Evaluación de antígenos recombinantes para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas REVOLLO, Susana OROCONDO, Giovanna SOTO, Maria Luz GARCIA, Giovanni Unidad de Biología Molecular, Instituto SELADIS, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, UMSA, Telf. 222436, Fax 224895, Email: revollo@2hb.net, Av. Saavedra Nº 2224, La Paz - Bolivia PALABRAS CLAVES: Trypanosoma cruzi, Antígenos recombinantes. Vol. VIII - Diciembre de 2000 RESUMEN En las últimas décadas, la enfermedad de Chagas ha sido reconocida como un serio problema de salud pública. Se estima que 16 a 18 millones de personas estan infectadas y aproximadamente 90 millones viven en zonas endémicas y estan en riesgo de contraer la infección, 12 millones son habitantes de 6 paises del Cono Sur de América Latina (WHO, 1994). A pesar de los grandes esfuerzos por controlar esta enfermedad, la misma continúa afectando a extensas áreas de América Latina debido a la gran extensión en la cual se distribuyen los vectores que transmiten al agente transmisor de esta enfermedad, llegando a ocupar el primer lugar en las enfermedades tropicales, según lo indica el Banco Mundial (1993). La detección de anticuerpos anti-t. cruzi, por los métodos serológicos, es aún un recurso principal en el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Los kits diagnostico comerciales estan basados en el uso de fracciones de extractos semipurificados de epimastigotes de T. cruzi, con una considerable variación en la reproductibilidad de los resultados.además estos han mostrado reacciones cruzadas frecuentes con otros protozoarios. La necesidad de encontrar antígenos mejor definidos en el serodiagnóstico de la enfermedad de Chagas es evidente. Estos últimos años la tecnología del DNA recombinante ha sido utilizada para aislar y caracterizar antigenos de T. cruzi los cuales son inmunodominantes en la infección humana. Sus mayores ventajas del uso de estos antígenos es su alta propiedad inmunológica, su fácil producción y costo bajo disminuido. En el presente trabajo hemos evaluado tres antígenos recombinantes de Trypanosoma cruzi (H49, A13 y SAPA), validando de esta manera su potencial diagnóstico frente a los métodos serológicos convencionales IFI y ELISA y sueros de pacientes nativos. Se estudiaron 555 muestras de suero de pacientes provenientes de la ciudad de Cochabamba. De estos sueros se selecionaron 60 para la evaluación de antígenos recombinantes. Se utilizaron las técnicas de IFI BIOFARBO - (51)
REVOLLO, OROCONDO, SOTO, GARCIA (Inmunoflurescencia Indirecta) y ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Los resultados mostraron un 7.2% (40/555) de seropositividad para T. cruzi en el total de pacientes estudiados. Las técnicas IFI y ELISA convencional manifestaron una concordancia del 100% para los 60 sueros seleccionados. Los tres antígenos recombinantes son 100% específicos para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas, no obstante, en cuanto a sensibilidad se observan diferentes resultados siendo el antígeno H49 el que ofrece el mejor resultado (100%), seguido por el antígeno SAPA (93.3%) y con la menor sensibilidad el antígeno A13 (70%). INTRODUCCION En las últimas décadas, la enfermedad de Chagas ha sido reconocida como un serio problema de salud pública. Se estima que 16 a 18 millones de personas estan infectadas y aproximadamente 90 millones viven en zonas endémicas y estan en riesgo de contraer la infección, 12 millones son habitantes de 6 paises del Cono Sur de América Latina (WHO, 1994). En nuestro país el área endémica abarca apoximadamente el 60% del territorio nacional involucrando 7 de los 9 departamentos donde vive el 45% a 65% de la población de la cual 3 millones estan en riesgo de contraer la infección debido a la gran proliferación de los vectores transmisores sobre todo en áreas rurales (Luna et al., 1995). El agente, Trypanosoma cruzi, es normalmente transmitido por insectos triatomineos infectados. El control de la transmisión vectorial ha sido exitosamente realizada en algunos paises del cono sur de Sudamérica (Dias & Schofield, 1998). Sin embargo, a pesar de estos esfuerzos la enfermedad de Chagas continúa afectando a extensas áreas de América Latina debido a la gran extensión en la cual se distribuyen los vectores que transmiten al agente transmisor de esta enfermedad, llegando a ocupar el cuarto lugar en órden de importancia después de las enfermedades respiratorias, las diarreas y la infección por virus de la inmunodeficiencia humana y el primer lugar en las enfermedades tropicales, según lo indica el Banco Mundial (1993). Actualmente la transmisión por transfusión sanguínea se ha convertido en la principal vía de adquirir la enfermedad (Schmunis, 1991; Wendel & Gonzaga, 1993). La prevalencia de individuos chagásicos en bancos de sangre es alrededor de 63% en Santa Cruz (Bolivia), 5.6% en Buenos Aires (Argentina), 5.1% en Caracas (Venezuela), 0.7% en Brasil y 5.3% en Paraguay (Dias & Schofield, 1998; Wendel & Gonzaga, 1993). El incremento de migración poblacional de áreas endémicas a paises en desarrollo es una de las posibilidades para que la transmisión por transfusión sanguínea de la enfermedad de Chagas pueda convertirse en un problema mundial (Schmunis, 1991). La prevalencia serológica en donadores de sangre en el Sudeste y Este de los Estados Unidos esta entre 0.1-1.1% (Geiseler &Tegfemeir, 1987; Grant et al., 1988; Nickerson et al. 1989; Hayes & Schofield, 1990; Shulman, 1991; Kerndt et al., 1991; Pan et al., 1992; Brashear et al., 1995; Galel & Kirchoff, 1996). El riesgo de infección con T. cruzi por transfusión de sangre se estima en 12-15% (Wendel 1995). La detección de anticuerpos anti-t. cruzi, por los métodos serológicos, es aún un recurso principal en el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Los kits diagnostico comerciales estan basados en el uso de fracciones de extractos semipurificados de epimastigotes de T. cruzi (forma no infectiva del parásito), con una considerable variación en la reproductibilidad de los resultados obtenidos con diferentes métodos (Camargo et al. 1986). Reacciones cruzadas con T. cruzi han sido observadas principalmente con pacientes con leishmaniasis (Chiller et al., 1990) o infección con Trypanosoma rangeli (Guhl et al., 1987). Además se ha observado en pacientes chagásicos resultados serológicos negativos por los métodos clásicos serológicos (Luquetti, 1987). Todos estos reportes indican la necesidad de encontrar antígenos mejor definidos en el serodiagnóstico de la enfermedad de Chagas (Moncayo & Luquetti, 1990). Estos últimos años la tecnología del DNA recombinante ha sido utilizada para aislar y caracterizar antigenos de T. cruzi los cuales son inmunodominantes en la infección humana (Ibanez et al., 1988; Lafaille et al., 1990; Affranchino et al., 1989; Hoft et al., 1989; Levin et al., 1989; Cotrim et al., 1990; Frasch et al., 1991; Franco da Silveira, 1992; Paranhos et al., 1990; Burns et al., 1992; Ouaissi et al., 1992; Gruber & Zingales, 1993; Godsel et al., 1995; Krautz et al., 1995; Pereira et al., 1998). Una de las mayores ventajas del uso de antígenos clonados y purificados de T.cruzi en lugar de extractos parasitarios en el serodiagnóstico del Chagas crónico es sus alta propiedad inmunológica, su fácil producción y costo bajo disminuido. La evaluación de algunos antígenos definidos muestran resultados prometedores en el diagnóstico de la enfermedad de Chagas (Zingales et al., 1990; Cotrim et al., 1990; Krieger et al., 1992; Carvalho et al., 1993; Levin et al., 1994; Lorca et al., 1992; Paranhos et al., 1994; Pastini et al., 1994; Peralta et al., 1994). El primer estudio coordinado para evaluar el potencial diagnóstico de los antígenos recombinantes fue realizado por la Organización Mundial de la Salud (Moncayo & Luquetti, 1990). Una evaluación de la eficiencia de antígenos recombinantes en el diagnóstico por ELISA para la enfermedad de Chagas es imprescindible realizar a corto plazo en todos los paises afectados. En el presente trabajo hemos evaluado tres antígenos recombinantes de Trypanosoma cruzi provenientes de Brasil y Argentina H49 y A13 (Franco da Silveira, 1992) y SAPA (Frasch et al., 1991). Validando de esta maneras su potencial diagnóstico frente a los métodos serológicos convencionales IFI y ELISA y sueros de pacientes nativos. MATERIAL Y METODOS Muestras Se estudiaron 555 muestras de suero de pacientes provenientes de la ciudad de Cochabamba. Determinada (52) - BIOFARBO Vol. VIII - Diciembre de 2000
EVALUACION DE ANTIGENOS RECOMBINANTES PARA EL DIAGNOSTICO DE CHAGAS la identificación de pacientes seropositivos para T. cruzi por las técnicas IFI (Inmunoflurescencia Indirecta) y ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), se selecionaron 60 pacientes para la evaluación de antígenos recombinantes : 30 seropositivos y 30 seronegativos. Por otra parte, se utilizaron 30 sueros seronegativos para T. cruzi provenientes de la seroteca de la Unidad de Biología Molecular del Instituto SELADIS con el fin de determinar la linea de corte necesaria en la técnica de ELISA para evaluar los diferentes antígenos utilizados en el estudio. Pruebas serológicas convencionales Inmunofluorecencia Indirecta (IFI) Epimastigotes de Trypanosoma cruzi de la cepa Y fueron utilizados para preparar las improntas con el antígeno total del parásito. Anti-inmunoglobulinas G humanas marcadas con isotiocianato de fluoresceina fueron utilizadas como conjugado (Antibodies Anti human Ig G (H+L) F.I.T.C. labeled, BIOSYS(r), France). El procedimiento fue realizado como lo describe Camargo et al., 1986. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Para la preparación del antígeno soluble se utilizaron epimastigotes de Trypanosoma cruzi de la cepa Y recientemente replicados en el ratón. El método utilizado para la obtención del antígeno fue el de extracción alcalina descrito por Lissaldo et al., 1994 y Umezawa et al., 1996. Se utilizarón placas de 96 pozos (NUNC(r), France) y Antiinmunoglobulinas G humanas marcadas con peroxidasa como conjugado (Antibodies Anti human Ig G (H+L) Peroxidase labeled, BIOSYS(r), France). El procedimiento de la técnica de ELISA fue realizado como lo describe Umezawa et al., 1996. Pruebas serológicas moleculares Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Los antígenos recombinantes H49 y A13 fueron preparados en la Escola de Medicina Tropical de Sao Paulo Brasil y enviados a La Paz gentilmente por el Dr. Franco Da Silveira. El antígeno recombinante H49 fue seleccionado como útil para el diagnóstico de pacientes que esten en fase crónica de la enfermedad de Chagas, mientras que el antígeno recombinante A13 seleccionado como útil para el diagnóstico de pacientes que estén en la fase aguda de la enfermedad. De igual manera el antígeno recombiante SAPA preparado en Campomar de Buenos Aires, Argentina, fue enviado por el Dr. Carlos Frasch como antígeno para evaluar a pacientes que esten en fase aguda de la enfermedad. Vol. VIII - Diciembre de 2000 BIOFARBO - (53)
REVOLLO, OROCONDO, SOTO, GARCIA Tabla 1: Linea de corte para los diferentes antígenos utilizados Antígeno crudo H49 A13 SAPA Linea de corte (DO) 0.95 0.607 0.503 0.092 Tabla 2: Sensibilidad y especifidad de los antígenos recombinantes H49, A13 y SAPA determinada en base a los resultados de IFI y ELISA convencionales. Sensibilidad Especifidad H49 100% 100% A13 70% 100% SAPA 93.3% 100% La concentración apropiada para cada uno de los antígenos recombinantes estudiados fue determinada después de probar tres concentraciones diferentes (50 ng/ ml, 100 ng/ml y 200 ng/ml). El análisis de los resultados fue realizado después de determinar la linea de corte para cada uno de los antígenos recombinantes con 30 sueros seronegativos para T. cruzi. El procedimiento de la técnica de ELISA utilizada para la evaluación de antígenos recombinantes fue la misma que para la técnica de ELISA convencional. RESULTADOS Los resultados mostraron un 7.2% (40/555) de seropositividad para T. cruzi en el total de pacientes estudiados. Las técnicas IFI y ELISA convencional manifestaron una concordancia del 100% para los 60 sueros seleccionados a ser analizados con los antígenos recombinantes. La linea de corte calculada después de determinar la media de la densidad óptica (DO) de 30 sueros seronegativos para T.cruzi más dos desviaciones standard (Tabla 1). Las concentraciones de antígenos apropiadas para los diferentes antígenos recombinantes H49, A13 y SAPA fueron 50 ng/ml, 50 ng/ml y 100 ng/ml respectivamente. Los resultados obtenidos para las 60 muestras seleccionadas fueron las siguientes: Utilizando el antígeno H49, de las 30 muestras positivas por IFI y ELISA convencionales, el 100% tambien fueron positivas. De las 30 muestras negativas, de la misma manera el 100% fueron negativas para este antígeno. Utilizando el antígeno A13, de las 30 muestras positivas por IFI y ELISA convencionales, solo el 70% fueron positivas. De las 30 muestras negativas, el 100% fueron negativas para este antígeno. Utilizando el antígeno SAPA, de las 30 muestras positivas por IFI y ELISA convencionales, el 93.3% fueron positivas. De las 30 muestras negativas, el 100% fueron negativas para este antígeno. De estos resultados se puede observar que los tres antígenos son 100% específicos, no obstante, en cuanto a sensibilidad se observan diferentes resultados siendo el antígeno H49 el que ofrece el mejor resultado, seguido por el antígeno SAPA y con la menor sensibilidad el antígeno A13 (Tabla 2). DISCUSION El diagnóstico de la enfermedad de Chagas realizado por métodos de alta sensiblidad como IFI y ELISA ofrece una alta sensibilidad en la detección del parásito en un organismo, sin embargo, este rendimiento y especificidad se ven afectados debido a que gran parte de los antígenos son mesclas de moléculas provenientes de cultivos de epimastigotes mantenidos en cultivo por largo tiempo hecho que vuelve a los parásitos avirulentos y con menor expresión antigénica cuyas consecuencias pueden llevar a resultados falsos negativos o reacciones cruzadas con otros protozoarios (Umezawa et al., 1996). Asimismo la preparación de un antígeno crudo requiere un trabajo arduo de alto riesgo y costo elevado, este hecho induce a buscar antígenos específicos, sensibles y de preparación menos riesgosa y costo reducido, como lo demuestran ser los antígenos recombinantes. Estudios realizados por Cotrim, 1990 indican que el antígeno H49 es un inmunógeno dominante de T. cruzi y que la presencia de anticuerpos para este antígeno está específicamente asociado a la enfermedad de Chagas, estos datos se complementan con los resultados obtenidos por Luna et al., 1995 que indica que el antígeno recombinante JL-7 (correspondiente al antígeno H49) podría ser utilizado en el serodiagnóstico de la infección crónica de la enfermedad de Chagas. Asimismo, nuestros resultados mostraron que efectivamente el antígeno recombinante H49 es en un 100% eficiente para el uso como antígeno de rutina para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Por otra parte, Affranchino et al., 1989 indicaron que el antígeno SAPA reaccionaba fuertemente con pacientes chagásicos en fase aguda. Estos resultados fueron confirmados en un estudio realizado en Chile (Lorca et (54) - BIOFARBO Vol. VIII - Diciembre de 2000
EVALUACION DE ANTIGENOS RECOMBINANTES PARA EL DIAGNOSTICO DE CHAGAS al., 1992) donde muestran que el antígeno SAPA puede incluso detectar etapas tempranas de la infección activa que sin presencia de manifestaciones clínicas, sin embargo, los mismos reportan que este antigeno también reacciona muy bien con sueros de pacientes en fase crónica, lo cual no manifiesta propiamente como un marcador serológico de fase aguda. Nuestros resultados concuerdan con los encontrados en Chile, pero además manifiestan una sensibilidad menor al 100% con los encontrados con el antígeno crudo (93.3%). Asimismo, Paranhos, 1990 indica que el antígeno recombinante A13 es específico para la enfermedad de Chagas ya que no presenta reacción cruzada con otras enfermedades, además observó que un 90% de pacientes chagásicos agudos reaccionan con este antígeno pudiendo ser utilizado en el serodiagnóstico no solo en pacientes en fase aguda sino tambien en pacientes en fase crónica y con chagas congénito. Ante estos resultados, los nuestras quedan discordantes puesto que nuestra sensibilidad encontrada para este antigeno fue muy baja (70%) lo cual no nos permite recomendar el mismo para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Nuestros resultados nos permiten concluir que los antígenos recombinantes H49, A13 y SAPA son todos reactivos con sueros de pacientes chagásicos en diferentes fases de la infección, sin embargo, el antígeno H49 es el más eficiente a diferencia de los otros dos antígenos recombinantes debido a que no ha determinado resultados falsos negativos en el diagnóstico. El antígeno recombinante A13 por el contrario, no tiene buena eficiencia puesto que manifiesta un porcentaje elevado de resultados falsos negativos. La eficiencia del antígeno SAPA es elevada, pero aún así estamos en el riesgo de encontrar resultados falsos negativos. RECONOCIMIENTOS Este trabajo de investigación fue financiado por el proyecto DEVELOPMENT OF AN IMPROVED SEROLOGICAL KIT FOR CHAGAS DIAGNOSIS USING RADIONUCLIDE METHODS, RCM 324-E15017, INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY. BIBLIOGRAFIA - Affranchino, J.L., Ibanez, C.F., Luquetti, A.O., Rassi, A., Reyes, M.B. Macina, R.A., Aslund, L., Petterson, U., and Frasch, A.C.C. 1989. Identification of Trypanosoma cruzi antigen that is shed during the acute phase of Chagas disease. Mol. Biochem. Parasitol. 34:221-228. - Banco Mundial, 1993. Informe sobre el desarrollo mundial: invertir en salud, Washington, D.C. - Bastos, S. 1998. Master of Sciences Thesis. Universidade de Sao Paulo, Instituto de Ciencias Biomédicas, USP, Sao Paulo, Brasil. - Brashear, R.J., Winkler, M.A., Schur, J.D., et al. 1995 Detection of antibodies to Trypanosoma cruzi among blood donors in the southwestem United States.I. 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