TEMA 6: MECANISMOS REGULADORES Y FERMENTACIONES INDUSTRIALES Dr. Pedro F. Mateos I. REGULACION Y COORDINACION DEL METABOLISMO MICROBIANO Un microorganismo que está creciendo rompe moléculas de alto peso molecular (almidón) introduciendo en la célula estos derivados más pequeños (glucosa, 6C) donde los degrada a moléculas más pequeñas (piruvato, 3C) convirtiéndolas en amino ácidos, nucleótidos, vitaminas, carbohidratos y ácidos grasos para finalmente construir a partir de estos materiales básicos proteínas, coenzimas, ácidos nucleicos, mucopéptidos, polisacáridos y lípidos. Reacciones metabólicas conectadas con la vía glucolítica y ciclo de Krebs Anabolismo microbiano Todo este proceso implica que cientos de enzimas deben de producirse y actuar de una manera coordinada para evitar el caos. Alrededor de unas 500 reacciones metabólicas comunes se conectan con la vía glucolítica y con el ciclo del ácido cítrico. Cada reacción requiere un enzima determinado, el cual, a su vez, es el producto de toda una serie de reacciones de transferencia de información y de síntesis proteica. Para realizar todo esto, las células poseen una elaborada red de mecanismos de control que regulan las reacciones químicas, permitiéndoles competir eficientemente con otras formas de vida para poder sobrevivir en la Naturaleza. Por lo tanto, una célula ideal no tiene producción excesiva de metabolitos ya que una buena regulación es una ventaja evolutiva; pero por otra parte las células no pueden renunciar a una cierta adaptabilidad que les permita subsistir en ecosistemas diferentes. Esto ha permitido que existan microorganismos mal regulados en determinados aspectos y que por lo tanto produzcan en demasía determinados metabolitos. Estos son los microorganismos que nos interesan. Pero además, podemos provocar que un microorganismo bien regulado produzca un determinado compuesto 23
alterando sus mecanismos reguladores. Por lo tanto, es esencial para la microbiología industrial el conocimiento de los mecanismos reguladores que a continuación se describen. transcripción al disminuir la afinidad de la proteína represora por su secuencia de DNA específica. Este caso de regulación en el que el gen en condiciones normales está reprimido se llama inducción negativa. II. INDUCCION Entre la enorme cantidad de enzimas que un microorganismo es capaz de producir existen algunos que siempre están presentes. Son los llamados enzimas constitutivos. Pero también existen otros que o bien no están presentes o bien lo están en cantidades mínimas y que ante la presencia de una sustancia, que suele ser su sustrato, la célula aumenta enormemente su cantidad. estos son los denominados enzimas inducibles y la sustancia que incrementa la síntesis de novo de estos enzimas se llama inductor. Muchos enzimas catabólicos, donde se encuentran la mayor parte de los industriales, son inducibles. A esta forma de regulación de la expresión de genes, sólo cuando el apropiado sustrato del enzima está presente, se llama inducción. El mecanismo a través del cual las proteínas represoras de la expresión génica controlan la transcripción génica en los procariotas comienza cuando la proteína represora y el enzima RNA polimerasa se unen fuertemente a diferentes secuencias específicas de nucleótidos del DNA, que reciben el nombre de región operadora y región promotora. Si está presente la proteína represora, la RNA polimerasa no puede actuar, no produciéndose la transcripción. Si no está presente la proteína represora, la RNA polimerasa se une, produciéndose la transcripción. Esta proteína represora reconoce un ligando específico y esta unión activa la Inducción negativa Una alternativa de la regulación negativa, es la regulación por medio de proteínas activadoras de la expresión génica. En este caso la proteína facilita la unión de la RNA polimerasa. Al igual que las proteínas represoras, éstas proteínas activadoras se unen a ligandos específicos (inductor) pero en este caso se incrementa la afinidad de la proteína activadora por el DNA con lo que se activa la transcripción. Si la proteína activadora se halla presente, la RNA polimerasa se une y tiene lugar la transcripción. Si por el contrario la proteína activadora no se halla presente, la RNA polimerasa no puede unirse no teniendo lugar la transcripción. Este tipo de control génico recibe el nombre de inducción positiva. Inducción positiva 24
A modo de ejemplo veamos que ocurre en Escherichia coli en la síntesis de los enzimas que hidrolizan la lactosa en glucosa y galactosa. Cuando la proteína represora está unida a la secuencia del operador, bloquea el acceso de la RNA polimerasa a su región de unión (promotor) impidiendo la transcripción. Cuando existe lactosa en la célula, ésta se une a la proteína represora eliminándola del DNA y con ello permitiendo la unión de la RNA polimerasa, activando la transcripción. III. REGULACION CATABOLICA Supongamos a la bacteria Escherichia coli creciendo en un medio con varias fuentes de carbono. La bacteria podría sintetizar enzimas para degradar todas las fuentes de carbono presentes. Esto supondría un enorme derroche de energía al sintetizar proteínas que no son estrictamente necesarias. La bacteria lo que hace es sintetizar el sistema enzimático para la utilización del mejor sustrato, reprimiéndose la síntesis de los otros sistemas enzimáticos. La glucosa fué el primer sustrato estudiado que ocasionaba represión catabólica, por lo que también se le llama efecto glucosa, aunque no es el único sustrato que produce este efecto. Sólo cuando se agota el primer sustrato se sintetizan enzimas para la utilización del siguiente. La combinación de la inducción y represión aseguran una economía celular notable ya que sólo se sintetizan los enzimas indispensables. Operón Lac de E. coli En este caso la lactosa es un inductor natural del operón Lac de Escherichia coli. Sin embargo, el mejor inductor del operón Lac es el isopropil ß-Dgalactósido. Por lo tanto, podremos manipular, a nivel de síntesis, la producción de un enzima bien sea introduciendo inductores auténticos o análogos. También se puede manipular por mutación del gen regulador (el que codifica para la proteína represora) inactivando la proteína represora, o bien por mutación del operador con lo que la proteína represora no presentará afinidad por él. Evitando el uso de fuentes de carbono represoras en el medio de cultivo se puede aumentar la producción de enzimas sensibles a la represión catabólica. Por ejemplo, usando manosa en el crecimiento de Pseudomonas fluorescens var. cellulosa se produce 1500 veces más celulasa que creciéndola en presencia de galactosa. IV. REGULACION POR RETROALIMENTACION En contraste a las rutas catabólicas que suelen estar reguladas por el sustrato inicial, como ocurre en los dos sistemas de regulación ya descritos (Inducción y Regulación catabólica); las rutas anabólicas o de biosíntesis 25
suelen estar reguladas por el producto final, como es el caso de la retroalimentación. Existen dos tipos fundamentales de regulación por retroalimentación: unión al sustrato) y la otra el sitio de unión al inhibidor. Cuando el inhibidor se une a su centro, se distorsiona la conformación del enzima impidiendo la unión del enzima a su sustrato. 1.- Inhibición por retroalimentación 2.- Represión por retroalimentación 1.- Inhibición por retroalimentación Es un fenómeno en el cual un metabolito, generalmente el metabolito final de una secuencia metabólica, inhibe la acción de un enzima anterior que, generalmente, es el primero de la secuencia. El inhibidor es el producto final y no un derivado en contraste con el sistema clásico de inhibición por competición en el cual el inhibidor se asemeja al sustrato y compite por el sitio activo del enzima (Inhibidor Isostérico). Inhibición competitiva En la inhibición por retroalimentación el inhibidor (producto final) no se parece ni en tamaño, ni en forma, ni en carga al sustrato por lo que se llama inhibición alostérica. Generalmente, los enzimas alostéricos están formados por dos o más subunidades, una de las cuales lleva el centro activo (sitio de Inhibición alostérica 2.- Represión por retroalimentación La represión por retroalimentación es un fenómeno muy común que regula la síntesis de aminoácidos y los nucleótidos púricos y pirimidínicos. Por ejemplo, si existe un nivel alto del aminoácido triptófano en el medio de cultivo, el microorganismo no va a gastar energía sintetizando los enzimas implicados en la biosíntesis de triptófano. Esta regulación se lleva a cabo mediante el producto final, en este caso triptófano, que impide que los genes que codifican para esos enzimas no se transcriban en RNA mensajero. En Escherichia coli el operón trp está formado por un promotor, un operador y cinco genes que codifican para los enzimas implicados en la síntesis de triptófano. El gen regulador codifica para una proteína represora inactiva que no se puede unir al operador por lo que la RNA polimerasa se une al promotor sintetizándose los enzimas. Por el contrario, si el triptófano está presente y no se necesita más, la proteína represora se une al triptófano y se convierte en su forma activa, la cual se une al operador bloqueando la unión de la RNA polimerasa al promotor e impidiendo la síntesis de los enzimas. 26
En la regulación acumulativa distintos productos inhiben en distinta proporción a un único enzima. A la hora de utilizar un microorganismo a nivel industrial, el más fácil de desregular sería el concertado, por lo que se tiende a usar aquellos microorganismos que utilizan este sistema, como es el caso de Corynebacterium glutamicum para la producción de lisina (aminoácido deficitario en vegetales). V. REGULACION DE LA SÍNTESIS DE RNA POR AMINOÁCIDOS Operón trp de E. coli 3.- Regulación por retroalimentación en rutas ramificadas Existen tres tipos de regulación por retroalimentación en rutas ramificadas: a) Isoenzimas o Diferencial b) Concertado c) Acumulativo En la regulación diferencial varios enzimas diferentes (denominados isoenzimas) catalizan la reacción inicial estando cada uno de ellos inhibido por un producto distinto. En la regulación concertada distintos productos se unen para inhibir un único enzima. La mayor parte de los ejemplos de regulación vistos hasta ahora responden a condiciones nutricionales específicas tales como la presencia de un disacárido o la ausencia de un aminoácido en el medio. Hace más de 20 años se descubrió en Escherichia coli un "control global" al observar que cuando se transferían las células de un medio rico a un medio pobre se paraba la síntesis de RNA disminuyendo la síntesis de proteínas. Esta observación indica que las células bacterianas pueden regular la síntesis de RNA en los casos de crisis metabólica. Actualmente se sabe que la síntesis de rrna y trna cesan bajo esas condiciones, cuando se acumulan dos guaninas polifosfatos (ppgpp y pppgpp) las cuales son sintetizadas por un enzima llamado Rel A. Cuando falta un aminoácido, en la síntesis de proteínas el correspondiente trna se encuentra en el ribosoma sin su grupo aminoacil, lo que provoca que la proteína Rel A sintetice pppgpp a partir de GTP (que se utiliza como fuente de energía en muchos pasos de la síntesis proteica). Este pppgpp por medio de una pirofosforilasa llamada Gpp lo convierte en ppgpp que a su 27
vez inhibe la síntesis de rrna y trna permitiendo únicamente la síntesis de aminoácidos. Cuando existen niveles aceptables de aminoácidos, el ppgpp por medio de una 3' fosforilasa llamada Spo T se convierte en el intermediario normal GDP. El mecanismo por el cual se activan unos mrna (los implicados en la síntesis de aminoácidos) y otros se inhiben no se conoce de momento. Este mecanismo, preciso y rápido, protege a la bacteria de un crecimiento deficiente. VI. REGULACION POR EL ESTADO O CARGA ENERGETICA VI. REGULACION POR CONTROL DE LA PERMEABILIDAD La membrana citoplasmática controla el paso de los nutrientes al interior de la célula, así como hacia el exterior de la célula. Existen cuatro mecanismos que regulan el transporte de nutrientes. 1.- Difusión pasiva Moléculas de H2O y algunos nutrientes liposolubles pasan libremente a través de la membrana hasta equilibrar concentraciones. No hay consumo de energía. Existe una ecuación empírica mediante la cual se puede determinar el estado energético de una célula: [ATP] + 1/2 [ADP] E = --------------------------------[ATP] + [ADP] + [AMP] Cuando el valor de E es alto indica que no hay biosíntesis; por el contrario, cuando el valor de E es bajo indica que hay biosíntesis puesto que se está consumiendo ATP. Se ha comprobado que una célula en fase logarítmica de crecimiento, metabolismo primario, presenta un valor de E = 0,5. Sin embargo, en fase estacionaria tiene un valor de E = 0,8. En fase estacionaria cambia drásticamente el metabolismo celular pasando al secundario. Los motivos por los cuales ocurren estos cambios no se conocen, aunque deben ser múltiples debido al gran número de reacciones metabólicas donde actúan el ATP, ADP y AMP. Difusión pasiva 2.- Difusión facilitada Los nutrientes se unen a una proteína transportadora para atravesar la membrana pasando de mayor a menor concentración. No hay consumo de energía. Difusión facilitada 3.- Transporte activo La mayor parte de los nutrientes son transportados mediante este mecanismo. Este proceso permite concentrar, en el interior celular, altos niveles de nutrientes necesarios para las actividades metabólicas. Hay consumo de energía. El ATP 28
distorsiona el sitio de unión a la proteína transportadora dificultando a la molécula la salida de la célula. Transporte activo 4.- Transporte por translocación de grupo En este tipo la proteína transportadora es un enzima que añade un grupo fosfato del ácido fosfoenolpirúvico al nutriente durante el transporte. Este nutriente alterado ya no es capaz de unirse a la proteína transportadora por lo que se acumula dentro de la célula. Translocación de grupo 29