INTRODUCCIÓN PRACTICA 5 AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS En bioquímica es muy común aislar y purificar proteínas para estudiar su composición, su estructura y de ser posible su función, como es e caso de las enzimas. Para dicha purificación se emplean métodos basados en sus propiedades de solubilidad. Cada proteína tiene una composición de aminoácidos específica qu las hace diferentes unas de otras y, por lo tanto, su comportamiento en disoluciones también es diferente. Por lo general las proteínas fibrosas son solubles en agua y resistentes a la degradación enzimática, sin embargo, con soluciones de cierta fuerza iónica se pueden solubilizar. Las proteínas globulares son relativamente mas solubles en agua y en soluciones de baja fuerza iónica, aunque algunas coagulan cuando se calientan. La composición de aminoácidos, es también responsable del comportamiento de las proteínas en diferentes condiciones de ph. Así al acidificar o alcalinizar una determinada proteína, ésta puede llegar a su punto isoeléctrico, es decir, alcanzar una carga neta de cero y por lo tanto precipitar. La leche es un producto rico en proteínas, tales como las caseínas y globulinas, además de contener carbohidratos y ácidos grasos. De la leche se puede separar la caseína por precipitación en su punto isoeléctrico (ph 4.6). El huevo también es un producto con una buena cantidad de nutrientes, tal como la ovoalbúmina, la cual se clasifica como fosfoglucoproteína por tener hidratos de carbono y fósforo. La precipitación de esta proteína con una solución saturada de (NH4)2SO4 permite aislarla del resto de las proteínas que se encuentran en la clara del huevo. Existen factores que afectan el estado nativo de las proteínas, sin embargo, éstas pueden someterse a una purificación parcial empleando técnicas bioquímicas sencillas como la centrifugación, diálisis y cromatografía. OBJETIVO GENERAL Poner en practica los métodos bioquímicos para la purificación parcial de proteínas, basados en sus propiedades de solubilidad. OBJETIVO PARTÍCULAR Aislar caseina de la leche a partir de su punto isoeléctrico Aislar la albumina de la clara de huevo por precipitación con sulfato de amonio. Familiarizar al alumno con el uso de la centrífuga.
MATERIALES Y METODO MATERIALES MATERIALES 1 Probeta de 100 ml Gasa 1 Probeta de 50 ml 2 Vasos de Precipitados de 250 ml REACTIVOS 1 Vaso de Precipitados de 100 ml HCl 2 Pipetas Graduadas de 5 ml NaCl 4 Tubos de Centrifuga de 50 ml (NH4)2SO4 1 Agitador de Vidrio Acido Acético Glacial 1 Matraz Kitazato Acetato de Sodio 1 Parrilla Electrica Etanol 1 Piceta Acetona 1 Potenciómetro Éter Etílico 1 Centrífuga clínica ALUMNOS 4 Viales de Vidrio 120 ml de Leche Cruda de establo (no Industrializada) 2 Pipetas Pasteur 1 Huevo Fresco 1 Embudo Buchner 1 Embudo de Vidrio 1 Palangana Soluciones Solución de HCl al 20% (v/v) Solución de ácido acético 1.0M Solución amortiguada de (NH4)2SO4 Preparación: Agregar 780 g de (NH4)2SO4 a un litro de agua y calentar por agitación. Adicionar 12.3 g de acetato de sodio. Enfriar y añadir 9 ml de ácido acético glacial. Dejar que sedimenten los cristales, use solo el sobrenadante. METODO A. Obtención de la Caseina 1. El día anterior a la práctica, dejar enfriando la leche para que se separe la parte lipidica. 2. Al iniciar la práctica, eliminar los lípidos que se encuentran en la superficie con una pipeta Pasteur 3. Después de haber eliminado los lípidos, tomar 3 ml de la leche y guardar en el refrigerador en un vial previamente etiquetado. 4. Colocar 100 ml de la leche descremada en un vaso de precipitados de 250mL junto con el agitador magnético y agitar suavemente sobre la parilla. 5. Calibrar el potenciómetro con las soluciones patrón de ph7 y ph4 6. Introducir el electrodo en el vaso con leche, cuidando no golpearlo con el agitador magnético. 7. Adicionar lentamente, con una pipeta Pasteur, la solución de HCl al 20% hasta ajustar el ph a 4.6. 8. En el punto isoeléctrico se formará un precipitado voluminoso. En ese momento se detiene la agitación y se deja reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
9. Mezclar la suspensión por unos cuantos minutos y distribuirla en tubos de centrífuga, procurando recuperar todo el precipitado. 10. Equilibrar los tubos por parejas y centrifugar a 2000 rpm durante diez minutos. 11. Verter el sobrenadante en una probeta y anotar el volumen total. Tomar 3 ml de éste y guardarlo en un vial previamente etiquetado. El resto se desecha. 12. el precipitado de todos los tubos se coloca en un vaso. Agregar 20 ml de agua y agitar sobre una parrilla con un agitador magnético, hasta obtener una suspensión homogénea. Este lavado es para eliminar el HCl. 13. Colocar la suspensión en un solo tubo de centrífuga efectuar el proceso de centrifugación a 2000 rpm durante diez minutos. Desechar el sobrenadante y repetir los lavados con agua dos veces más. 14. Al eliminar el agua del último lavado adicionar 10 ml de etanol al precipitado y homogeneizar con un agitador de vidrio. Volver a centrifugar para eliminar el etanol. 15. Finalmente, lavar con acetona y éter etílico de la misma forma que se hizo con el alcohol. 16. Recuperar el precipitado y colocarlo en papel aluminio, en forma extedida, para que se seque y forme un polvo. B. Obtención de Albúmina. 1 Colocar la clara de huevo en una probeta y medir su volumen, evitando que se rompa la yema 2 Verter la clara en un vaso de precipitados, agregar la décima parte de su volumen de ácido acético 1.0 M y agitar. 3 Filtrar la albúmina acidificada a través de cuatro capas de gasa, agitando fuertemente con una varilla de vidrio para acelerar el proceso. 4 Al filtrado añadir un volumen igual de la solución de sulfato de amonio amortiguado, y agitar. Dejar reposar la solución durante 15 minutos en un baño de hielo. 5 Separar el precipitado que contiene ovoalbúmina y ovomucina centrifugando a 3000 rpm durante diez minutos. 6 Al sobrenadante que contiene la albúmina, añadir pequeñas cantidades de la disolución de sulfato de amonio: se notará una ligera turbidez que desaparecerá al agitar. Siga vertiendo sulfato de amonio y agite hasta que la turbidez ya no desaparezca, agregar un poco más para permitir que la albúmina precipite. 7 Dejar la mezcla a temperatura ambiente durante aproximadamente dos horas 8 Eliminar el sobrenadante por centrifugación. 9 Suspender la albúmina en 5 ml de acetona y recuperar filtrando en un embudo Buchner. 10 Colocar el residuo en un papel aluminio y dejar que seque completamente al aire. Guardar en un vial etiquetado. Las soluciones utilizadas en esta práctica pueden eliminarse en la tarja, manteniendo la llave del agua abierta para diluir y al terminar lavar la tarja.
RESULTADOS 1 Cuántos gramos de caseína obtuvo? 2 Qué porcentaje representa del volumen inicial? 3 Cuántos gramos de albúmina obtuvo? 4 Qué porcentaje representa del volumen de la clara? ANALISIS DE RESULTADOS Entregar al profesor los resultados obtenidos para su recopilación grupal. El análisis de los resultados aplicara para todos los equipos. Después de alcanzar los resultados individuales; compare el CV obtenido entre los equipos. 1. Qué volumen de leche utilizó para la extracción de caseína? 2. El precipitado de caseína apareció exactamente a `H 4.6 o requirió acidificar más? Explique. 3. Para que tuvo que lavar la caseína con agua? 4. Los lavados con los solventes orgánicos eran necesarios? Por qué? 5. Según la literatura, Cuántos gramos debía obtener? Fue bueno el rendimiento? 6. Cuál fue el volumen total de la clara de huevo? 7. Cuál es la razón de agregar ácido acético y filtrar a través de gasas? 8. Aproximadamente a que concentración de sulfato de amonio precipita la ovomucina y la ovoglobulina, de acuerdo el volumen de sulfato de amonio que adicionó? y Cuál es la concentración de sulfato de amonio a la que precipita la albúmina? 9. De acuerdo con lo reportado en la literatura. Cuánta albúmina tiene el huevo?. Compárelo con su resultado. CUESTIONARIO 1. Qué tipo de proteínas son al caseína y la albúmina estructural y funcionalmente? 2. Qué métodos se conocen para aislar y purificar proteínas? 3. Qué es el punto isoeléctrico de una proteína? 4. Por qué las proteínas precipitan con altas concentraciones de sales? 5. Qué efecto tienen los solventes orgánicos sobre las proteínas? 6. En que se basa la centrifugación para separar partículas de diferente tamaño? 7. Cuántos tipos de centrífugas se conocen? 8. Todos los métodos de extracción de proteínas las desnaturalizan? 9. Es posible saber si una proteína está pura? Cómo? 10. Será costeable purificar proteínas industrialmente?
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