Libro de Consulta: Alberts et al. 5 th Ed Molecular Biology of The Cell Capítulo 6 TRANSCRIPCIÓN

Transcripción

1 Libro de Consulta: Alberts et al. 5 th Ed Molecular Biology of The Cell Capítulo 6 TRANSCRIPCIÓN

2 Dogma central Replicación de ADN Reparación Recombinación Retrotranscripción Síntesis de ARN Transcripción Síntesis de proteína Traducción Aminoacidos

3 La estructura del ARN Cadena sencilla Ribosa (2 y 3 OH) Uracilo en lugar de Timina

4 El ARN puede formar estructura secundaria Dúplex Región de cadena sencilla Tallo - asa Protuberancia Burbujas internas Juntas Desapareamiento, simétrica, asimétrica Tres tallos, cuatro tallos

5 Se permiten modificaciones de las bases en ARN Común para el ARN de transferencia

6 Tipos de moléculas de ARN en bacteria Tipo de ARN Cantidad relativa (%) Coeficiente de sedimentación (S) ARN ribosomal 80 23S 16S 5S Número de nt ARN de transferecia 14 4S 75 ARN mensajero 5 variable variable Otros ARNs no codificantes 1 variable variable

7 Transcripción codificante molde RNA polimerasa Solo se utiliza una de las cadenas como molde El ARN transcrito es complementario a la secuencia de la cadena de ADN que se utilizó como molde y es idéntico a la cadena CODIFICANTE excepto por la presencia de U.

8 Promotor: secuencias de ADN que reconoce la RNA polimerasa y proteínas asociadas a ella para iniciar la transcripción La RNA polimerasa reconoce el promotor en la cadena superior (codificante) y transcribe de izquierda a derecha usando como molde la cadena inferior La RNA polimerasa reconoce el promotor en la cadena inferior (codificante) y transcribe de derecha a izquierda usando como molde la cadena superior

9 Los genes pueden estar ubicados en cualquiera de las dos cadenas de ADN 5 3 DNA of E. coli chromosome gene a gene d gene e gene b gene c 5000 nucleotide pairs RNA transcripts gene f gene g 3 5 F a c u o D i b a a t t b t s La cadena codificante es la superior La cadena codificante es la inferior El PROMOTOR determina la orientación

10 El Promotor se lee de 5 a 3 y determina el INICIO 5 3 Sitio +1 (Inr): sitio donde inicia la Transcripción Caja -10 (Caja TATA): 5 - TATAAT -3 Secuencia 35: 5 - TTGACA -3 Operón: Varios genes regulados por un solo promotor

11 La transcripción involucra tres etapas: Inicio Elongación Terminación

12 Subunidades de la RNA polimerasa bacteriana ω Centro catalítico Especificidad promotor Holoenzima Subunidad Gen Número Función α RpoA 2 Iniciación de la cadena, anclaje de otras subunidades y proteínas reguladoras β RpoB 1 Iniciación y elongación de la cadena, formación de enlace fosfodiester β' RpoC 1 Unióna al ADN ω RpoH 1 Proteína reguladora σ RpoD 1 Reconoce el Promotor

13 El factor Sigma garantiza la unión estable de la RNA pol en el Promotor Los genes que se expresan bajo condiciones particulares, tienen promotores diferentes y utilizan otros factores sigma (diferentes al general, sigma 70) Gen Masa (kda) Uso Secuencia -35 Separación Secuencia -10 RpoD 70 General TTGACAT nt TATAAT RpoH 32 Choque térmico CCCTTGAA nt CCCGATNT RpoN 54 Nitrógeno CTGGNA 6 nt TTGCA flia 28 Flagelar CTAAA 15 nt GCCGATAA

14 Sub-etapas en el INICIO de la Transcripción bacteriana Reconocimiento del promotor Complejo cerrado Factor sigma Complejo abierto (12 nt) Síntesis de 8-10 nt de RNA Liberación de Sigma Escape del promotor

15 Burbuja de transcripción y movimiento unidireccional 3 Elongación 5 5 β' 3 -NTD Híbrido RNA-DNA NTP 3 Sitio activo Mg 2+ Canal secundario -CTD β 5 Canal de salida del RNA Dirección de la transcripción Nature Reviews Microbiology 9,

16 Reacción que cataliza la RNA polimerasa (NMP) n + NTP DNA Mg 2+ RNA polimerasa (NMP) n+1 + PPi - NO requiere cebador - utiliza Mg 2+ como cofactor - utiliza NTPs (ATP, GTP, CTP, UTP) como sustrato - La cadena de ARN crece SIEMPRE en sentido 5 3

17 Terminación

18 En la Terminación se reconocen secuencias que aparecen en el ARN transcrito Terminador intrínseco Terminador Rho-dependiente Debido a una secuencia rica en CG en el RNA transcrito se forma un tallo-asa que pausa a la RNA pol y se libera el ARN recién sintetizado La proteína Rho reconoce en el RNA transcrito secuencias ricas en C (rut), avanza hacia la RNA pol y desenrolla el dúples RNA : DNA, liberando el ARN recién sintetizado

19 Transcripción en eucariontes

20 Tipos de moléculas de ARN en eucariontes Tipo de ARN Cantidad relativa (%) ARN ribosomal 75 28S 18S 5.8S 5S Coeficiente de sedimentación (S) Función Traducción ARN de transferencia 15 4S Traducción ARN mensajero 5 Traducción, Retrotransposición Otros ARNs no codificantes: - snrna - snorna - sirnas - mirnas 5 Splicing de intrones Procesamiento ARNr Silenciamiento epigenético y posttranscripcional Silenciamiento posttrasnscripcional

21 Los organismos eucariontes tienen diferentes tipos de RNA polimerasas RNA Polimerasa I (NRPA) RNA Polimerasa II (NRPB) RNA Polimerasa III (NRPC) RNA ribosomal (rrna) 5.8S, 18S y 28S. RNAs mensajeros (mrna), RNAs pequeños nucleolares (snorna), micro RNAs (mirna), RNAs pequeños interferentes (sirna) y la mayoría de RNAs pequeños nucleares (snrna). RNAs de transferencia (trnas), rrna 5S y algunos RNAs pequeños nucleares (snrnas) En plantas: RNA Polimerasa IV (NRPD) RNA Polimerasa V (NRPE) Involucradas en la síntesis de ciertos sirnas y silenciamiento epigenético

22 Las RNA polimerasas eucariontes tienen cierta homología con la polimerasa bacteriana Núcleo RNA polimerasa E.coli Subunidades Subunidades Subunidades RNA polimerasas eucariontes CTD RNA Pol I RNA Pol II RNA Pol III ARNr ARNm ARNt Subunidades comunes Subunidades adicionales

23 La RNA polimerasa II - 12 subunidades formando un complejo de mas de 500 kda La subunidad mayor I de la RNA pol II contiene un dominio carboxilo terminal (CTD) esencial. cola que se fosforila (CTD) RNA pol bacteriana La fosforilación del CTD es importante para la transcripción y el procesamiento del ARNm.

24 Para el recononocimiento del promotor se requieren los Factores Generales o basales de la Transcripción (GTFs) TATA Sitio de inicio transcripción TBP TFIID TFIIB TFIIA TFIIE TFIIF TFIIH En bacterias sólo se requiere el factor σ para el reconocimiento eficiente del promotor.

25 Promotores Eucariontes: Caracterizados para RNA pol II TFIIB TBP TFIID TFIID BRE TATA Inr DPE GGG CCACGCC TATA A A A T T CC TT AN TCC ATT A A G G T CGTG Elemento BRE TATA INR DPE Secuencia consenso G/C G/C G/A CGCC TATA A/T A/T C/T C/T AN A/T C/T C/T A/G A/T CGTG GTF TFIIB TBP TFIID TFIID Genes and Development 16:

26 Factores generales de la transcripción Clase II (GTFII) TFIID es un complejo multiproteico TBP TATA Binding Protein TFIID + TAFs TBP associated factors TBP Dominio β plegado Surco menor en TATA TATA TBP se une al DNA en la caja TATA provocando una conformación más aplanada. La unión de TBP a un sitio TATA distorsiona la cadena y permite el reconocimiento del sitio +1 por las tres polimerasas eucariontes

27 Factores generales de la transcripción Clase II (GTFII) TFIID es un complejo multiproteico TBP TATA Binding Protein TFIID + TAFs TBP associated factors TBP BRE TFIID TATA TAFs TATA TBP se une al DNA en la caja TATA provocando una conformación más aplanada. La unión de TBP a un sitio TATA distorsiona la cadena y permite el reconocimiento del sitio +1 por las tres polimerasas eucariontes

28 TFIIA BRE TFIID TFIIB TFIIA: Estabiliza la unión de TFIID-DNA. TFIIB: Ayuda a posicionar al complejo de factores y la RNA pol II sobre el promotor. -Interacción TFIIB-TFIID y TFIIB-DNA (mediante elemento BRE) - Se relaciona con la selección del sitio de inicio de la transcripción

29 TFIIF: Se une fuertemente a la RNA pol II Afecta la topología del DNA. Tiene actividad de helicasa para ayudar a abrir la doble cadena en el sitio +1 TFIIF RNA pol II

30 TFIIE TFIIH TFIIE: Recluta a TFIIH y regula sus actividades de helicasa y cinasa TFIIH: Complejo de 9 subunidades: Poseé 3 actividades: Helicasa dependiente de ATP para abrir la doble hélice e iniciar transcripción. Actividad de cinasa para fosforilar el Dominio Carboxilo Terminal (CTD) de la RNA pol II y permitir escape del promotor. Actividad de exonucleasa para reparar errores en MMR.

31 Escape del promotor en eucariontes A diferencia de bacterias la apertura del promotor y la formación de la burbuja para el inicio de la transcripción requiere la hidrólisis de ATP y es mediada por TFIIH mediante su actividad de helicasa. El escape del promotor requiere de la fosforilación del CTD de la subunidad mayor de RNA pol II NTP ATP ADP El CTD está conformado por varias repetidas del heptapéptido: Tyr-Ser- Pro-Thr-Ser-Pro-Ser (52 en humano)

32 Comparación Inicio de la transcripción Bacteria Eucariontes BRE TATA TBP TAFs TFIID Unión TBP BRE Cambio conformacional Unión Holoenzima TFIIA TFIIB Unión TFIIB Complejo cerrado TFIIF RNA pol II Unión RNA pol II y TFIIF Complejo abierto Síntesis de RNA TFIIE Complejo de pre-inicio Liberación de Sigma TFIIH Unión TFIIE y TFIIH Complejo de inicio Escape del promotor NTP ATP ADP Síntesis de RNA Fosforilación de CTD de RNA pol II y liberación de varios factores TFII Escape del promotor

33 Para la transcripción eucarionte, además de los GTFs son necesarios factores adicionales como: Proteínas regulatorias de unión a DNA, proteínas modificadoras de histonas, remodeladores de cromatina y otros factores... Los complejos remodeladores de la cromatina facilitan cambios en la localización de los nucleosomas Acetiltransferasa Maquinaria transcripcional HAT Activación de la transcripción Silenciamiento Genético Proteína 1 to Even te n e frecu Acetilación en N-terminal de histonas Sitio de unión Proteína 1 Sitio de unión Proteína 2 HDAC Desacetilasas Even to raro Proteína 2 Las modificaciones en los tallos Nterminal de la histonas producen cambios en la accesibilidad del ADN.

34 ACTIVADORES: Proteínas que unen secuencias distantes en el DNA llamadas enhancer o intensificador y estimulan la transcripción. MEDIADOR: Complejo MULTI-proteico que comunica a los Activadores/Represores con TGFs/TAFs para REGULAR los niveles de Transcripción (NO se une directamente al DNA) DNA ENHANCER Secuencia de activación (UAS) Sitio de Inicio de la Transcripción Exón Intrón Exón Intrón Exón Región terminal Río arriba (upstream) SILENCER Promotor Secuencia de represión (URS) Río abajo (downstream) Represores: Proteínas que unen secuencias distantes en el DNA llamadas silencer o silenciador y reprimen la transcripción. GTFs: Factores generales o basales de transcripción; TFI (RNA pol I), TFII (RNA pol II), TFIII (RNA pol III).

35 Esquema General del Complejo Transcripcional Eucarionte Activador TATA TSS Enhancer GTFs RNA polimerasa Mediador Complejos remodeladores de la cromatina Complejos modificadores de histonas (acetilasas) Mediador Complejo remodelador de cromatina Enzima Modificadora de histonas La transcripción comienza

36 Inhibidores de la Transcripción bacteriana Las rifampicinas son antibióticos producidos por Streptomyces mediterranei, con buena actividad contra bacterias Gram-positivas y contra Mycobacterium tuberculosis. Su mecanismo de acción estriba en la inhibición del inicio de la transcripción, uniéndose de modo no covalente a la subunidad ß de la RNA polimerasa bacteriana.

37 Inhibidores de la Transcripción eucarionte La Actinomicina D es producida por Streptomyces y es potente inhibidor de transcripción y replicación. Se intercala entre G-C en la doble hélice de ADN e inhibe elongación.

38 Inhibidores de la Transcripción Eucarionte La α-amanitina es un octapéptido bicíclico que se obtiene del hongo Amanita phalloides. Inhibe la transcripción de la RNA polimerasa II eucarionte a nivel de inicio y elongación. Específico para la RNA pol II