INSTRUCCIONES DE USO MEDIOS EN PLACA LISTOS PARA USAR PA-254035.05 Rev.: Sep 2011 USO PREVISTO (agar chocolate Mueller Hilton) se utiliza para el aislamiento y cultivo de bacterias exigentes a partir de muestras clínicas. También se puede utilizar para las pruebas de sensibilidad de Neisseria gonorrhoeae. PRINCIPIOS Y EXPLICACION DEL PROCEDIMIENTO Método microbiológico. Dado que los laboratorios de microbiología clínica utilizaban a principios de los años 60 una amplia variedad de procedimientos para determinar la sensibilidad de bacterias a antibióticos y otros agentes quimioterapéuticos, Bauer, Kirby y otros desarrollaron un procedimiento estandarizado en el que se seleccionó como medio de prueba el agar Mueller Hinton, un medio originalmente diseñado para el aislamiento de gonococos 1-4. Un estudio colectivo internacional posterior confirmó el valor del agar Mueller Hinton Agar para este propósito por la reproducibilidad relativamente buena del medio, la sencillez de su fórmula y la riqueza de los datos experimentales que habían sido acumulados utilizando este medio 5. Según CLSI, el medio recomendado para la prueba de sensibilidad de difusión en disco de Streptococcus pneumoniae es el agar Mueller Hinton con 5% de sangre de carnero. El medio recomendado para Haemophilus influenzae es el agar de medio de prueba Haemophilus (HTM). Los criterios de interpretación se proporcionan en CLSI Document M100 (M2), que se incluye con CLSI Document M2, Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests, 7th ed.; Approved Standard 6. El medio recomendado para Neisseria gonorrhoeae es agar GC con un suplemento de crecimiento definido. Según otros datos, el agar Mueller Hinton con hemina e Iso-VitaleX puede utilizarse para las pruebas de sensibilidad sistemática de N. gonorrhoeae ante penicilina y estroptomicina. 7 El agar Mueller Hinton Agar, cuando se suplementa con sangre calentada o hemoglobina y factores de crecimiento (por ejemplo, BD IsoVitaleX) se ha recomendado como medio no selectivo para el aislamiento de Neisseria y Haemophilus 8. En, el extracto de carne bovina y peptona de caseína proporcionan los nutrientes. El almidón absorbe los compuestos tóxicos tales como los ácidos grasos procedentes de las torundas de algodón. La hemoglobina proporciona el factor X. BD IsoVitaleX suministra vitaminas y factores de crecimiento, incluido el factor V (NAD) que es necesario para el crecimiento de Haemophilus influenzae. REACTIVOS Fórmula* por litro de agua purificada Extracto de carne bovina 2,0 g Hidrolizado ácido de caseína 17,5 Almidón 1,5 Hemoglobina 10,0 IsoVitaleX 10,0 ml Agar 17,0 g ph 7,3 ± 0,2 * Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento. PA-254035.05-1 -
BD IsoVitalex Enrichment contiene los siguientes factores de crecimiento (fórmula* por litro de agua purificada): Vitamina B 12 0,01 g L-glutamina 10,0 Adenina 1,0 Clorhidrato de guanina 0,03 Ácido p-aminobenzoico 0,013 Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) 0,25 Pirofosfato de tiamina 0,1 Nitrato férrico 0,02 Clorhidrato de tiamina 0,003 Hidrocloruro de cisteína 25,9 L-cistina 1,1 Glucosa 100,0 * Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento. PRECAUCIONES. Solamente para uso profesional. No utilizar las placas si muestran evidencia de contaminación microbiana, decoloración, deshidratación, agrietamiento o cualquier otro signo de deterioro. La reducción excesiva de este medio debido a la deshidratación puede causar resultados de sensibilidad falsos. Consultar los procedimientos de manipulación aséptica, riesgos biólogicos y desecho del producto usado en el documento INSTRUCCIONES GENERALES DE USO. ALMACENAMIENTO Y VIDA UTIL Al recibir las placas, almacenarlas en un lugar oscuro a una temperatura entre 2 y 8 C, envueltas en su envase original, hasta justo antes de usarlas. Evitar la congelación y el calentamiento excesivo. Las placas pueden inocularse hasta su fecha de caducidad (ver la etiqueta en el paquete) e incubarse durante los períodos de incubación recomendados. Las placas de grupos de 10 placas ya abiertos pueden usarse durante una semana siempre que se almacenen en un lugar limpio a una temperatura entre 2 y 8 C. CONTROL DE CALIDAD DEL USUARIO Inocular muestras representativas con las cepas siguientes (para obtener los detalles, véase el documento INSTRUCCIONES GENERALES DE USO). Incubar las placas a una temperatura de 35 ± 2 C en una atmósfera aerobia con dióxido de carbono. Efectuar lectura de las placas después de 18 24 h y 42 48 h de incubación. Cepas Resultados del crecimiento Haemophilus influenzae ATCC 10211 Crecimiento de bueno a excelente Neisseria gonorrhoeae ATCC 43069 Crecimiento de aceptable a excelente Neisseria meningitidis ATCC 13090 Crecimiento de bueno a excelente Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 Sin inocular Crecimiento de bueno a excelente Marrón chocolate, opaco, posiblemente poco homogéneo Para inoculación e incubación de pruebas de sensibilidad, véase Procedimiento de análisis. Cepa de prueba Disco de prueba de sensibilidad Tamaño de zona* (mm) Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 Penicilina P-10 33 40 Estreptomicina SPT-100 25 31 * Tamaños de zona basados en resultados de al menos 3 lotes diferentes de BD Mueller Hinton Chocolate Agar PROCEDIMIENTO Materiales suministrados (placas Stacker de 90 mm). Controladas microbiológicamente. PA-254035.05-2 -
Materiales no suministrados Medios de cultivo auxiliar, reactivos y equipo de laboratorio que se requiera. Tipos de muestras se puede utilizar para todo tipo de muestras clínicas potencialmente infectadas con organismos exigentes, en especial (pero no exclusivamente) las muestras de zonas corporales esencialmente estériles (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, abscesos) y como medio de subcultivo de hemocultivos. Se utiliza principalmente para el aislamiento no selectivo de Neisseria, Haemophilus y otras bacterias que pueden no crecer en los medios de agar sangre utilizados normalmente, tal como el agar Columbia con sangre de carnero al 5%. (Véase también CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO Y LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO). El uso de este medio para pruebas de sensibilidad sistemáticas de Neissseria gonorrhoeae con penicilina G y estreptomicina requiere el uso de cultivos puros. No inocular la muestra para realizar pruebas de sensibilidad directas! Recogida y transporte de las muestras Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis, Haemophilus y otros organismos exigentes son sensibles a las condiciones ambientales adversas. Por consiguiente, se deben utilizar medios de transporte adecuados para todas las muestras. Las muestras deben ser enviadas al laboratorio tan pronto como sea posible y no deben transcurrir más de 24 horas, incluso si se utilizan medios de transporte. La temperatura de transporte óptima es de 20 25 C. No refrigerar! 9,10 Procedimiento de análisis Para el aislamiento de organismos exigentes, extender las muestras tan pronto como se reciban en el laboratorio. La placa de extensión se utiliza principalmente para aislar cultivos puros de las muestras que contienen flora mixta. Si, por el contrario, el material se cultiva directamente empleando una torunda, hacerla girar en una sección pequeña cercana al borde, extendiendo luego para hacer el aislamiento a partir de esta área inoculada. Si la muestra se ha obtenido de una zona corporal con flora normal, también debe inocularse en los medios selectivos adecuados, según el agente patógeno que se desee aislar. Para Neisseria gonorrhoeae, se debe incluir una placa BD Martin-Lewis Agar, modified o BD GC- Lect Agar y, para Haemophilus, una placa BD Chocolate Agar with IsoVitaleX and Bacitracin. Incubar las placas a una temperatura de 35 ± 2 C en una atmósfera aerobia con dióxido de carbono. Efectuar lectura de las placas después de 18 24 h y 42 48 h de incubación. Para pruebas de sensibilidad sistemáticas de N. gonorrhoeae, el aislado, que debe ser un cultivo puro, se suspende en BD Trypticase Soy Broth para lograr el equivalente del patrón de turbidez 0,5 de McFarland. En un plazo de 15 min después de ajustar la turbidez del inóculo, sumergir una torunda estéril en el inóculo diluido correctamente y hacerla rodar con firmeza varias veces contra la pared interna superior del tubo para exprimir el exceso de líquido. Inocular toda la superficie del agar de la placa tres veces, girando la placa 60 grados cada vez para obtener una inoculación uniforme. Aplicar los discos mediante un dispensador de discos antimicrobianos, empleando precauciones asépticas. Depositar los discos de modo que los centros queden a no menos de 24 mm de distancia. Es preferible depositar los discos de penicilina de manera que no queden a menos de 10 mm del borde de la placa de Petri. Una vez colocados los discos sobre el agar, presionarlos con una aguja o pinza estéril hasta obtener un contacto completo con el medio. Este paso no es necesario si los discos se colocan con el dispensador de autoapisonamiento de 6 u 8 posiciones BD Sensi-Disc. 15 minutos o menos después de aplicar los discos, invertir las placas e incubarlas en una atmósfera aerobia enriquecida con dióxido de carbono al 5% a 35 37 C durante 20 24 horas. PA-254035.05-3 -
Resultados Morfología típica de colonias en : Haemophilus influenzae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae Pequeñas, húmedas, nacaradas con un olor de "ratón" característico Pequeñas, de color blanco grisáceo a incoloro, mucoides Medianas a grandes, gris azulado, mucoides Colonias pequeñas, planas o más grandes, mucoides verdosas, las colonias circundantes pueden ser verdosas Pruebas de sensibilidad: Se debe efectuar la lectura de las zonas desde la parte superior de la placa. La sensibilidad a la penicilina debe confirmarse con una prueba de beta-lactamasa, por ej., la prueba BD Cefinase. CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO Y LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO es un medio no selectivo enriquecido en el que crecen bacterias exigentes y no exigentes, incluida la flora normal. Por consiguiente, se recomienda inocular las muestras también en medios selectivos adecuados. El término bacterias exigentes se refiere a las bacterias que no crecen o no crecen bien en los medios de aislamiento primario utilizados normalmente con sangre de carnero: por ej., Haemophilus, Neisseria patógena y muchos otros organismos. Consultar las referencias para obtener las descripciones detalladas acerca del tipo de muestras que deben inocularse en este medio y el tipo de organismos para los que se utiliza este medio para aislamiento 10,11. No se ha probado si este medio favorece el crecimiento de estreptococos con variaciones en la nutrición. Son muy elevados el número y los tipos de especies bacterianas que se comportan como agentes infecciosos. Por consiguiente, antes de utilizar sistemáticamente este medio para microorganismos aislados con poca frecuencia o descubiertos recientemente, primero debe probarse su idoneidad para lograr cultivos puros del organismo en cuestión. Los tamaños de zona de sensibilidad encontrados en este medio no presentan una plena concordancia con las mencionadas en CLSI Standard M2 6 reseñadas con el uso de agar chocolate GC con un suplemento de crecimiento definido. REFERENCIAS 1. Bauer, A.W., W.M.M. Kirby, J.C. Sherris, and M. Turck. 1966. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45: 493-496. 2. Ryan, K.J., F.D. Schoenknecht, and W.M.M. Kirby. 1970. Disc sensitivity testing. Hospital Practice 5:91-100. 3. Mueller, J.H., and J. Hinton. 1941. A protein-free medium for primary isolation of the gonococcus and meningococcus. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 48: 330-333. 4. Barry, A.L., F. Garcia, and L.D. Thrupp. 1970. An improved single-disk method for testing the antibiotic susceptibility of rapidly-growing pathogens. Am. J. Clin. Pathol. 53: 149-158. 5. Ericsson, H.M., and J.C. Sherris. 1971. Antibiotic sensitivity testing. Report of an international collaborative study. Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sec. B, Suppl. 217. 6. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at www.clsi.org 7. Berger, U. 1992. Neisseriaceae. In: Mikrobiologische Diagnostik (F. Burkhardt, ed.). Thieme Verlag, Stuttgart, Germany. 8. Nash, P., and M.M. Krenz. Culture media. In: Manual of clinical microbiology, (Balows, A., et al., eds.). 5 th edition. American Society for Microbiology, Washington, D.C., USA. 9. Miller, J.M., and H.T. Holmes. 1995. Specimen collection, transport, and storage. In: Murray, P. R., E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. PA-254035.05-4 -
10. Forbes, B.A., and P.A. Granato. 1995. Processing specimens for bacteria. In: P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 11. P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.). 1995. Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. ENVASE/DISPONIBILIDAD Nº de cat. 254035 Medios en placa listos para usar, 20 placas Nº de cat. 254082 Medios en placa listos para usar, 120 placas INFORMACIÓN ADICIONAL Para obtener más información, diríjase a su representante local de BD. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D-69126 Heidelberg/Germany Phone: +49-62 21-30 50 Fax: +49-62 21-30 52 16 Reception_Germany@europe.bd.com http://www.bd.com http://www.bd.com/europe/regulatory/ ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company. 2011 BD PA-254035.05-5 -