PRÁCTICA 1. RECONOCIMIENTO DE BIOMOLÉCULAS En esta práctica se realizarán reacciones químicas y pruebas características para identificar la presencia de una o varias biomoléculas en una mezcla y para cuantificar alguna de ellas. Finalmente, se estudiarán algunas actividades enzimáticas. 1.- Identificación de glúcidos con poder reductor Todos los monosacáridos y los disacáridos con enlace monocarbonilo, cuando se encuentran en solución a ph alcalino, tienen la capacidad de reducir otros compuestos. Esta capacidad reside en las características del grupo carbonilo (C anomérico en formas cicladas) libre. Esta propiedad, y por tanto, la presencia de un azúcar reductor, se ponen de manifiesto mediante la reacción de FEHLING. El reactivo de Fehling consta de: -Fehling A: CuSO 4 disuelto en H 2 O -Fehling B: NaOH y tartrato Na-K disueltos en agua Fundamento de la reacción: En medio alcalino, el cobre procedente del CuSO 4 se encuentra en forma de hidróxido cúprico, y se forma la correspondiente sal Na 2 SO 4. Cuando el Cu(OH) 2 (de color azul) se calienta en presencia de un compuesto reductor se forma óxido cuproso (de color rojo ladrillo). CuSO 4 NaOH +Calor +R Cu(OH) 2 (azul) Cu2O (rojo ladrillo) Si hay un compuesto reductor, el Cu cambia su estado de oxidación de (2+ a 1+), lo que se evidencia por el cambio de color.
Práctica Sobre la mesa hay dos soluciones de glúcidos: GLÚCIDO I y GLÚCIDO II. Hay que determinar si son reductores. Método: 1. Poner en un tubo de ensayo 2 ml de glúcido I y en otro tubo 2mL de glúcido II. 2. Añadir a cada tubo 0.5 ml de Fehling A y 0.5 ml de Fehling B. 3. Calentar a la llama. 1. Cuál o cuáles son los azúcares reductores? 2. Quién se oxida y quién se reduce en la reacción? 3. Para qué sirven el tartrato Na-K y el calor? 4. Qué resultado daría la reacción de Fehling con glucosa? Y con sacarosa? 2.- Identificación de polisacáridos: identificación de almidón mediante la prueba del Lugol En solución acuosa, la amilosa forma estructuras helicoidales lineales y la amilopectina ramificadas, gracias a la formación de puentes de H entre los grupos OH de la glucosa y las moléculas de H 2 O. Si a una disolución de almidón de le añade I, esta toma un color azul intenso. Esta característica es específica del almidón, debido a su estructura, y se debe a la adsorción del I por las cadenas helicoidales, especialmente de la amilosa. Por tanto no es una reacción química, sino una interacción física reversible por métodos físicos. Esto se puede comprobar fácilmente, pues al calentar la mezcla, el color azul desaparece, y al enfriarla vuelve a aparecer. Práctica Sobre la mesa hay dos soluciones, solución 1 y solución 2. Hay que identificar cuál de ellas tiene almidón. Método: 1. Poner en un tubo de ensayo 2 ml de la solución 1 y en otro 2 ml de la solución 2.
2. Añadir a cada uno de los tubos de ensayo 1 gota de Lugol (solución acuosa de iodo y ioduro potásico). Observar el resultado. Para comprobar que es una interacción física 1. Calentar a la llama el tubo que contiene almidón (teñido de azul con I), hasta que desaparezca el color azul. 2. Enfriar en el grifo y observar la aparición de nuevo de color azul. 1. Cuál de los dos soluciones contiene almidón? 2. El almidón daría positiva la reacción de Fehling? 3. La celulosa daría positiva la prueba del Lugol? 4. El azul que aparece tras calentar y enfriar es igual de intenso? Por qué? 3.- Identificación de lípidos. Reacción de saponificación. La presencia de un lípido se puede detectar fácilmente por su insolubilidad en agua. Además, se puede detectar si un lípido es saponificable, mediante la reacción de saponificación, o formación de jabón. Los ésteres de ácidos grasos sufren hidrólisis en presencia de un agente alcalino. Esta hidrólisis conduce a la liberación del alcohol y a la formación de sales de ácido graso o jabones: CH 2 O CO R 1 CH 2 OH R COO-Na 1 CH O CO R 2 + 3NaOH CHOH + R COO-Na 2 CH 2 O CO R 3 Triglicérido CH 2 OH Glicerina R COO-Na 3 Sales sódicas de ac. grasos (JABÓN) Práctica Sobre la mesa hay un frasco con aceite y un álcali (NaOH). Se trata de saber si en el aceite existen lípidos saponificables. Método
1. Añadir aceite (sin pipetearlo) a un tubo de ensayo, hasta una altura de aproximadamente 1 cm. 2. Añadir 2 ml de NaOH al 20% (p/v) en agua. 3. Agitar enérgicamente. 4. Calentar al baño María y observar qué ocurre? 1. Existen lípidos saponificables en el frasco de aceite? 2. A qué corresponde cada fase de las que aparecen en el tubo? 3. Por qué se da esa disposición de fases? 4. Cómo se prepara la NaOH al 20% en agua? 4.- Identificación de proteínas mediante la reacción el Biuret La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO 4 en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu 2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. O C C O HN NH R CH O C HN Cu 2+ HC R C O NH R CH HC R La reacción debe su nombre al biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H 2 N-CO-NH-CO-NH 2 ), que es la más sencilla que da positiva esta reacción, común a
todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas. Espectrofotometría. Principios básicos A diferencia de las pruebas realizadas anteriormente, la reacción de Biuret es cuantificable, es decir, a mayor concentración de proteínas, mayor intensidad de color violeta. Esta reacciones, en las que el color formado es proporcional a la cantidad de sustancia se llaman reacciones colorimétricas. Midiendo la intensidad de color se podría conocer la concentración de la sustancia que lo produce. Para ello se aplican técnicas fotométricas, empleando un aparato llamado colorímetro (si mide sólo un determinado color) o espectrofotómetro (si realiza una medida de todo el espectro de colores). La luz es parte de la radiación electromagnética, que se propaga de forma ondulatoria. Las distintas radiaciones luminosas (los distintos colores) se diferencian unas de otras por sus longitudes de onda ( (distancia entre la cresta de una onda y la siguiente), que se mide en nm. La luz visible engloba las radiaciones comprendidas entre 380-750 nm, que corresponden a los colores del arco-iris, de tal forma que cada color corresponde a una radiación con una específica. El espectrofotómetro dispone de una lámpara que emite luz monocromática, de una longitud de onda determinada, que incide y atraviesa la muestra coloreada a medir, y de un detector, que medirá la cantidad de luz que no es absorbida por la muestra. Para cada sustancia determinada, se utilizará la radiación de longitud de onda a la que absorba más cantidad de luz. Su funcionamiento de basa en la ley de Beer-Lambert: la fracción de luz incidente que es absorbida por una solución es proporcional a la concentración de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relación entre la luz incidente (I 0 ) y la reflejada (I) dará una idea de la cantidad de radiación que ha sido absorbida por la muestra. Es lo que se denomina Absorbancia (Abs) o Densidad Óptica (DO)
La Ley de Beer-Lambert se formula como Abs (DO) = x C x l Siendo el coeficiente de extinción molar (específico para cada sustancia a una y en unas condiciones determinadas) (M -1 cm -1 ), C la concentración de la muestra a medir (M), y l el espesor de la muestra. La mayoría de los espectrofotómetros utilizan cubetas para la muestra de 1 cm de espesor, por lo que l se puede ignorar. Así, la concentración desconocida de la sustancia coloreada será C = Abs / Práctica Sobre la mesa hay una solución de proteínas. Se trata de determinar la concentración de dicha solución mediante la reacción del Biuret y el espectrofotómetro. Método 1. Realización de una recta patrón. Puesto que se desconoce el coeficiente de extinción molar ( ) de las proteínas coloreadas con el reactivo del Biuret, se procederá a construir una curva (en este caso recta) patrón, midiendo la Abs de soluciones con concentraciones
conocidas de proteína, para, sobre ella interpolar el valor de Abs de la solución problema y determinar su concentración. Para ello, se dispone de una solución de 10 mg.ml -1 de ovoalbúmina. A partir de ella se realizarán diluciones conocidas aplicando la fórmula Ci xvi = Cf x Vf Ci = concentración de la solución madre inicial Vi = volumen a tomar de la solución madre inicial Cf = concentración final de la solución a preparar Vf = volumen total final de la solución a preparar En 4 tubos de ensayo se preparan, a partir de la solución madre (Ci = 10 mg/ml -1 ) las soluciones de la tabla Tubo Cf Vi Agua Vf Blanco 0 mg/ml -1 0 ml 1 ml 1mL 1 2 mg/ml -1 0,2 ml 0,8 ml 1mL 2 5 mg/ml -1 0,5 ml 0,5 ml 1mL 3 10 mg/ml -1 1 ml 0 ml 1mL Además se prepara un tubo con 1 ml de la solución problema cuya concentración se quiere conocer Problema X 1 ml (sol. problema) 0 ml 1 ml 2. Añadir a cada tubo 2 ml de reactivo del Biuret, agitar y dejar reposar 20 min. 3. Transcurrido este tiempo, se mide la DO u Abs en el espectrofotómetro, de la siguiente manera a) Seleccionar la longitud de onda de 570 nm (máxima Abs para la reacción del Biuret) b) Poner en la cubeta del espectrofotómetro el contenido del tubo Blanco, secarla y limpiarla bien por fuera e introducirla en el espectrofotómetro c) Se ajusta la lectura a 0 de Abs
d) Se devuelve el contenido al tubo original y se mide la Abs de las soluciones de los otros tubos, comenzando por el de menor concentración. e) Limpiar con agua la cubeta, secarla por fuera y medir la Abs del tubo Problema 4. Con las medidas obtenidas de los tubos 1 a 3 y el blanco (Abs = 0), se construye una recta en papel milimetrado, representando las concentraciones en el eje de abcisas y las Abs en el de ordenadas. 5. Interpolar la Abs de la proteína problema en la gráfica y calcular su concentración. 1. Cuál es la concentración de proteínas de la muestra problema? 2. Se podría determinar la concentración de cualquier muestra de proteínas con esta recta patrón? 3. Los aminoácidos y los dipéptidos darían positiva la reacción del Biuret? 4. Serviría esta reacción para determinar proteínas en orina?
4.- Actividades enzimáticas: especificidad y desnaturalización por cambios de ph y temperatura Práctica 4.1. Especificidad de la invertasa La invertasa o sacarasa hidroliza el enlace entre los C 1-2 de la sacarosa, liberando glucosa y fructosa libres. La enzima sólo rompe este tipo de enlace glucosídico y no otros. Método 1. Preparar 3 tubos de ensayo con los siguientes reactivos: TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 1mL solución de sacarosa 1mL solución de sacarosa 1mL solución de almidón 1mL solución de invertasa 1mL H 2 O 1mL solución de invertasa 2. Agitar los tubos y dejarlos reposar 15 min para que transcurra la reacción enzimática. 3. Realizar la reacción de Fehling a cada tubo. 1. En qué tubo/s da positiva la reacción de Fehling? En cuál/es negativa? Por qué? 2. Qué demuestran el tubo 2 y el tubo 3 respectivamente? Práctica 4.2. Desnaturalización a ph ácido de la amilasa Las enzimas tienen un ph óptimo de actuación. Cambios de ph desnaturalizan la proteína y, por tanto, inhiben la actividad enzimática. La amilasa es una de las enzimas encargadas de la digestión del almidón, concretamente hidroliza enlaces 1-4 entre
moléculas de -glucosa. Es una enzima que se encuentra a lo largo de todo el tracto digestivo de los mamíferos, y que también la producen las glándulas salivares. Método 1. Preparar 2 tubos de ensayo con los siguientes reactivos: TUBO 1 TUBO 2 Amilasa (escupir un poco de Amilasa (escupir un poco de saliva) saliva) 2 gotas de H 2 O 2 gotas de HCL 1N 2. Agitar los tubos y esperar 5 min. 3. Añadir 1 ml de solución de almidón a cada tubo. 4. Agitar los tubos y dejarlos reposar 10 min para que transcurra la reacción enzimática. 5. Realizar la prueba del Lugol a cada tubo. 1. En qué tubo/s da positiva la prueba del lugol? En cuál/es negativa? Por qué? Práctica 4.3. Desnaturalización de la catalasa por calor Las enzimas tienen una temperatura óptima de actuación. La catalasa se encuentra en todos los tejidos vivos, donde descompone el H 2 O 2 en H 2 O y O 2, que al ser gas, en solución acuosa se desprende en forma de burbujas. Por tanto, al añadir agua oxigenada a un tejido vivo, la detección de desprendimiento de oxígeno gas, indicará actividad catalasa. En la mesa hay dos platos con trozos de patata. En uno de ellos, la patata ha sido previamente cocida. Método 1. Introducir en sendos tubos de ensayo un trozo de patata de cada plato. 2. Añadir 1 ml de H 2 0 2.
1. Cuál es el plato que contiene la patata cocida? 2. Qué indica la falta de desprendimiento de O 2 al añadir H 2 0 2 a dicha patata?