Práctica # 3 DIFUSIÓN Y ÓSMOSIS I. Objetivos Al final del laboratorio el estudiante debe ser capaz de: II. 25 * Describir el mecanismo de difusión a nivel molecular. * Describir el concepto de membrana permeable selectiva y explicar su papel en la ósmosis * Entender los conceptos de hipotónico, hipertónico e isotónico. * Discutir la influencia de la membrana celular sobre el comportamiento osmótico en las células. * Reconocer los procesos de difusión, ósmosis y diálisis en células vivas. * Entender los principios de actividad osmótica en las actividades diarias de una persona. * Explicar como la presión que ejercen las moléculas favorece los procesos de la difusión y ósmosis Introducción Cualquiera que sea la organización específica de un ser vivo, unicelular o pluricelular, procariota o eucariota, en sus células no puede faltar la membrana celular. La membrana celular es la estructura que separa al líquido intracelular (LIC) del extracelular (LEC). Ella está formada por dos compuestos orgánicos: los fosfolípidos y las proteínas. Su estructura actual -fue propuesta en 1972 por S. Singer y G. L. Nicholson. Su modelo se conoce con el nombre de mosaico fluido o mosaico de los líquidos. El modelo de mosaico fluido explica que la membrana plasmática consiste en una bicapa líquida de moléculas de fosfolípidos en donde están incluidas las proteínas. Las proteínas de la membrana celular permiten el paso del medio intracelular (LIC) al medio extracelular (LEC) y viceversa, de moléculas pequeñas ya sea en forma activa o pasiva, otras actúan como receptoras de señales como por ejemplo de hormonas; otras actúan como sitios de fijación para enzimas solubles y para el citoesqueleto. Es a través de la membrana celular que se controla el transporte de materiales entre el líquido intracelular (LIC) y el líquido extracelular (LEC), dado que ella es selectiva y semipermeable, pues impide que algunas sustancias grandes como los lípidos y proteínas la atraviesen fácilmente; pero permiten el paso de azúcares simples, oxígeno, dióxido de carbono, agua, glicerol, urea y otras moléculas. Este paso depende del tamaño y carga de las moléculas y de la composición de la membrana celular. Este transporte celular puede ocurrir por procesos pasivos y activos. Los transportes pasivos no requieren el aporte de energía celular (ATP), y las moléculas se desplazan a favor de una gradiente de concentración: la sustancia se desplaza del sitio de mayor al de menor concentración. Entre los ejemplos están la difusión, ósmosis, diálisis y difusión facilitada. La difusión es el movimiento de partículas (átomos, iones y moléculas) de una región de alta concentración a otra de menor concentración, puede ocurrir en presencia o no de una membrana celular. La difusión permite los procesos de ósmosis y diálisis. La ósmosis desplaza el agua a través de la membrana celular desde un sitio de alta hacia otro de baja concentración. Los procesos osmóticos se denominan plasmólisis y turgencia en los vegetales y en las células animales se llaman lisis y crenación. De acuerdo con la presión osmótica, las soluciones extracelulares se dividen en isotónicas, hipotónicas e hipertónicas.
26 En las soluciones isotónicas, la concentración de solutos en el líquido intracelular es igual a la concentración presente en el líquido extracelular. En las soluciones hipotónicas, el líquido que rodea a la célula tiene menor concentración de sustancias, más agua y menos presión osmótica que el interior de la célula; por lo tanto, el agua se difunde desde el exterior hacia el interior celular. Las soluciones hipertónicas tienen mayor concentración de solutos, menor cantidad de agua y mayor presión osmótica que el LIC, esto provoca que el agua pase del interior al exterior de la célula. III. Procedimiento Durante la sesión de laboratorio se realizarán 5 experimentos donde se estudiaran distintos aspectos del transporte de solutos y agua a través de membranas. Para ello, el grupo de laboratorio será dividido en 8-10 subgrupos de trabajo, con 3-4 estudiantes cada uno. Cada experimento será ejecutado y analizado por dos subgrupos. Al finalizar los experimentos, se hará una discusión de los resultados obtenidos. Cada subgrupo debe estar preparado para discutir sus resultados Experimento 1.- Tasa de difusión de solutos: Los distintos solutos se mueven en el interior celular y en los espacios intercelulares a través del proceso de difusión. Sin embargo, la tasa de difusión (la distancia que recorre el soluto en un tiempo determinado) es afectada por múltiple factores. El siguiente experimento demuestra el efecto del tamaño molecular o la concentración en la tasa de difusión sobre un sustrato común (gelatina). En este experimento la gelatina es utilizada como sustrato permeable y por lo tanto simula el espacio citoplasmático. Para calcular la tasa de difusión utilizaremos la siguiente ecuación: Tasa de difusión = distancia (mm, cm) / tiempo (seg, min, hrs) 1. Describa brevemente su hipótesis de trabajo y prediga sus resultados 2. En su mesón de trabajo encontrará una caja de petri que contiene una capa fina (matriz) de gelatina clara solidificada o agar (2%). 3. Con un tubo de ensayo pequeño, haga 3 pozos en la superficie de la matriz. 4. Agregue una gota de uno de los colorantes disponible a uno de los pozos (evite la formación de burbujas. Anote el tiempo. 5. Repita el procedimiento para cada colorante (un colorante para cada pozo). 6. Transfiera cuidadosamente la caja de petri sobre una hoja blanca, sin temblar o correr el colorante. 7. Cada 10 min, haga medidas de la distancia (diámetro) recorrida por el colorante. 8. Haga una gráfica donde represente la distancia recorrida por cada colorante en función del tiempo transcurrido. 9. Responda las preguntas especificadas en su reporte.
Experimento 2.- Ósmosis 27 1. Colecte 6 bolsas de diálisis que contienen agua destilada (dh2o) y sacarosa a distintas concentraciones (0.2M, 0.4M, 0.6M, 0.8M y 1.0M). 2. Lave cuidadosamente cada bolsa con dh 2 O y seque el exceso de solución 3. Pese cada una de las bolsas de diálisis 4. Coloque cada bolsa de diálisis en un envase con dh 2 O y espere 1 hora 5. Mientras espera, diseñe una hipótesis experimental y prediga el resultado 6. Retire las bolsas de diálisis y péselas nuevamente. Recuerde secar el exceso de solución en la superficie externa de la bolsa antes de pesar 7. Calcule la diferencia en pesos antes y después de 1 hora y determine el porcentaje de cambio en el peso de la bolsa de diálisis 8. Responda las preguntas especificadas en su reporte Experimento 3.- Efecto de la presión osmótica sobre las células (a) Plasmólisis en células vegetales 1. Sobre un portaobjetos coloque una gota de solución de NaCl 0.9% (isotónica) y un fragmento de epidermis de cebolla u hoja de Elodea. Cubra y observe al microscopio. 2. Haga un dibujo de la preparación (rotule las estructuras observadas). Describa la apariencia de las células que observa 3. Retire la preparación del microscopio y agregue una gota de solución de NaCl 5% (hipertónica) en uno de los bordes del cubreobjetos. En el lado opuesto coloque un pedacito de papel absorbente para permitir que la solución hipertónica quede en contacto con las células. Observe al microscopio. 4. Haga un dibujo de la preparación que ilustre los cambios observados en la apariencia de las células en esta condición experimental. Rotule las estructuras observadas (b) Turgencia en células vegetales 1. En la misma preparación, reemplace la solución hipertónica por agua destilada siguiendo el mismo procedimiento anterior. Observe al microscopio y explique los cambios que ocurren. 2. Haga un dibujo de la preparación que ilustre los cambios observados en esta condición experimental. Rotule las estructuras observadas Experimento 4.- Difusión de moléculas a través de membranas semipermeable 1. Tome una bolsa de celulosa ya preparada que contiene una mezcla de 10% glucosa (180 g/mol), 0.5% almidón (~200,000 g/mol) y 1.5% albúmina. 45,000 g/mol).registre el color de la bolsa de diálisis 2. Lave cuidadosamente la bolsa de diálisis con dh2o. Seque el exceso de solución presente en la cubierta externa de la bolsa 3. Pese la bolsa de diálisis y registre éste valor
4. Llene un beaker de 150mL con 100 ml de agua destilada y añada aproximadamente 5 ml de solución de Lugol 5. Tome una muestra de esta solución colóquelo en un tubo de ensayo y agréguele reactivo de Benedict (cuando le agrega el reactivo, caliente la muestra con un mechero o baño de maría). Registre el color 6. Coloque la bolsa de diálisis dentro de la solución de Lugol de forma que quede completamente cubierta. Sujete la bolsa como se observa en la figura 3. Anote el tiempo. 7. Diseñe una hipótesis de trabajo y una predicción de sus resultados. Diseñe el experimento control apropiado 28 8. Después de 45 minutos, retire cuidadosamente la bolsa del beaker y colóquela en un recipiente seco y limpio. Observe y registre cualquier cambio en la coloración de la solución contenida en la bolsa de diálisis y en la solución en el beaker 9. Seque con una toalla el exceso de solución en el exterior y pese la bolsa de diálisis. Calcule el porcentaje de cambio en el peso de la bolsa de diálisis 10. Tome una muestra de la solución del beaker y haga la prueba de Benedict nuevamente 11. Complete la tabla en el reporte. 12. En base a sus resultados, conteste las preguntas del reporte Experimento 5.- Permeabilidad de la membrana: efecto del tamaño molecular y la polaridad de la solución + Almidón + Albúmina El mecanismo mediante el cual un soluto presente entra a la célula desde el medio extracelular depende de la polaridad del soluto y de su tamaño molecular, entre otros factores. Solutos no polares pasan directamente a través de la Concentración y Coeficiente membrana plasmática. Dentro de un grupo de compuestos Nombre del alcohol de Partición químicamente relacionados (compuestos no polares) aquellos con 22 M Alcohol Metílico 0.01 mayor solubilidad en lípidos pueden entrar a la célula más (32.04 gr/mol) rápidamente que aquellos compuestos similares pero con baja 8.5 M Alcohol Etílico 0.03 solubilidad en lípidos. (46.07 gr/mol) 3 M Alcohol Propílico 0.13 En este experimento se observará el efecto del tamaño molecular y (60.09 gr/mol) la polaridad de un solvente en el grado de permeabilidad de la 1.1 M Isobutil Alcohol 0.18 membrana. Para ello utilizaremos cubos o cilindros de remolacha (74,12 gr/mol) (Beta vulgaris) cuyas células contienen una gran cantidad de 1.1 M n Butil Alcohol 0.58 pigmento rojo denominado antocianinas. Cuando ocurre alguna (74,12 gr/mol) ruptura mecánica o química de la membrana plasmática, el 0.38 M Amil-alcohol 2.00 pigmento es liberado. Como agentes disruptores de la membrana, (88.15 gr/mol) utilizaremos distintos alcoholes que dependiendo de su estructura molecular, posee diferentes grados de solubilidad en lípidos y tamaño molecular. Como un índice del grado de solubilidad lipídica utilizaremos el coeficiente de partición que mide la afinidad relativa de la sustancia en un solvente orgánico y grasa (octanol) en función de la solubilidad en agua.
29 Mientras mayor es su valor, mayor es la solubilidad en octanol y solventes grasos, y por lo tanto, menor es la polaridad. 1. Corte cubos o cilindros de remolacha, de aproximadamente el mismo tamaño. Lávelos muy bien con una solución de 0.9% NaCl, de forma de eliminar cualquier remanente de antocianina presente. 2. Limpie los muestras de remolacha cuidadosamente con papel toalla 3. Prepare 6 tubos de ensayos pequeños, limpios y secos. Dispense las siguientes soluciones: Tubo 1: 6-10 ml de alcohol metílico (22 M) Tubo 2: 6-10 ml de alcohol metílico (8.5 M) Tubo 3: 6-10 ml de alcohol propílico (3 M) Tubo 4: 6-10 ml de alcohol butílico (1.1 M) Tubo 5: 6-10 ml de amil-alcohol (0.38 M) 4. Coloque un pedazo de remolacha en cada tubo de ensayo. Este corresponde al tiempo 0. Evite cualquier perturbación mecánica de los tubos 5. Registre el tiempo requerido para la liberación de la antocianina en cada tubo de ensayo. Anote éste valor en la columna tiempo en su hoja de datos 6. Calcule el coeficiente de penetración para cada alcohol, dividiendo el tiempo (en minutos) entre su concentración 7. Haga una gráfica que correlacione el coeficiente de penetración en función del coeficiente de partición para cada alcohol (ver cuadro anexo)