATG 3 BA12_223 TCATG 3 ER1314 TCATG 3 ER0806 ACATA 4 ER0803 ACATA 4 ER0805 ACATA 4 ER0902 ACATA 4 ER0903 ACATA 4 ER1207 ACATA 4 ER1214 ACATA 4 ER1277 ACATA 4 ER1281 ACATA 4 ER0603 ACGTG 5 ER0701 ACGTG 5 ER0702 ACGTG 5 ER0801 ACGTG 5 ER0806 ACGTG 5 ER0807 ACGTG 5 ER0827 ACGTG 5 ER0830 ACGTG 5 ER0909 ACGTG 5 ER1025 ACGTG 5 ER1263 ACGTG 5 ER1266 ACGTG 5 ER1267 ACGTG 5 ER1275 ACGTG 5 ER1284 ACGTG 5 ER1285 ACGTG 5 ER1321 ACGTG 5 ER1322 ACGTG 5 H1 H2 H3 H4 H5 27% La falta de secuencias idénticas en el Genbank sugiere que estas variantes circulan solo en nuestro territorio
16 Datos georreferencias (26/36) Análisis de agrupamiento espacial (SaTScanTM V.8.0) Relación entre Frecuencia de haplotipo observada /esperada Haplotipo 4 y 5 significativamente diferente a lo esperado H1 H2 H3 H4 H5
17 Conclusiones De las 7 regiones genómicas analizadas, la secuencia que codifica para el gen gj fue la mas informativa Según la secuencia gj hay 5 variantes o haplotipos que circulan en nuestro territorio El haplotipo 1 es similar a la vacuna TCO y el haplotipo 2 a la vacuna CEO La circulación de un haplotipo igual al de la vacuna CEO NO indica que la vacuna esta circulando. Sería necesario hacer un estudio de toda la secuencia genómica Los haplotipos 3,4 y 5 son propios de nuestro territorio. No existen estas variantes en secuencias reportadas de otras partes del mundo. Haplotipo 2 es el de mayor dispersión. Circula en varias provincias Haplotipo 3 circula en BA y ER Haplotipo 4 y 5 circulan en ER solamente y restringidos a una región acotada, cercana a la RP 23 (50 a 60 km)
18 Agencia Nacional de Promoción Científico Tecnológica (ANPCyT) PICT Virus de la Laringotraqueitis infecciosa aviar: Estudio de factores del hospedador y virales como determinantes de patogenicidad. Objetivo general Estudiar la presencia de factores del hospedador, tanto genéticos como inmunológicos, y factores virales que determinan el grado de patogenicidad de los cuadros clínicos observados.
19 Gracias Federico Vera M. Florencia Rojas Instituto de Virología- Instituto Biotecnología CICVyA Dr. Guido König Dr. Ariel Vagnozzi Valeria Olivera Claudia van der Ploeg Dr.Andrés Perez (University of Minnesota) Laboratorio de Sanidad Aviar Estación Experimental Agropecuaria Concepción del Uruguay
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