Microscopio Electrónico Prof. Iván Rebolledo El microscopio electrónico fue desarrollado en los años 30 y fue utilizado con especímenes biológicos por Albert Claude, Keith Porter y George Palade en los años 40 y 50. El ME puede lograr mucha mayor resolución que el MO debido a que la longitud de onda de los electrones es mucha más corta que la luz. Debido a esto puede obtenerse mayor cantidad de información, aspecto muy importante en la investigación y en el diagnóstico patológico. Diferencias entre MO y ME. La principal ventaja del ME sobre el MO es la resolución y no la magnificación. La resolución es la capacidad del instrumento de discriminar como independientes dos puntos muy cercanos. En el MO depende de la λ y de la AN de los objetivos, pudiendo obtenerse una resolución de 0.2 mm (200 nm) con luz visible y 0.1 mm (100 nm) con luz ultravioleta. El ME utiliza como fuente luminosa un rayo electrónico que posee una λ igual a 0.05 Å, que es modificado en su trayecto por los campos electromagnéticos y cuya resolución, para materiales biológicos, es de 1 a 2 nm. Convierta todas las cantidades mencionadas en Angström. Tanto el MO como el ME comprenden 3 sistemas relacionados con la imagen : iluminación de la muestra, formación de la imagen y traducción de la imagen. El sistema de iluminación comprende una fuente de radiación (luz visible o electrones) y el condensador que enfoca el rayo en el plano de la muestra. Después de pasar por la muestra, el rayo entra al sistema de formación de la imagen, conformado por los lentes de vidrio (MO) o los lentes electromagnéticos (ME). El sistema de traducción de la imagen corresponde al sistema de obser-vación y registro fotográfico de la imagen. Sistemas del ME. El ME consta de 3 secciones : sistema eléctrico, sistema de vacío y columna del microscopio. 1. Sistema eléctrico : consiste en una unidad de alta tensión, una unidad de suministro de corriente para las lentes electromagnéticas y una unidad estabilizadora del voltaje en la unidad de alta tensión y las lentes electromagnéticas. La unidad de alta tensión opera entre -20 y -100 KV para generar el alto voltaje necesario para obtener un rayo electrónico de muy corta λ.
2. Sistema de vacío : existen 3 razones por las cuales debe haber vacío en la columna de un ME : a) frente al aire, los electrones solo podrían viajar unos micrómetros antes de chocar con alguna partícula y la distancia entre el filamento y la pantalla de observación es casi de un metro. Así, el vacío permitiría que los electrones puedan desplazarse en toda esta extensión sin chocar con ninguna partícula. b) cualquier molécula gaseosa existente entre el filamento y el ánodo pudiera convertirse en iones cargados, originando una descarga eléctrica en lugar de un rayo de electrones. c) en vacío, la vida media del filamento es mayor, reduciéndose la posibilidad de oxidación cuando se caliente. Para lograr vacío, se dispone de dos tipos de bombas : una de difusión de aceite respaldada por una bomba rotatoria mecánica. Como las vibraciones de estas bombas pueden alterar la imagen en el ME, se las instala alejadas del instrumento. Para evitar tener que ventilar y reevacuar toda la columna cada vez que se desee cambiar la muestra o las placas, existe un sistema de compuertas que aislan estos compartimentos. 3. Columna del microscopio : consiste en un tubo metálico al vacío en el cual están ubicados, de arriba abajo, el filamento de tungsteno encerrado en el cilindro del cátodo, la placa del ánodo, un número de lentes electromagnéticas, una pantalla fluorescente de observación y un dispositivo con placas fotográficas. 3. (a) Producción de electrones : el rayo de electrones es producido por el llamado cañón electrónico, conformado por un filamento de tungsteno (wolframio, W) introducido en una cubierta metálica cilíndrica denominada cubierta del cátodo, el cual tiene un pequeño orificio en su centro; por debajo de ella, está una pequeña placa metálica llamada ánodo (polo positivo). Al circular corriente por el filamento se producen electrones debido a una emisión termoiónica, cuando el filamento llega a calentarse a 2.200 ºC. Los electrones son arrastrados hacia el ánodo por una gran diferencia de potencial entre el cátodo (-20 a - 200 KV) y el ánodo (cero). Esta diferencia en el voltaje se conoce como voltaje de aceleración y la λ de los electrones es inversamente proporcional a esta diferencia de potencial.
CATODO Filamento El rayo electrónico producido en el cañón electrónico es enfocado por el lente condensador en el plano del especímen como un punto de luz de un diámetro muy pequeño. ANODO 3. (b) Lentes electromagnéticos : las lentes en el ME son bobinas electromagnéticas cilíndricas capaces de crear campos magnéticos que puedan modificar la trayectoria de los electrones. Una bobina se encuentra cubierta con una caparazón de hierro dejando en su centro un pequeño orificio. Para enfocar un rayo electrónico en un plano dado puede variarse la corriente que pasa por la bobina. Al aumentar la cantidad de corriente que pasa por una lente el rayo se acerca a la lente y al reducir la corriente, aumenta la longitud focal. Así, las lentes electromagnéticas tienen una longitud focal variable. A Campo magnético Dibuje en la parte derecha del dibujo, cómo se representaría el campo magnético al aumentar la cantidad de corriente que pasa por el lente A. Si se aumenta la corriente en el lente condensador, el punto se produce por encima del espécimen (sobre-enfocado) y si se disminuye la corriente, el punto se forma por debajo del espécimen (subenfocado). Normalmente, existen dos lentes condensadores como un sistema que dé mejor iluminación que uno solo. En este caso, el primer lente condensador reduce el diámetro del rayo electrónico de 50 mm a 1 mm. Este rayo reducido es proyectado en el espécimen por el segundo lente condensador. En la práctica, la corriente del primer lente condensador se mantiene constante y se varía la corriente del segundo lente para un enfoque más preciso sobre el espécimen. Al chocar el rayo contra el espécimen, muchos electrones lo atraviesan sin desviarse, pero otros son desviados por la presencia de átomos de metales pesados presentes en ciertas estructuras de la muestra. Esto forma un modelo en el rayo emergente que es transformado en imagen por el lente objetivo.
El lente objetivo genera un campo magnético muy concentrado Enfoca los electrones que pasaron por él, unos milímetros por debajo del plano del espécimen. Allí se forma una imagen aumentada (200 x), llamada imagen intermedia y la calidad de esta imagen es la que determina la calidad de la imagen final. Esta imagen intermedia es aumentada por el lente proyector. Este lente tiene una profundidad de foco de varios metros, así que no es crítica la distancia entre este lente y la pantalla de observación y las placas fotográficas. Debido a esta profundidad de foco, los cambios finos en el enfoque no son visibles a simple vista, por lo que debe utilizarse un MO binocular. De este modo, es el lente objetivo el que determina el poder de resolución del ME y es aquí donde las aberraciones toman importancia. Debido a que la profundidad de foco del lente objetivo es cerca de 200 nm, el grosor aconsejable de la muestra debe ser de 60 nm. La nitidez de la imagen se logra variando la corriente que pasa por el lente objetivo. Por debajo del lente objetivo, en el ME puede haber 3 lentes : difractor, intermedio y proyector. Generalmente el lente difractor se utiliza para estudios mineralográficos. La imagen producida por el lente objetivo es captada y mantenida constante por el lente intermedio. 4. Formación de la imagen : La parte final de la columna del ME es una pantalla de observación, debajo de la cual se aloja un sistema especial para las placas fotográficas. La pantalla está cubierta con un material fluorescente que al ser bombardeado con los electrones emite luz visible. Entonces, solo los electrones que lograron pasar por la muestra, producirán una imagen luminosa; los rayos desviados no emiten luz y sus zonas se verán negras. Por otra parte, el grano del material fluorescente sólo permite una resolución cercana a 35 mm, por tanto, la placa fotográfica debe contener una emulsión fotográfica de grano muy fino, para captar la mayor cantidad de estructuras con muy buena resolución.
Cable de alto voltaje Cañón electrónico Condensador 1 Apertura del condensador Condensador 2 Intercambiador muestras Lente objetivo Apertura del objetivo Apertura del difractor Lente difractor Lente proyector 1 Microscopio Binocular Lente proyector 2 Panel izquierdo de controles Ventana de observación Cámara para placas fotográficas Panel derecho de controles
Componente Cañón electrónico Condensador 1 Condensador 2 Apertura del Condensador Lente objetivo Apertura del objetivo Lente intermedio o Difractor Apertura del difractor Lente proyector 1 Lente proyector 2 Cámara observación Microscopio binocular Cámara de fotografía Función Genera los electrones y proporciona el primer grupo coherente de rayo electrónico Determina el punto de iluminación más pequeño sobre el espécimen Varía la cantidad de iluminación sobre el espécimen Reduce las aberraciones esféricas Produce la primera imagen, la enfoca y la aumenta Reduce las aberraciones esféricas y controla el contraste Proporciona el modelo de difracción y ayuda a magnificar la imagen del objetivo Selecciona el área que será difractada Ayuda a magnificar la imagen Ayuda a magnificar la imagen Contiene la pantalla de observación para la imagen final Aumenta la imagen de la pantalla de observación para un enfoque nítido Contiene las placas fotográficas para registrar la imagen final
1 milímetro = 1000 micrómetros 1 mm = 1000 µm 1 µm = 0.001 mm 1 micrómetro = 1000 nanómetros 1 µm = 1000 nm 1 nm = 0.001 µm 1 nanómetro = 10 Angstrom 1 nm = 10 Å 1 Å = 0.1 nm
Problemas. Resuelve lo siguiente : 1. Cuántos nm son 550 Å? Respuesta 2. Cuántos nm son 0.35 µm? Respuesta 3. Cuántos µm son 175 nm? Respuesta 4. Una microvellosidad mide 25 µm de largo, convierta esta cantidad en nm. Respuesta 5. Una mitocondria mide 350 nm de ancho, cuántos µm son? Respuesta 6. Un cuerpo residual mide 350 nm de diámetro, a cuántos µm corresponden? Respuesta 7. Una membrana mide 70 Å de grosor, convierta esta cantidad en nm. Respuesta