Práctica # 4. I. Objetivos. Introducción

Transcripción

1 Práctica # 4 DIFUSIÓN Y ÓSMOSIS 1 I. Objetivos Al final del laboratorio el estudiante debe ser capaz de: * Calcular la tasa de difusión de un reactivo dado. * Describir el concepto de membrana permeable selectiva y explicar su papel en la ósmosis * Entender los conceptos de hipotónico, hipertónico e isotónico. * Discutir la influencia de la membrana celular sobre el comportamiento osmótico en las células. * Describir el mecanismo de difusión a nivel molecular. * Reconocer los procesos de difusión, ósmosis y diálisis en células vivas. * Explicar como la presión que ejercen las moléculas favorece los procesos de la difusión y ósmosis * Identificar el efecto del tamaño de la molécula y su polaridad sobre la permeabilidad de la membrana. II. Introducción Cualquiera que sea la organización específica de un ser vivo, unicelular o pluricelular, procariota o eucariota, en sus células no puede faltar la membrana celular. La membrana celular es la estructura que separa al líquido intracelular (LIC) del extracelular (LEC). Está formada por dos compuestos orgánicos: los fosfolípidos y las proteínas. Su estructura actual fue propuesta en 1972 por S. Singer y G. L. Nicholson. Su modelo se conoce con el nombre de mosaico fluido o mosaico de los líquidos. El modelo de mosaico fluido explica que la membrana plasmática consiste en una bicapa líquida de moléculas de fosfolípidos en donde están incluidas las proteínas. Las proteínas de la membrana celular permiten el paso del medio intracelular (LIC) al medio extracelular (LEC) y viceversa, de moléculas pequeñas ya sea en forma activa o pasiva, otras actúan como receptoras de señales como por ejemplo de hormonas; otras actúan como sitios de fijación para enzimas solubles y para el citoesqueleto. Es a través de la membrana celular que se controla el transporte de materiales entre el líquido intracelular (LIC) y el líquido extracelular (LEC), dado que es selectiva y semipermeable, pues impide que algunas sustancias grandes como los lípidos y proteínas la atraviesen fácilmente; pero permite el paso de azúcares simples, oxígeno, dióxido de carbono, agua, glicerol, urea y otras moléculas. Este paso depende del tamaño y carga de las moléculas y de la composición de la membrana celular. Este transporte celular puede ocurrir por procesos pasivos y activos. Los transportes pasivos no requieren el aporte de energía celular (ATP), y las moléculas se desplazan a favor de una gradiente de concentración: la sustancia se desplaza del sitio de mayor al de menor concentración. Entre los ejemplos están la difusión, ósmosis y diálisis. La difusión es el movimiento de partículas (átomos, iones y moléculas) de una región de alta concentración a otra de menor concentración, puede ocurrir en presencia o no de una membrana celular.

2 2 La ósmosis es un proceso que describe el movimiento del agua (solvente) a través de la membrana celular desde una región con menor concentración de soluto (más diluida) a una más concentrada. Cuando una célula se sumerge en un líquido con diferente concentración al del medio intracelular, la presión osmótica puede ocasionar cambios importante en el volumen de la célula (se entiende por presión osmótica la presión que sería necesaria para detener el flujo de agua a través de la membrana semipermeable). De acuerdo con la presión osmótica, las soluciones extracelulares se dividen en isotónicas, hipotónicas e hipertónicas En las soluciones isotónicas, la concentración de solutos en el líquido intracelular es igual a la concentración presente en el líquido extracelular, por lo que no se observa un movimiento neto de agua y soluto. En las soluciones hipotónicas, el líquido que rodea a la célula tiene menor concentración de sustancias, más volumen de agua y menor presión osmótica que el interior de la célula; por lo tanto, el agua difunde desde el exterior hacia el interior celular. Bajo éstas condiciones, se observan los procesos de lisis y turgencia en células animales y vegetales, respectivamente. En contraste, las soluciones hipertónicas tienen mayor concentración de solutos, menor cantidad de agua y mayor presión osmótica que el LIC, esto provoca que el agua pase del interior al exterior de la célula. En éstos casos se observan los fenómenos de crenación y plasmólisis en células animales y vegetales, respectivamente El proceso de diálisis, se refiere a la separación de molélculas de soluto en función de su tamaño, utilizando una membrana con permeabilidad diferencial. Esta membrana tiene poros que permite el paso de moléculas pequeñas e impide el paso de moléculas de mayor tamaño, como globulinas, albumina, etc. Los conceptos de ósmosis y diálisis tienen diferenctes aplicaciones en el campo de la nutrición, biología y medicina. Osmosis generalmente explica fenómenos naturales tales como la apertura/cierre de los estomas en las hojas que permite controlar la evaporación en las plantas; las diferencias adaptativas que se observan entre peces marinos y dulceaquícolas, o cómo los productos de desechos son eleiminados del torrente sanguíneo. Diálisis es un proceso frecuntemente en el tratamiento a pacientes con fallo renal. La sangre arterial del paciente alimenta a una máquina que contiene un tubo de diálisis que actúa como una membrana de permabilidad diferencial. Alrededor de éste tubo se localiza una solución isotónica con respeto a todo los componentes que permanecen en el flujo sanguíneo (sin los desechos). Esta solución isotónica, regresa entonces al paciente. III. Procedimiento Durante la sesión de laboratorio se realizarán cinco (5) experimentos donde se estudiaran distintos aspectos del transporte de solutos y agua a través de membranas. Para lograr éste objetivo, los miembros pares o impares de cada uno de los subgrupos de laboratorio definidos en la primera sesión de laboratorio, realizarán y analizarán un experimento, de acuerdo a las indicaciones del instructor. Al finalizar los experimentos, todos los miembros de cada subgrupo se reúnen para hacer una discusión de los resultados obtenidos y completar el reporte. Cada subgrupo debe estar preparado para presentar y discutir sus resultados.

3 3 Experimento 1 Determinación de la tasa de difusión de solutos Los distintos solutos se mueven en el interior celular y en los espacios intercelulares a través del proceso de difusión. Sin embargo, la tasa de difusión (la distancia que recorre el soluto en un tiempo determinado) es afectada por múltiples factores. El siguiente experimento demuestra el efecto del tamaño molecular o la concentración en la tasa de difusión sobre un sustrato común (agar). En este experimento el agar es utilizado como sustrato permeable y por lo tanto simula el espacio citoplasmático, no una membrana. Para calcular la tasa de difusión utilizaremos la siguiente ecuación: Tasa de difusión = distancia (mm,cm)/ tiempo (seg,min,hrs) 1. Describa brevemente su hipótesis de trabajo y prediga sus resultados 2. En su mesón de trabajo encontrará una caja de Petri que contiene una capa fina (matriz) de gelatina clara solidificada o agar (2%). 3. Verifique que su placa cuenta con 3 pozos pequeños, de lo contrario proceda a perforar 3 pozos en la superficie de la matriz. 4. Agregue una gota de uno de los colorantes disponible a uno de los pozos (evite la formación de burbujas y el derrame de la sustancia). A partir de este momento (tiempo 0) se iniciará la toma de datos. 5. Repita el procedimiento para cada colorante (una gota de colorante para cada pozo). 6. Transfiera cuidadosamente la caja de Petri sobre una hoja blanca, evitando hacer movimientos bruscos. 7. Durante 30 minutos, mida la distancia que recorre cada colorante cada 2 minutos, colocando una regla transparente sobre cada pozo. 8. Al finalizar los 30 minutos, mida la distancia recorrida cada 5 min, hasta completar 40 min 9. Haga una gráfica donde se represente la distancia recorrida por cada colorante en función del tiempo transcurrido. Calcule la tasa de difusión de cada soluto como la pendiente de la curva. 10. Responda las preguntas especificadas en su reporte. Experimento 2 Simulación del proceso de ósmosis 1. Colecte 6 bolsas de diálisis que contienen agua destilada (dh2o) y sacarosa a distintas concentraciones (0.2M, 0.4M, 0.6M, 0.8M y 1.0M). Tenga cuidado de identificarlas correctamente y no mezclarlas. 2. Lave cuidadosamente cada bolsa con dh 2 O y seque el exceso de solución utilizando papel absorbente con cuidado. 3. Pese cada una de las bolsas de diálisis en una balanza y anote el peso en un cuadro elaborado para dicho fin, utilice al menos 2 decimales. 4. Coloque cada bolsa de diálisis en un envase con dh 2 O y espere 1 hora. 5. Mientras espera, diseñe una hipótesis experimental y prediga el resultado.

4 4 6. Retire las bolsas de diálisis y péselas nuevamente. Recuerde secar el exceso de solución en la superficie externa de la bolsa antes de pesar. Verifique que al finalizar sus medidas el área de pesado se encuentre seca y ordenada. 7. Calcule la diferencia en pesos antes y después de 1h y determine el porcentaje de cambio en el peso de la bolsa de diálisis. %cambio peso = (Peso final-peso inicial)/peso inicial x Responda las preguntas especificadas en su reporte. (A) Células vegetales Experimento 3 Efecto de la presión osmótica sobre las células 1. Sobre un portaobjetos coloque una gota de solución de NaCl 0.9% (isotónica) y un fragmento de epidermis de cebolla u hoja de Elodea. Cubra y observe al microscopio. 2. Haga un dibujo de la preparación (rotule las estructuras observadas). Describa la apariencia de las células que observa en términos de distribución de los cloroplastos y estado de la vacuola. 3. Retire la preparación del microscopio y agregue una gota de solución de NaCl 5% (hipertónica) en uno de los bordes del cubreobjetos. En el lado opuesto coloque un pedacito de papel absorbente para permitir que la solución hipertónica quede en contacto con las células. Observe al microscopio, enfocando la parte de la muestra que ha estado en mayor contacto con la disolución. 4. Haga un dibujo de la preparación que ilustre los cambios observados en la apariencia de las células en esta condición experimental. Rotule las estructuras observadas. 5. En la misma preparación, reemplace la solución hipertónica por agua destilada siguiendo el mismo procedimiento anterior. Observe al microscopio y explique los cambios que ocurren. 6. Haga un dibujo de la preparación que ilustre los cambios observados en esta condición experimental. Rotule las estructuras observadas. En todos los casos recuerde anotar el aumento de la muestra. 7. Complete las preguntas del reporte (B) Células animales 1. Tome un algodón con alcohol y limpie la zona de la yema del dedo índice de un compañero. 2. Con una lanceta punce el área y oprima el dedo para sacar tres gotas de sangre y colóquelas en un tubo de ensayo pequeño 3. Agregue 0.5 ml de 0,95 % NaCl y mantenga la preparación en frío 4. Ponga media gota de la solución de sangre sobre un portaobjetos, cúbrala con cubreobjetos y observe en 40X la forma de los eritrocitos. Mida el diámetro de células diferentes unas 10 veces en esta solución. Calcule el promedio y la desviación estándar de sus datos 5. En otro portaobjeto, coloque media gota de la solución de sangre y agregue con una pipeta o gotero media gota de la solución 0.1M sacarosa y coloque el cubreobjetos. Observe el comportamiento de los eritrocitos. Mida el diámetro de 10 células diferentes. Calcule el promedio y la desviación estándar de sus datos

5 5 6. En otro portaobjeto. coloque media gota de la solución de sangre y agregue con una pipeta o gotero media gota de la solución 0.3M sacarosa y coloque el cubreobjetos. Observe el comportamiento de los eritrocitos en ésta solución. Mida el diámetro de 10 células diferentes. Calcule el promedio y la desviación estándar de sus datos 7. Finalmente, coloque en otro portaobjeto, media gota de la solución de sangre y agregue con una pipeta o gotero media gota de la solución 0.6M y cubra con un cubreobjetos Observe el comportamiento de los eritrocitos en ésta solución. Mida el diámetro de 10 células diferentes. Calcule el promedio y la desviación estándar de sus datos. 8. Complete las preguntas del reporte. Experimento 4 Factores que afectan la oermeabilidad de la membrana. El mecanismo mediante el cual un soluto presente entra a la célula desde el medio extracelular depende de la polaridad del soluto y de su tamaño molecular, entre otros Concentración y Coeficiente factores. Solutos no polares pasan directamente a través de la Nombre del alcohol de Partición membrana plasmática. Dentro de un grupo de compuestos 22 M Alcohol Metilico 0.01 químicamente relacionados (compuestos no polares) aquellos con (32.04 g/mol) mayor solubilidad en lípidos pueden entrar a la célula más 8.5 M Alcohol Etílico 0.03 rápidamente que aquellos compuestos similares pero con baja (46.07 g/mol) solubilidad en lípidos. 3 M Alcohol Propílico 0.13 En este experimento se observará el efecto del tamaño molecular (60.09 g/mol) y la polaridad de un solvente en el grado de permeabilidad de la 1.1 M Isobutíl Alcohol 0.18 membrana. Para ello utilizaremos cubos o cilindros de remolacha (74,12 g/mol) (Beta vulgaris) cuyas células contienen una gran cantidad de 1.1 M n Butíl Alcohol 0.58 pigmento rojo denominado betaínas. Cuando ocurre alguna (74,12 g/mol) ruptura mecánica o química de la membrana plasmática, el 0.38 M Amil-alcohol 2.00 pigmento es liberado. Como agentes disruptores de la membrana, (88.15 g/mol) utilizaremos distintos alcoholes que dependiendo de su estructura molecular, poseen diferentes grados de solubilidad en lípidos y tamaño molecular. Como un índice del grado de solubilidad lipídica utilizaremos el coeficiente de partición que mide la afinidad relativa de la sustancia en un solvente orgánico y grasa (octanol) en función de la solubilidad en agua. Mientras mayor es su valor, mayor es la solubilidad en octanol y solventes grasos, y por lo tanto, menor es la polaridad. 1. Plantee una hipótesis de trabajo y su respectiva predicción. 2. Corte cubos o cilindros de remolacha, de aproximadamente el mismo tamaño, de lo contrario, solamente tome algunos cubos de tamaños similares. Lávelos muy bien con una solución de 0.9% NaCl, de forma de eliminar cualquier remanente de antocianina presente debido a daño mecánico. 3. Limpie los muestras de remolacha cuidadosamente con papel toalla. 4. Prepare 6 tubos de ensayos limpios y secos. Dispense las siguientes soluciones:

6 6 Tubo Contenido 1 2ml de alcohol metílico (22 M)d 2 2 ml de alcohol etílico (8.5 M) 3 2 ml de alcohol propílico (3 M) 4 2 ml de alcohol butílico (1.1 M) 5 2 ml de amil-alcohol (0.38 M) 5. Coloque un trozo de remolacha en cada tubo de ensayo. Anote el tiempo exacto en que se ha agregado a cada cubo, este corresponde al tiempo 0. Evite cualquier perturbación mecánica de los tubos y observe detenidamente cada tubo de ensayo, esperando la liberación de pigmentos. 6. Registre el tiempo requerido para la liberación de la antocianina en cada tubo de ensayo. Anote éste valor en la columna tiempo en su hoja de datos. 7. Calcule el coeficiente de penetración para cada alcohol, dividiendo el tiempo (en minutos) entre su concentración. 8. Haga una gráfica que correlacione el coeficiente de penetración en función del coeficiente de partición para cada alcohol (ver cuadro al inicio). Experimento 5 Observación del proceso de diálisis En vertebrados, los rinones tienen como function remover los compuestos tóxicos productos del metabolismo (urea, ác. úrico, creatinina, potasio, H + entre otros), eliminar el exceso de agua corporales y mantener el balance de iones tales como potasio y sodio. Cuando se genera un fallo en la función renal, se observa acumulación de desechos tóxicos, aumenta la presión sanguínea y el volumen sanguíneo. En Costa Rica, a provincia de Guanacaste ha alcanzado la cifra de por cada 100 mil habitantes de la población padece de insuficiencia renal, una enfermedad en donde la función del rinon decae hasta valores entre 10-15%. En éstos casos, los pacientes requieren de diálisis o transplante de órgano. paciente (ver figura) En la hemodiálisis, la sangre del paciente fluye lentamente a través de un filtro especial que remueve los desechos y el exceso de fluído y, posterioremente, regresa al

7 7 En el siguiente experimento se simulará el proceso de hemodiálisis utilizando sangre artificial, que se separa de la solución de dialisado, a través de una membrana con permeabilidad selectiva 1. Dispense en un becker, 200 ml de una solución 0.9% NaCl. Esta solución representa el dialisado (ver figura). 2. Tome muestras pequeñas del dialisado y determine la presencia de proteínas, azúcar, almidón, con los reactivos apropiados (recuerde los experimentos realizados en la práctica #3). 3. Obtenga 10 ml de de sangre artificial (ya preparada). Tome muestras pequeñas de la sangre articial y determine también la presencia de proteínas, azúcar, almidón y el valor de ph. 4. Tome la bolsa de diálisis y ate fuertemente con un cordón, uno de los extremos del tubo de diálisis. 5. Con mucho cuidado vierta la sangre artificial en la bolsa de diálisis. Cierre la bolsa haciendo un nudo en el otro extremo. 6. Lave cuidadosamente la cubierta externa de la bolsa con dh2o y seque el exceso de agua de utilizando papel absorbente. 7. Pese la bolsa de diálisis y registre éste valor. 8. Colóquela bolsa de diálisis dentro del beaker con el dialisado de forma que quede completamente cubierta. Anote el tiempo. 9. Diseñe una hipótesis de trabajo y una predicción de sus resultados. Diseñe el experimento control apropiado. 10. Después de 45 minutos, retire cuidadosamente la bolsa del beaker y colóquela en un recipiente seco y limpio. Observe y registre cualquier cambio en la coloración de la solución contenida en la bolsa de diálisis y en el dialisado. 11. Seque con una toalla el exceso de solución en el exterior y pese la bolsa de diálisis. Calcule el porcentaje de cambio en el peso de la bolsa de diálisis. 12. Tome muestras pequeñas del dialisado y de la sangre artificial y determine la presencia de proteínas, azúcar, almidón, con los reactivos apropiados. Mida el ph en ambas soluciones. 13. Registre sus datos en el cuadro correspondiente en el reporte. 14. Con base en sus resultados, conteste las preguntas especificadas en el reporte.