TEMA 22 TÉCNICAS UTILIZADAS EN LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA

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1 TÉCNICAS UTILIZADAS EN LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA 387 TEMA 22 TÉCNICAS UTILIZADAS EN LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA Mª Dolores Pulido Sánchez 1. HEMOGRAMA. Origen. Avances tecnológicos. Todos los procedimientos que se llevaban a cabo para el contaje del número de células en sangre periférica eran manuales, lo que exigía numerosas manipulaciones. A mediados del siglo XX se comenzaron a diseñar los primeros analizadores auto-

2 388 HEMATOLOGÍA: PATOLOGÍAS Y PRUEBAS DIAGNÓSTICAS matizados. Los métodos manuales tradicionales han sido sustituidos por contadores electrónicos que conllevan mejores condiciones en rentabilidad, fiabilidad y condiciones de trabajo. Dichos contadores permiten realizar el hemograma con sangre total anticoagulada con EDTA tripotásico, analizando en pocos segundos miles de células. Definición. El hemograma es un análisis de sangre que mide las variaciones cuantitativas y recuento en porcentajes de los elementos constituyentes de la sangre periférica, es decir, los tres tipos básicos de células, denominadas series celulares, cada serie tiene unas determinadas funciones que se ven alteradas, si varia la cantidad o características de las células que lo componen: - Serie roja o serie eritrocitaria. - Serie blanca o serie leucocitaria. - Serie plaquetaria. Serie roja o eritrocitaria. Esta constituido por hematíes, eritrocitos o glóbulos rojos. Su función consiste primordialmente en transportar el oxigeno desde los pulmones a todos los tejidos y células del organismo. En el hemograma se cuantifica: - Número de hematíes. - Hematocrito: Mide el porcentaje de hematíes en el volumen total de la sangre ( % ). - Hemoglobina: Mide su concentración en sangre (gr./ dl). Es una molécula proteica compleja del hematíe que transporta oxígeno y dióxido de carbono. - Índices eritrocitarios: Proporcionan información sobre: - Volumen Corpuscular Medio (VCP). Mide el tamaño de los hematíes. - Concentración Corpuscular Media de Hemoglobina (CHCM). Mide la concentración de hemoglobina por hematíe. - Hemoglobina Corpuscular Media (HCM). Mide la cantidad de hemoglobina por eritrocito. Los valores varían dentro de la normalidad según la edad y el sexo.

3 TÉCNICAS UTILIZADAS EN LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA 389 Serie blanca o leucocitaria. Está constituido por glóbulos blancos, leucocitos o polinucleares. Tienen función de defensa del organismo frente a infecciones y sustancias extrañas. En el hemograma, el recuento de leucocitos tiene dos componentes : 1. Cifra total de leucocitos en 1mm 3 de sangre venosa. 2. Formula leucocitaria: Mide el porcentaje de leucocitos granulados (Neutroófilos, basófilos y eosinófilos) y agranulados (linfocitos y monocitos) en sangre periférica. El aumento en porcentaje de algún tipo de leucocitos conlleva disminución en el porcentaje de otras. Los valores varían dentro de la normalidad según la edad Serie plaquetaria. Está constituido por trombocitos o plaquetas, que intervienen en la hemostasia primaria y en la coagulación. En el hemograma se cuantifica el número de plaquetas y el volumen plaquetario medio (VPM) que proporciona información sobre el tamaño de las plaquetas. Los valores varían dentro de la normalidad según la edad Estructura del hemograma. El formato de impresión es distinto según la impresora utilizada. Los resultados numéricos van acompañados de gráficos: 1º.- Gráfico de volumen de serie leucocitaria: Con un pico ancho a la derecha que corresponde a los granulocitos y un pico agudo a la izquierda que corresponde a los linfocitos. Entre ambos picos se encuentra los monocitos 2º.- Gráficos de volumen de la serie leucocitaria 3º.- Gráficos de distribución del volumen de la serie plaquetaria Aparecen alarmas de tipo morfológico relacionadas con alteraciones de los parámetros numéricos ( *, L, RH...), debido a que los valores se encuentren aumentados o disminuidos.

4 390 HEMATOLOGÍA: PATOLOGÍAS Y PRUEBAS DIAGNÓSTICAS Tipos de contadores celulares automatizados. Contadores electrónicos o recuento por impulsos eléctricos. Se basa en el principio de Coulter. Consiste en hacer pasar una solución de células a través de un orificio en el que hay registrada una modificación o diferencia de potencial eléctrico mediante un sistema adecuado. Nos informa del número de células que han atravesado dicho campo. La célula desplaza un volumen de electrolitos que induce una diferencia de potencial entre los electrodos, con lo que cada impulso corresponde a un dato, proporcionando la formula y recuento de las series celulares.

5 TÉCNICAS UTILIZADAS EN LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA 391 Contadores Ópticos o recuento por dispersión de la luz. Las células atraviesan un rayo de luz. Se basa en medir la difracción lumínica causada por una partícula, al ser impactada por una luz de gran intensidad. La luz que dispersa cada célula se irradia en todas direcciones y es captada o recogida por un tubo foto multiplicador (foto detectores) que lo transforma en impulsos eléctricos. La cantidad de luz dispersada es proporcional al tamaño celular. Algunos contadores aplican las dos tecnologías e incluso incorporan otras técnicas como la luz polarizada o la radiofrecuencia Utilidad del hemograma. El hemograma es una prueba que sirve para orientarnos hacia el diagnóstico de enfermedades sospechadas por la exploración física o por la historia clínica. Permite detectar: - Análisis cuantitativos de los hematíes (Anemias, policitemias...). - Análisis cualitativos de los hematíes (Hematíes fragmentados por comprometimiento de la micro circulación, depranocitosis falciforme). - Análisis morfológicos de leucocitos que detectan diferentes patologías, dependiendo de su variación (Virosis simple o maligna, leucemias...). - Análisis cualitativos y cuantitativos de plaquetas (Identificación de patologías hemorrágicas: Púrpuras...). Parámetros celulares. Valores normales. A continuación, se citará los parámetros normales de las células sanguíneas, cualquier alteración en su recuento puede originar alteraciones o patologías hemáticas: Anemias, talasemias, leucemias, trombopenias... Los valores normales serán tomados como referencia, ya que están sujetos a variaciones según diferentes autores.

6 392 HEMATOLOGÍA: PATOLOGÍAS Y PRUEBAS DIAGNÓSTICAS Nº de eritrocitos Hombre: 4,5 6,2 millones / mm 3 Mujer: 4,2 5,4 millones / mm 3 Hemoglobina Hombre: gr. /dl Mujer: gr. / dl Hematocrito Hombre: % Mujer: % VCM * Hombre: fl Mujer: fl HCM * pg CHCM * gr. / dl IDH * 11,5 14,5 Nº leucocitos 4 10,5 x 10 3 /ml Neutrófilos % 1,3 7,4 x 10 3 / ml Linfocitos % 0,9 5,2 x 10 3 / ml Monocitos 2 10 % 0,16 1,00 x 10 3 / ml Eosinofilos 1-5 % 0,00 0,20 x 10 3 / ml Basófilos 0,0 1,5 % 0,00 0,20 x 10 3 / ml Nº plaquetas x 10 3 / ml VPM * 7,4 10,4 fl VCM : Volumen Corpuscular Medio HCM : Hemoglobina Corpuscular Medio CHCM :Concentración de hemoglobina corpuscular medio

7 TÉCNICAS UTILIZADAS EN LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA 393 IDH : VPM : Índice de dispersión de hematíes Volumen de plaquetas medio Resultados anormales. Casos prácticos. Glóbulos rojos, hematíes o eritrocitos: Si los valores normales se encuentran disminuidos se dice que presenta el paciente una anemia, si los valores se encuentran aumentados, Poliglobulia. Glóbulos blancos o leucocitos: Si los valores normales se encuentran elevados, se sospecha de una leucemia y habrá que determinar que clase de leucocitos es el que se encuentra aumentado: - Neutrófilos: Su aumento indica infección por bacterias y su presencia indica infección severa, reacción a drogas, presencia o acompañamiento de ciertos tipos de anemias. - Linfocitos: Su aumento se asocia a infecciones de tipo viral (Mononucleosis, Infecciones...) o leucemias tipo linfoide. - Eosinófilos: Su aumento se asocia con alergias o la existencia de ciertos parásitos en el organismo.

8 394 HEMATOLOGÍA: PATOLOGÍAS Y PRUEBAS DIAGNÓSTICAS

9 TÉCNICAS UTILIZADAS EN LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA 395 En esta analítica, se podría decir que el paciente presenta anemia, ya que el hematocrito y la hemoglobina se encuentra en valores bajos, será necesario realizar otras pruebas (ácido fólico, ferritina, Fe...) para determinar su origen. Al presentar la HCM baja, el paciente presenta anemia hipocrómica.

10 396 HEMATOLOGÍA: PATOLOGÍAS Y PRUEBAS DIAGNÓSTICAS Los eritrocitos están tan elevados, que la máquina contadora no ha sido capaz de reconocer tanto incremento de hematíes. El paciente presenta una Poliglobulia, cuyo único tratamiento es realizar una sangría (extracción de una bolsa de sangre, de volumen 450ml. Deberá al cabo del mes realizarse una analítica de control. Las plaquetas se encuentran en valores muy bajos. El paciente puede presentar problemas de coagulación por sangrados incontrolados Factores que interfieren en los resultados del hemograma. Serie roja o eritrocitaria: - Embarazo: Produce hemodilución. - Residencia a gran altitud. - Medicamentos. - Deshidratación: Pérdida de agua en el organismo, que se refleja en la sangre. - Alteración en el tamaño de los hematíes. - Numero elevado de leucocitos. Serie blanca o leucocitaria: - Alimentación.

11 TÉCNICAS UTILIZADAS EN LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA Actividad física. - Estrés. - Ultimo mes de embarazo y en el parto. - Extirpación del bazo. - Medicamentos. Serie plaquetaria: - Ejercicio muy intenso conlleva el aumento del numero de plaquetas. - Residencia a gran altitud. - Medicamentos. 2. BIOQUÍMICA. Existe un continuo intercambio entre los líquidos que se desplazan fuera y dentro de las células y de la sangre. Como consecuencia se miden en los laboratorios las diversas sales minerales, gases, enzimas, hormonas y proteínas sanguíneas que son las causantes de los cambios químicos que se producen en el interior de las células. Las pruebas bioquímicas se utilizan para poder establecer el diagnóstico y tratar la patología. Las pruebas más importantes son: Análisis de sangre, pruebas de función hepática y pruebas de función renal. Constituyentes bioquímicos de la sangre. Creatinina 0,5 1,3 mg /100 ml Glucosa mg / 100 ml Urea mg / 100ml Bilirrubina Total 0,4 1,2 mg / 100ml Bilirrubina Directa hasta 0,4 mg / 100ml Bilirrubina Indirecta hasta 0,5 mg /100ml Ácido Úrico 3 6,6 mg /100ml Ácidos grasos totales mg / 100ml Ácidos grasos libres 8-25 mg /100ml Ácido fólico 3,3 20 mg /100ml Ácidos biliares 0,2-3 mg / 100ml Ácido ascórbico 0,4 1,5 mg / 100ml Albúmina 3,5 5g / 100ml

12 398 HEMATOLOGÍA: PATOLOGÍAS Y PRUEBAS DIAGNÓSTICAS Enzimas - Transaminasa Glutámico Piruvica ( TGP ) 7-33 mu /ml U Karmen - Transaminasa glutámico Oxalacetica ( TGO ) 5 32 mu /ml U Karmen - Fosfatasa ácida ( FAC ) + 11mU /ml - Fosfata Alcalina ( FAL ) mu /ml - Aldolasa 1,3 2,2 mu / ml - Amilasa 4-25 mu / ml - Creatinfosfocinasa ( CPK ) mu / ml - Gammaglutamiltranspeptidasa ( GGT ) mu /ml - Deshidrogenasa láctica mu / ml - Lacticodeshidrogenasa (LDH ) mu / ml Ferritina mg / ml Ferremia mujer mg / 100ml Ferremia hombre mg / 100ml Calcio iónico 4,5-5,5 mg / 100ml Calcemia 8,5 10,5 mg / 100ml Acetona 0,3-2,0 mg / 100ml Alfa 1 antitripsina mg / 100ml Alfa 1 feto proteína 1-20 mg / ml Alfa 2- macro globulina mg / 100ml Aminoácidos 3 5,5 mg / 100ml Amoniaco mg /100ml Antiestreptolisina hasta 250 U Todd Carotenoides mg / 100ml CEA + 2,5 mg / ml Ceruloplasmina mg / 100ml Cinc mg / 100ml Cobre mg / 100ml Cloruros mg / 100ml Citratos 17,5 + 4 mg / l Dióxido de Carbono ( CO2) meq / l Equilibrio ácido base - Base total del suero meq / l - Bicarbonato estándar meq / l

13 TÉCNICAS UTILIZADAS EN LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA ph 7,35 7,45 - pco mmhg ( Torr ) - po mmhg Fibrinogeno mg / 100ml Fosfolipidos mg / 100ml Fósforo inorgánico 2,5 5 mg / 100ml Galactosa 0 10 mg / 100ml Globulinas 2 3 g / 100ml Haptoglobina mg / 100ml Hierro capacidad de fijación mg / 100ml Inmunoglobulinas - Ig A mg / 100ml - Ig D 0,3 40 mg / 100ml - Ig E 0,01 0,3 mg / 100ml - Ig M mg / 100ml - Ig G mg / 100ml Lactato 5 20 mg / 100ml Magnesio 1,8 3,6 mg / 100ml Sodio meq / l Potasio mg / 100ml Transferrina mg / 100ml Nitrógeno ureico ( BUN ) mg / 100ml Nitrógeno no proteico ( NPN ) mg / 100ml NaCl mg / 100ml Osmoralidad del plasma mosmol / l Péptido C 0,3 3,7 mg / l Piruvato 0,7 1,7 mg / 100ml Yodo proteico ( PBI ) 4 8 mg / 100ml Material utilizado. - Tubos de bioquímica: Son tubos preparados para la obtención del suero, fabricados con un material de poliestireno cristalino, lo que permite obtener después de la centrifugación una gran cantidad de suero limpio y exento de fibrina.

14 400 HEMATOLOGÍA: PATOLOGÍAS Y PRUEBAS DIAGNÓSTICAS - Centrifugadora: Es una máquina de laboratorio, accionado por un motor que le imprime un movimiento de rotación rápido, consiste en separar los diferentes componentes que se encuentran en los líquidos corporales, como la sangre. La muestra se introduce en un recipiente que gira a gran velocidad sobre un eje central, la fuerza centrífuga se encarga de separar los hematíes del plasma o del suero. Tener en cuenta que los tubos deben de estar en equilibrio, una enfrente del otro.

15 TÉCNICAS UTILIZADAS EN LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA Analizadores clínicos (Imx). Con este aparato se pueden determinar varios tipos de marcadores, incorporando el programa correspondiendo y añadiendo al suero el reactivo que precisa cada técnica. Marcadores más utilizados: Metabólicos: Vitamina B12. Tiroides: T3L, TSH, T4l. Tumores: Ferritina... Endocrino. Hepatitis, HIV. El Imx consiste en una rueda con 24 celdillas o pocillos, por lo que se pueden llegar a analizar muchos sueros a la vez. Analizar la vitamina B12 con el Imx: Introducimos en la máquina el cartucho de vitamina B12, para que reconozca y analice la técnica que deseamos obtener. Si es la primera vez que utilizamos el aparato, habrá que calibrarlo, para ello necesitamos: 1. Calibración B12 (6 botes enumerados de la A - F). 2. Caja control B12 (3 botes: Control alto, medio y bajo). Cada suero necesita un pocillo. Con 200 Ul de suero es suficiente para que la máquina lo analice. La técnica dura cerca de una hora. No se podrá analizar menos de tres sueros. Para analizar el resto de los marcadores se realiza igual que la vitamina B12, pero con su correspondientes reactivos y cartuchos de identificación.

16 402 HEMATOLOGÍA: PATOLOGÍAS Y PRUEBAS DIAGNÓSTICAS 3. IDENTIFICAR GRUPO SANGUÍNEO. Identificar grupo sanguíneo en porta. En un porta, añadimos 3 gotas de la sangre del paciente (tubo de hematimetria), y cada gota es mezclada con un reactivo. A la primera gota de sangre, le añadimos 1 gota de reactivo anti A, a la segunda gota de sangre, reactivo anti B y a la tercera, reactivo anti D. Observamos si se aglutina o no. En el caso de que aglutine, el paciente presentará dicho grupo, si aglutina el anti D, tendrá un Rh positivo. A continuación, se citará las diversas posibilidades que se pueden dar:

17 TÉCNICAS UTILIZADAS EN LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA Si solamente aglutina el reactivo anti A : A negativo - Si aglutina el reactivo anti A y el anti D : A positivo - Si solamente aglutina el reactivo anti B : B negativo - Si aglutina el reactivo anti B y el anti D : B positivo - Si aglutina los tres reactivos : AB positivo - Si aglutina el reactivo anti A y el anti B : AB negativo - Si no aglutina ningún reactivo : O negativo - Si solo aglutina el reactivo anti D : O positivo Identificar el grupo sanguíneo en tubo de ensayo. Diluimos 2 o 3 gotas de sangre del paciente (Tubo de hematimetria ) en 2ml de suero fisiológico (1/2 tubo aprox.). Vertimos 2 gotas de dicha dilución en un tubo de ensayo y añadimos 2gotas de reactivo anti A. En otro tubo vertimos 2 gotas de la dilución más 2 gotas del reactivo anti B y en el tercer tubo añadimos otras 2 gotas de la dilución, más 2 gotas del reactivo anti D. Centrifugar los 3 tubos durante 10 min. Interpretación. Si el tapón de hematíes esta en el fondo del tubo y al agitarlo no se diluye, se dice que no aglutina, y por tanto será negativo, pero si al agitar el tubo el tapón se diluye completamente, se dice que ha aglutinado,por lo que es positivo, el paciente presenta dicho grupo. Identificar el grupo sanguíneo en tarjetas. Existen unas tarjetas de micro tubos o pocillos que ya vienen preparadas con su correspondiente reactivo anti A, anti B, y anti D. Solamente añadimos 1gota de hematíes diluidos (Dicha dilución es la formada por 1 gota de sangre del paciente + 0,5 ml de una solución de baja concentración iónica). Centrifugar dicha tarjeta durante 10 min. Interpretar. Si aglutina o no. Se interpreta igual que las anteriores. 4. PRUEBAS CRUZADAS. Las pruebas cruzadas consiste en saber si la sangre del donante puede ser transfundida al receptor, para ello, se realizará una serie de procedimientos:

18 404 HEMATOLOGÍA: PATOLOGÍAS Y PRUEBAS DIAGNÓSTICAS - Identificar el grupo sanguíneo del donante y del receptor. - Diluir 1 gota de sangre del donante con 0,5 Ul de solución de baja concentración iónica, para aumentar la valoración de Ac asociados y así mejorar la reacción Ag Ac. - Identificar con los datos del pacientes las tarjetas Coombs y salina (son tarjetas de microtubos con una solución preparada). - Añadimos 50Ul de la dilución + 25 Ul de plasma o suero del receptor en un pocillo de la tarjeta de Coombs y en la tarjeta salina. - La tarjeta de Coombs se incuba a 37ºC y la tarjeta salina a Tª ambiente durante 15min. - Centrifugar ambas tarjetas durante 10min. - Interpretarlas. Si el tapón de hematíes se encuentra en el fondo del pocillo, se dice que las pruebas cruzadas son negativas por lo que no habría ningún problema en la transfusión, ya que la sangre del donante es compatible con el suero del receptor. Si no se encuentra el tapón de hematíes, las pruebas cruzadas son positivas y habrá que montar un panel para averiguar el AC irregular. Panel de Anticuerpos. Si las pruebas cruzadas son positivas, se monta un panel donde se suspenden los hematíes humanos al 0,8 %, para poder identificar los Ac irregulares con técnicas en gel. Los hematíes reactivos (concretamente 11 viales) son soluciones de eritrocitos seleccionados cuidadosamente tratados con ficina estabilizada, que contiene una cantidad estandarizada de unidades de actividad enzimático. Estas células, cuando se utilizan con su correspondiente panel de eritrocitos sin tratar, ayudan a la identificaron de las especificidades de AC simples o múltiples más comunes. Un Ac reacciona de forma específica con el Ag que estimula su producción, por lo que, un Ac podrá identificar según su reactividad frente a un panel de hematíes reactivos de configuración Ag conocida. Cada vial procede de un sólo donante. Las posibles reacciones que se pueden dar son:

19 TÉCNICAS UTILIZADAS EN LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA 405 Interpretación Hematíes propios Hematíes reactivos Auto AC y /o Alo AC Alo Ac Auto AC Ausencia de Alo AC y auto AC Si observamos al analizar, que el autocontrol es positivo (+), debemos de investigar la presencia de AC fríos y efectuar el Test de Coombs Directo (se vera a continuación). Los reactivos se mantendrán entre 2-8ºC, nunca se congelan. Si observamos un deterioro, como turbidez, gran hemólisis o ambas, no usarlo ya que puede deberse a una contaminación microbiana o a una manipulación inadecuada. Tener en cuenta: - Los Ag de baja incidencia pueden no estar representados en los hematíes reactivos, por lo tanto, las reacciones negativas con los mismos, no siempre indican ausencia de AC en el suero del paciente. - Si esta presente AC contra Ag de gran incidencia o AC múltiples, todos los hematíes del panel exceptuando los del autocontrol, podría estar aglutinados. - Los hematíes reactivo no evidencia la presencia de AC anti A o anti B.

20 406 HEMATOLOGÍA: PATOLOGÍAS Y PRUEBAS DIAGNÓSTICAS Interpretación de una tabla de antígenos 5. COOMBS DIRECTO E INDIRECTO. Se fundamenta en la separación, a través de un matriz de microesferas, de eritrocitos aglutinados y de eritrocitos libres. Las reacciones se basan en la detección de hematíes sensibilizadas con Ig y / o fracciones del Complemento mediante un reactivo de antiglobulina humana polivalente Coombs Directo: - Diluimos 1ml de suero de Coombs (Suero de conejo con antiglobulina humana, anti Rh) con 10 Ul de sangre del paciente (Tubo de hematimetria). - Identificar dos pocillos de una tarjeta de Coombs con los datos del paciente. - Dispersar en los pocillos 50 Ul de la dilución. - Centrifugar durante 10 min. - Interpretar. Si el tapón de hematíes se encuentra en el fondo del pocillo, significa que no ha aglutinado, por lo que el Coombs es negativo. Si aglutina

21 TÉCNICAS UTILIZADAS EN LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA 407 (Coombs Directo positivo), el paciente presenta una anemia hemolítica, genera sus propios Ac. Coombs Indirecto: Nos sirva para identificar si el suero de mujeres con Rh negativo, poseen AC capaces de fijarse a los eritrocitos del feto, si la embarazada esta sensibilizada. - Identificar con los datos del paciente una tarjeta de Coombs y una salina. - Añadimos en cada pocillo una gota de reactivo de hematíes 1 y una gota de reactivo de hematíes Ul de suero o plasma. - Incubar la tarjeta de Coombs a 37ºC durante 15min. - La tarjeta salina se deja incubar a Tª ambiente durante 15min. - Interpretar: Hematíes control + suero paciente = Hematíes sensibilizados Hematíes sensibilizados + suero Coombs = Aglutinación BIBLIOGRAFÍA A: \CUADRO HEMÁTICO O HEMOGRAMA 2.htm C: \WINDOWS\Escritorio\hem.htm Enciclopedia Larousse de Enfermería. Volumen 2. Año Editorial Larousse Planeta. S.A. Catálogo. Francisco Soria Melguizo. S.A.

22 408 HEMATOLOGÍA: PATOLOGÍAS Y PRUEBAS DIAGNÓSTICAS