ANEXOS Anexo 1 Solución Reguladora de Acetato 0.1 M, ph 4.0 y metanol al 2% (v/v). 1. Tomar 6.011mL de ácido acético y aforar a 1L de agua HPLC. 2. Pesar 13.609 g de acetato de sodio y aforar a 1L de agua HPLC. 3. Mezclar 820/180 ml de ácido acético y acetato respectivamente. 4. Ajustar el ph con los mismos amortiguadores, filtrar. 5. Desgasificar y poner al 2% de metanol (20mL de metanol para 980mL de buffer). Anexo 2 Solución Reguladora de Fosfato 0.1 M, ph 6.0 y metanol al 5% (v/v). 1. Pesar 12.12 g de fosfato de sodio monobásico y aforar a 500 ml con agua HPLC. 2. Pesar 14.2 de fosfato dibásico, disolver, aforar a 500 ml con agua HPLC. 3. Hacer una mezcla de 877 ml de monobásico y 123mL de dibásico. 4. Medir el ph y ajustarlo con las mismas soluciones reguladoras. 5. Filtrar, desgasificar y poner al 5% de metanol (50mL de metanol para 950 de buffer).
Anexo 3 Solución Reguladora de Fosfato 0.1M, ph 2.0. 1. Pesar 12.12 g de fosfato de potasio monobásico. 2. Diluir y disolver en 500 ml de agua HPLC. 3. Ajustar el ph a 2.0 con ácido clorhídrico concentrado. Solución Reguladora de Fosfato 0.1M, ph 3.5. 1. Pesar 12.12 g de fosfato de potasio monobásico. 2. Diluir y disolver en 500 ml de agua HPLC. 3. Ajustar el ph a 3.5 con ácido clorhídrico concentrado. Solución Reguladora de Fosfato 0.1M, ph 2.1 1. Pesar 12.12 g de fosfato de potasio monobásico. 2. Diluir y disolver en 500 ml de agua HPLC. 3. Ajustar el ph a 2.1 con ácido fosfórico concentrado.
Anexo 4 Diagrama de la Determinación de Homocisteína Total A 500 µl de plasma, añadirles 50 µl de TBP al 10% (en DMF) Reposar el plasma con TBP durante 30 min a 4 C Añadir 500 µl de TCA al 10%, con Na 2 EDTA 1 mm, frío y agitar en vórtex vigorosamente durante 10 segundos Centrifugar la solución a 1,000 g durante 5 min. Tomar una alícuota de 200 µl del sobrenadante y mezclarla vigorosamente con 400 µl de amortiguador de borato 0.25 M, ph 10.5 con Na 2 EDTA 4 mm, y 200 µl de SBD-F (El SBD-F debe ser preparado con borato 0.25 M, ph 9.5 a una concentración de 1 mg/ml) Incubar la mezcla en un baño de agua durante 60 min a 60 C Enfriar la solución en un baño de hielo Filtrar la solución en un filtro Millipore de 0.45 µm Tomar una alícuota de 20 µl e inyectarla al HPLC Araki y Sako, 1987.
Anexo 5 Preparación del Estándar de Homocisteína Tomar 200 µl de la homocisteína en solución de 1 µg/ml y mezclarla vigorosamente con 400 µl de amortiguador de borato 0.25 M, ph 10.5 con Na 2 EDTA 4 mm; 200 µl de SBD-F; y10 µl de de TBP al 10% v/v en DMF (El SBD-F debe ser preparado con borato 2.5 M, ph 9.5 a una concentración de 1 mg/ml) Incubar la mezcla en un baño de agua durante 60 min a 60 C Enfriar la solución en un baño de hielo Filtrar la solución en un filtro Millipore de 0.45 µm Tomar una alícuota de 20 µl e inyectarla al HPLC Araki y Sako, 1987.
Anexo 6 Recomendaciones Técnicas para la Preparación de la Muestra en la Determinación de Homocisteína Antes de empezar con la preparación de la muestra hay que poner a calentar el baño maría para asegurar que esté listo al momento de incubar. Asegurarse de que los amortiguadores estén desgasificados para tener una buena detección, ya que el oxígeno disuelto hace que la señal fluorescente disminuya. Preparar el estándar el día que vaya a ser utilizado; homogenizar muy bien al momento de hacer las diluciones. El SBD-F debe prepararse en el momento en el que se vaya a utilizar. Se pesa 0.001g en 1mL de amortiguador de borato 0.1 M, ph 9.5. La cantidad de TBP que se usará la determina el volumen de muestra del que se disponga; la proporción por cada 100 μl de suero son 10 μl de TBP (ejemplo 300μL de suero con 30 de TBP). Esta mezcla se incuba a 4 ºC por 30 min para asegurar la reducción de la homocisteína. El TCA debe de estar muy helado (para hacer más eficiente la precipitación proteica de la muestra) y hay que taparlo bien para que no se volatilice. Se agrega en una proporción 1:1 (ejemplo 300 μl de suero con 300 de TCA). Agitar vigorosamente y centrifugar a 1,000g por 5 mina 25 ºC. Del sobrenadante claro tomar 200 μl, o 100 μl si se quiere ahorrar reactivo, asegurándose de no llevar residuos del precipitado blanco (proteínas).
Los tubos (crioviales) en lo que se haga la reacción deben de estar perfectamente cubiertos para evitar que se exponga demasiado a la luz, ya que afecta ala emisión de la fluorescencia. Para preparar la muestra problema se toman los 100 μl del sobrenadante + 200 μl de amortiguador de borato 10.5M y 100 μl de SBD-F. Tapar rápidamente (para evitar la exposición a la luz) y agitar suavemente. Para preparar el estándar se toman 100 μl + 200 μl de amortiguador de borato10.5m + 100 μl de SBD-F y 5 μl de TBP. Tapar rápidamente (para evitar la exposición a la luz) y agitar suavemente. Después de la agitación de la muestra y el estándar hay que ponerlos rápidamente en el baño maría y vigilar que la temperatura este constantemente a 60ºC por 1 h, en este paso se da el proceso de derivatización de la muestra y solo con estas condiciones se puede establecer la unión del complejo SBD-homocisteína. Al culminar la hora de incubación se tiene que tener listo un baño de hielo para detener la reacción de las muestras, se enfría y se filtran a través de una membrana de 0.22 μm que se adapta a una jeringa. El filtrado se pasará a un tubo limpio que se cubre con aluminio. Para usar el filtro entre muestra y muestra hay que enjuagarlo perfectamente con amortiguador de borato 0.25M, ph 10.5. Poner la muestra en hielo para ser transportada.
Recomendaciones Técnicas para la Separación por HPLC en la Determinación de Homocisteína. Filtrar y desgasificar las soluciones reguladora antes de poner el acetonitrilo, ya que este es un solvente muy volátil y se alteraría la composición de la solución. Antes de poner las soluciones reguladoras que vayamos a utilizar el equipo de HPLC debe purgarse con agua filtrada y desgasificada para limpiar residuo que pudiera haber quedado (sales), ya que estos se pueden acumular y tapar las tuberías produciendo altas presiones dentro del sistema, además para eliminar cualquier burbuja que pueda estar presente en las tuberías que conducen a las soluciones reguladoras. Las válvulas del equipo se tienen que abrir para purgar, debido a que se utiliza un flujo de 10mL/min, para evitar que pase el agua por la columna y pueda dañar la fase estacionaria. Después de purgar se cierran las válvulas para que pase la solución a través de la columna, el flujo se va subiendo gradualmente y así evitamos lo cambios bruscos de presión de sistema. Ya que se alcanza el flujo deseado, se activa el programa que establece las condiciones cromatográficas que se utilizan (tiempos de equilibrio, tiempo de corrida, gradientes, etc.) y se enciende el detector poniendo atención en las longitudes de emisión y excitación requeridas. Al momento de hacer la corrida hay que prender la lámpara. Después de equilibrar a la fase estacionaria por una hora se lava exhaustivamente el inyector de la muestra con agua y después con el buffer de equilibrio. Así mismo, se lava la jeringa que ayuda a introducir la muestra.