I. Introducción FACULTAD DE CIENCIAS POSGRADO EN INGENIERÍA ELECTRÓNICA

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1 FACULTAD DE CIENCIAS POSGRADO EN INGENIERÍA ELECTRÓNICA MÉTODO ÓPTICO PARA DETECCIÓN DE BIOMARCADORES EN PIEL DE PACIENTES CON ENFERMADES NEURODEGENERATIVAS PRIMER AVANCE DE TESIS: NOVIEMBRE 2015 ALUMNA: MARITZA FABIOLA LEÓN BEJARANO DR. MIGUEL GHEBRÉ RAMÍREZ ELÍAS ASESORES: DR. MARTÍN OSWALDO MÉNDEZ GARCÍA I. Introducción Las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por pérdida progresiva e imparable de neuronas en determinadas zonas del cerebro, y como consecuencia de esta pérdida de neuronas el deterioro de la funcionalidad asociada a las partes afectadas, siendo esta pérdida de neuronas aun de origen desconocido [1]. Dos patologías de este tipo son el Alzheimer y Parkinson. Generalmente las enfermedades neurodegenerativas se presentan en personas que pertenecen al grupo de la tercera edad (mayores a 65 años) y se prevé que la prevalencia de estas patologías se duplique [1] dado el aumento en la esperanza de vida humana. Esto ubica a las enfermedades neurodegenerativas como un problema de salud pública ya que actualmente no existe una cura. Se estima que en México más de 350 mil personas padecen Alzheimer y más de 500 mil la enfermedad de Parkinson [1]. Las enfermedades de Alzheimer y Parkinson, son las de mayor incidencia en la lista de enfermedades de este tipo, ocupando los tres primeros lugares de ocurrencia en México. Estas enfermedades provocan la muerte aproximadamente del 50% de las personas que las padecen, causan secuelas graves debido a la perdida de neuronas, llegan a incapacitar a las personas que la padecen en funciones que van desde realizar las tareas más sencillas y vitales [2]. La enfermedad de Alzheimer es un trastorno neurodegenerativo con rasgos clínicos patológicos característicos [3]. Los síntomas característicos de esta patología consisten en la disfunción de la memoria que comprende la alteración del aprendizaje de nueva información: la amnesia de corto término y en casos avanzados amnesia de la información previamente bien preservada, desorientación progresiva en tiempo y lugar. Además, se asocian alteraciones del lenguaje, circunlocuciones compensatorias, el lenguaje es típicamente vago, inespecífico y puede tener aumento de frases automáticas y clisés, déficits cognoscitivos focales: acalculia, desorientación derecha e izquierda y cambio de personalidad, así como liberación de la proteína Tau por las neuronas lesionadas y depósito excesivo de la proteína β-amiloide [4]. El diagnóstico se realiza mediante evaluación estandarizada por instrumentos clínicos (por ejemplo MMSE), pruebas de laboratorio como punción lumbar para determinar las concentraciones en el líquido cefalorraquídeo de proteína Tau y β-amiloide, así como 1

2 estudios de gabinete para determinar las regiones cerebrales afectadas como: tomografía computarizada (TC), tomografía computarizada por emisión de positrones (PET), tomografía por emisión de fotón único (SPECT) y resonancia magnética (RM) [2]. La enfermedad de Parkinson es una enfermedad que se caracteriza por una disminución en la producción de dopamina, como consecuencia de la pérdida masiva de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra. En esta enfermedad se localizan lesiones en los ganglios basales, así cuerpos de Lewy en personas con Parkinson que contienen agregados de la proteína α-sinucleína [3]. Las personas con Parkinson desarrollan temblor, rigidez asimétrica de miembros, rigidez unilateral de miembros, bradicinecia, alteración postural, distonia unilateral de miembros, apraxia ideomotora; así como dolor, disfagia, cambios de la personalidad, demencia, depresión y disminución de la olfación, considerada esta última como una característica fenotípica del Parkinson [5]. El diagnóstico del padecimiento de Parkinson en estadios tempranos es difícil. El diagnóstico se realiza mediante criterios clínicos (sintomatología) y estudios de neuroimagen, estudios de laboratorio de detección de olor así como videofluorografía [5]. Sin embargo, uno de los grandes problemas de las enfermedades neurodegenerativas es encontrar metodologías que permitan la detección de marcadores biológicos y no invasivos para el diagnóstico precoz [3]. Para atender ésta necesidad, nuevos estudios se han desarrollado buscando alternativas como el análisis del sistema olfatorio en procesos de memoria, aprendizaje y conducta; múltiples circuitos y hormonas. Sin embargo, estas investigaciones no han dado soluciones que puedan ayudar a diagnosticar de forma temprana alguna de estas enfermedades neurodegenerativas [2]. Por todo lo expuesto anteriormente es importante que se desarrollen nuevos protocolos de investigación de bajo costo y simples, es decir que no conlleven a una preparación para ser desarrollados, que no sean invasivos, que no sean costosos, no dañen la muestra y que permitan realizar un diagnóstico temprano de este tipo de enfermedades, aun en personas que no presenten un cuadro clínico bien definido. Recientemente han surgido métodos derivados de diferentes disciplinas, entre las que destacan la óptica y computación, esto solo por citar algunas. Los cuales están siendo incorporados como herramientas para facilitar el análisis de muestras provenientes de tejido biológico, como puede ser piel, sangre, órganos, etc., y están siendo explorados como métodos de apoyo al diagnóstico de ciertas enfermedades; entre estos métodos destaca la espectroscopía Raman, la cual entre las ventajas que ofrece se encuentran: proporciona información bioquímica de la muestra en poco tiempo (segundos), es una técnica no invasiva, no es necesario realizar un tipo de preparación especial a la muestra que se desea analizar, es una técnica segura que no daña a la muestra que se está analizando, así como es certera y fácil de obtener, al no influir el medio en el cual se encuentra la muestra para la recolección de esta [6][7]. La espectroscopía Raman se ha combinado en trabajos previos con técnicas de análisis de datos, las cuales entre algunas ventajas que ofrecen se encuentran: que es posible realizar el análisis bioquímico de las muestras sin discriminar información, es decir considerando 2

3 todas las variables involucradas en el estudio, así como facilitan la identificación de las relaciones entre muestras considerando su composición bioquímica [8]. Por tales motivos esta tesis, se centra en la identificación de biomarcadores en piel de pacientes con enfermedades neurodegenerativas, mediante el uso de espectroscopía Raman y técnicas de análisis de datos, los cuales pueden ayudar a dar un indicio de una nueva forma de diagnóstico para las personas con estos padecimientos. II. Estado del arte En los últimos años se han realizado investigaciones para la identificación de marcadores biológicos para la detección de enfermedades neurodegenerativas, específicamente Alzheimer y Parkinson. Rodríguez Leyva et al, realizaron un estudio de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia en el que identificaron la presencia de α-sinucleina en piel, con diferencias claras entre biopsias de controles y pacientes con enfermedad de Parkinson [9]. Rodríguez Leyva et al demostraron la presencia de Tau-fosforilada en biopsias de piel de pacientes con la enfermedad de Alzheimer, mediante inmunohistoquímica, como resultado se obtuvo que los pacientes con Alzheimer presentaban mayores niveles p-tau, en comparación con las biopsias de los controles [10]. Por su parte Maiti Nakul et al mediante espectroscopía Raman caracterizaron la α- sinucleína in vitro (proteína presente en la enfermedad de Parkinson) y encontraron que las bandas 1653 cm -1, 1667 cm -1, cm -1 asociadas a la banda de la amida I permiten detectar presencia, cambios relativos en la estructura molecular o determinar la estructura de la α-sinucleina, y por tanto estas características espectrales pueden ser usadas para determinar la estructura de agregados de α-sinucleina que se forman in vivo [11]. Por otra parte Carmona et al, aplicaron espectroscopía Raman a plasma de sangre para identificar diferencias entre pacientes con Alzheimer y sanos. Mediante el método de análisis discriminante lograron diferenciar entre tejido sano y enfermo, así como identificaron siete biomarcadores espectrales en las regiones Raman de: cm -1, cm -1, 790 a 730 cm -1 y cm -1. Su modelo de análisis discriminante obtuvo una sensibilidad del 89% y especificidad del 92%, al clasificar las muestras de los pacientes [12]. Sudworth et al realizaron un estudio con tejido de cerebro ex vivo post-mortem con espectroscopía Raman y los espectros obtenidos fueron comparados con espectros de muestras de tejido de control, enfermedad de Huntingdon y Alzheimer, Los resultados mostraron diferencia en el contenido y conformación, registrando altos niveles de agregación de proteínas en tejido enfermo, mediante el uso de la técnica de análisis de componentes principales, que permitió diferenciar entre tejido sano y enfermo [13]. III. Objetivo general Analizar y estudiar las diferencias de los espectros Raman de piel de personas con enfermedades neurodegenerativas y personas sanas. 3

4 IV. Objetivos específicos Adquisición de espectros Raman de personas enfermas y sanas, provenientes de biopsias de piel. Construcción y calibración del sistema. Extracción de características de los espectros Raman. Validación entre diagnóstico médico y el diagnóstico mediante el efecto Raman. V. Actividades realizadas durante el periodo Agosto-Enero 2015 Durante el periodo Agosto- Enero 2015, se realizaron las siguientes actividades: Se están cursando las materias de: o Reconocimientos de patrones o Seminario de escritura técnica y científica. Se ha realizado búsqueda de información bibliográfica: Marco teórico y estado del arte. Se realiza una revisión sobre los métodos de eliminación de fluorescencia de espectros Raman. i. Revisión de métodos de eliminación de fluorescencia de espectros Raman Al realizar la medición de espectros Raman, en ocasiones estos van acompañados de ruido, el cual se debe a distintos factores como pueden ser el ruido debido a la luz, ruido por agentes externos o ruido que se encuentra ya incluido en la muestra. Por lo que será necesario someter a los espectros Raman a un preprocesamiento espectral, por ejemplo la corrección de la línea base para contrarrestar el ruido debido a la fluorescencia que se encuentra siempre presente en espectros Raman de muestras biológicas y que puede llegar a enmascarar picos Raman importantes en los espectros [14]. Algunas técnicas propuestas para la eliminación de fluorescencia de fondo de espectros son: ajuste polinomial, transformada rápida de Fourier, transformada wavelet, análisis de componentes principales (ACP) y algoritmo de Vancouver. En ésta etapa del proyecto se comenzó estudiando las técnicas de: Algoritmo de Vancouver y la posible aplicación de la descomposición empírica de modos (Empirical mode decomposition en inglés, EMD). A continuación se hablará brevemente de estas dos técnicas. ii. Algoritmo de Vancouver Es una técnica derivada del método de ajuste polinomial y es uno de los métodos más usados para remover fluorescencia de espectros Raman en aplicaciones biomédicas Raman 4

5 in vivo. La fluorescencia es modelada como una función polinomial de grado entre 4 a 6. Sin embargo, tiene como desventaja la dependencia de la elección del orden polinomial. Este algoritmo considera dos etapas [15]: 1) En la primera iteración los picos con intensidad mayor al polinomio de ajuste, son considerados como picos Raman y se eliminan, para no ser considerados en las siguientes iteraciones de ajuste. 2) La segunda etapa, consiste en ajustar el espectro que se obtiene de la primera iteración, los valores mayores al polinomio de ajuste serán reemplazados en el nuevo espectro por el polinomio, más la desviación estándar del espectro, considerándose esta desviación como una aproximación del nivel de ruido; cuando la señal Raman sea menor que el polinomio, será asignado en el nuevo espectro el valor de la señal original. 3) El algoritmo termina cuando (DEV i DEV i 1 ) DEV i < 5%, siendo DEV i la desviación estándar del espectro en la iteración i y DEV i 1 la desviación estándar en la iteración i 1. El espectro final sin fluorescencia se obtiene de la diferencia del polinomio ajustado con la señal Raman original. iii. Descomposición empírica de modos EMD (por sus siglas en inglés) es un método de análisis de datos adaptativo en tiempofrecuencia. La descomposición empírica de modos considera que toda señal es una fusión de señal más ruido (Ecuación 1), la cual puede descomponerse en un número finito de componentes [16]. x(t) = s(t) + n(t) (1) En donde x(t) es la señal libre de ruido, s(t) la señal original y n(t) el ruido. El procedimiento del EMD se lleva a cabo de forma iterativa de la siguiente manera [16] [17]: 1) Se identifican los extremos de la función (máximos y mínimos), y se conectan con un spline cúbico, para obtener una envolvente superior y una inferior. 2) Posteriormente se obtendrá la primera componente (IMF por sus siglas en inglés), mediante la diferencia de la señal y el promedio de las envolventes obtenidas en el paso número 1. 3) El resultado del paso anterior se considerara como la nueva señal, que será sometida nuevamente a los pasos 1 y 2, hasta que la señal se convierte en una función monótona de la cual no se pueden extraer más IMF (Ecuación 2). r n 1 c n = r n (2) 5

6 En donde r n 1 es el residuo de la iteración anterior, c n es la IMF de la iteración actual y r n el residuo actual. Finalmente tendremos una descomposición de los datos en los n modos empíricos (Ecuación 3) [17]. n x(t) = j=1 c j + r n (3) En donde n es el número de modos extraídos, c j es cada una de las IMF y r n el residuo de los datos x(t). Entre las ventajas de este método se encuentran que no es necesaria la interacción del usuario para seleccionar algún parámetro del cual se deba partir para corregir la línea base. iv. Resultados Los dos métodos explicados anteriormente para el preprocesamiento espectral fueron implementados en R, para que posteriormente sean comparados junto con los demás métodos mencionados al inicio de esta sección. A continuación se muestra un ejemplo de someter a eliminación de fluorescencia un espectro Raman de piel, de acuerdo al código implementado (Figura 1): Figura 1. Comparación entre a) espectro Raman de piel con fluorescencia y b) con corrección de línea base por medio del algoritmo de Vancouver y EMD v. Conclusión Como se observa en la Figura 1, con ambos métodos se obtiene una señal con una porción de disminución de la fluorescencia, en la cual se puede ver como la línea base se ha corregido en su mayoría aunque no totalmente, en gran parte del espectro, logrando resaltar picos Raman que se encontraban cubiertos por la fluorescencia, con ambos 6

7 métodos se obtiene un espectro con un línea base similar, excepto en algunas frecuencias en las que se ve una mínima diferencia de intensidad, por tal motivo se planea implementar más métodos de los mencionados al inicio de esta sección, para posteriormente comparar los resultados. Finalmente, en los próximos meses se realizará la evaluación cuantitativa de la eliminación de Fluorescencia entre los métodos utilizados y la propuesta del EMD. VI. Cronograma de actividades Actividades Agosto Enero 2015 Febrero Julio ) Clases Agosto 2016 Enero 2017 Febrero Julio 2017 Periodo Agosto 2017 Enero 2018 Febrero Julio 2018 Agosto 2018 Enero 2019 Febrero Julio ) Seminario del PIE 3) Fundamentación y documentación bibliográfica 4) Construcción y calibración del sistema 5) Prueba piloto 6) Preprocesamiento de muestras 7) Escritura y publicación de artículo 8) Extracción de características 9) Estancia de investigación 10) Validación del sistema 11) Redacción y corrección de tesis Actividades realizadas. Actividades programadas para el siguiente semestre. 7

8 VII. Referencias [1] R.-Antigüedad Zarranz Alfredo. Enfermedades neurodegenerativas. Dossier Trastornos neurodegenerativos (pp 17-19). [2] Navarrete Evelia, Prospéro Oscar, Hudson Robyn, Guevara Rosalinda. (2001). Enfermedades neurodegenerativas que cursan con demencia. Academia nacional de medicina de México (Vol No 2, pp ). [3] Carreres M.a. Abril, Falguera N. Ticó y Garreta Figuera R. (2004). Enfermedades neurodegenerativas. Servicio de Rehabilitación. Hospital Mútua de Terrassa. Barcelona (Vol. 38:6, pp 18-24). [4] Llibre Rodríguez Juan de J. y Guerra Hernández Milagros A.. (1999). Enfermedad de Alzheimer, situación actual y estrategias terapéuticas. Rev Cubana Med (Vol. 38:2, pp ). [5] González-Torres Laura Clementina y Armendáriz-Borunda Juan. (2005). Aspectos inmunológicos en la enfermedad de Parkinson. Arch neurociencia (mex) (Vol. 10:3, pp ). [6] Cox Rick. (2010). Qualitative analysis and the answer box: A prespective on portable raman spectroscopy. Analytical chemistry feature (Vol. 82:9, pp ). [7] Naglic Peter. (2012). Raman spectrocopy for medical diagnostics. University of Ljubljana Faculty of Mathematics and Physics. Department of Physics. [8] Wehrens Ron. (2011). Chemometrics with R. Multivariate Data Analysis in the Natural Sciences and Life Sciences. Editorial Springer. [9] Rodríguez-Leyva I., Calderón-Garcidueñas AL, Jiménez-Capdeville ME, Rentería-Palomo A., Hernández-Rodríguez HG, Valdés-Rodríguez R., Fuentes-Ahumada C., Torres-Alvarez B., Sepúlveda-Saavedra J., Soto-Domínguez A., Santoyo ME, Rodríguez_Moreno JI, Castanedo- Cázares JP. (2014). α-synuclein inclusions in the skin of Parkinson s disease and parkinsonism. Ann. Clin. Traslational. Neurol (Vol. 7, pp ). [10] Rodríguez-Leyva I., Chi-Ahumada E., Calderón Garcidueñas A.,Medina-Mier V., Santoyo ME, Martel-Gallegos G., Zarazúa S., Carrizalez J. and Jiménez-Capdeville ME. (2015) Presence of phosphorylated Tau protein in the skin of Alzheimer s disease patients. Journal of Molecular Biomarkers & Diagnosis. [11] Maiti Nakul C., Apetri Mihaela M., Zagorski Michael G., Carey Paul R. y Anderson Vernon. (2004). Raman Spectroscopic Characterization of Secondary Structure in Natively Unfolded Proteins: α-synuclein. J. AM. CHEM. SOC (Vol. 126, pp ). 8

9 [12] Carmona Pedro, Molina Marina, Calero Miguel, Bermejo-Pareja Félix, Martínez-Martín Pablo y Toledano Adolfo. (2013). Discrimination Analysis of Blood Plasma Associated with Alzheimer s Disease Using Vibrational Spectroscopy. Journal of Alzheimer s Disease (Vol. 34, pp ). [13] Sudworth Caroline D, Archer John K J, Black Richard A y Mann David. Advances in Raman Spectroscopy for Diagnosis of Alzheimer's Disease. Proc. of SPIE (Vol. 6093). [14] Ferraro John R. et al. (2003). Introductory Raman Spectroscopy. Elsevier. [15] Zhao Jianhua, Lui Harvey, Mclean David I. y Zeng Haishan. (2007). Automated Autofluorescence Background Subtraction Algorithm for Biomedical Raman Spectroscopy. Applied Spectroscopy (vol. 61:11, pp ). [16] Wu Zhaohua y Huang Norden E. (2009). Ensemble empirical mode decomposition: A noise-assisted data analysis method. World scientific publishing company (Vol. 1:1, pp 1 41). [17] Wu Zhaohua 1 y Huang Norden 2 E. Ensemble Empirical Mode Decomposition: A Noise Assisted Data Analysis Method. Center for Ocean-Land-Atmosphere Studies 4041 Powder Mill Road, Suite 302 Calverton, MD 20705, USA 1 y Laboratory for Hydrospheric and Biospheric Processes NASA Goddard Space Flight Center Greenbelt, MD 20771, USA 2. Agosto Disponible en: ftp:// 9