Departamento de Inmunobiología Facultad de Medicina Universidad de la República UTI "Biología Tisular" 2009 Práctico Diagnóstico de Toxoplasmosis por técnicas inmunológicas Distribución de los grupos: La actividad práctica se realizará en la semana del lunes 11/05 al jueves 14/05 en un horario diferente al del curso teórico, viniendo los del primer turno de mañana, los de segundo turno luego del mediodía y los del tercer turno a partir de las 16:30, en las siguiente forma, de acuerdo a los subgrupos: Horario Lunes 11 Martes 12 Miércoles 13 Jueves 14 9-12 A 1 y 2 A 3 y 4 A 5 y 6 A 7 y 8 13-16 B 1 y 2 B 3 y 4 B 5 y 6 B 7 y 8 16:30-19:30 C 1 C 2 C 3 C 4
TOXOPLASMOSIS La toxoplasmosis es una zoonosis ampliamente distribuida en el mundo, que afecta a la mayoría de los animales de sangre caliente incluyendo al hombre, siendo el gato y otros felinos los hospederos definitivos y completos por realizarse únicamente en ellos la reproducción tanto sexual como asexual. Se caracteriza por ser una infección común, cosmopolita y ubicua que solo en raras ocasiones se manifiesta como una enfermedad clínica. Es causada por Toxoplasma gondii, parásito intracelular obligado que presenta un ciclo de vida complejo. Ciclo de vida de T. gondii Este parásito presenta varias formas evolutivas. Los taquizoitos, es decir, los trofozoitos de T. gondii, los cuales se pueden encontrar en forma de
pseudoquistes o formas libres con división por endogenia; los bradizoitos, formas presentes en el interior de los quistes con división más lenta; y los ooquistes, forma de eliminación en gatos. El hombre puede infectarse directamente al ingerir ooquistes de tierra contaminada con heces de gato, indirectamente al ingerir carne mal cocida que contenga bradizoitos o taquizoitos y congénitamente cuando una mujer embarazada es infectada por primera vez. También existen otras vías de transmisión como ser el caso de transplantes y donación de sangre. Las lesiones causadas por la infección con T. gondii están asociadas con la destrucción de células por el avance de los taquizoitos de célula en célula, dando origen a focos necróticos, en los diferentes tejidos. En general la infección es asintomática u oligosintomática, benigna y autorresolutiva en la mayoría de los huéspedes definitivos e intermediarios inmunocompetentes. La enfermedad puede llegar a ser fatal en individuos inmunodeprimidos (HIV, transplantes) y provocar encefalitis, meningoencefalitis, procesos en masa del SNC, neumonitis y miocarditis, entre otros padecimientos. Cuando ocurre en la mujer embarazada existe el riesgo de transmisión al feto con diferentes consecuencias. En estudios realizados en Estados Unidos, se demostró que la forma más común de contagio a adultos se realiza principalmente por el consumo de carne mal cocida. De todos modos, un estudio en Centro América demostró que más del 50% de niños se encuentran infectados a la edad de 10 años por la ingestión de ooquistes de suelos contaminados con heces de gato. La prevalencia en nuestro país es de un 50 a 60 % de la población. Cabe destacar que un tercio de la población mundial se encuentra infectada, teniendo algunos países más del 80% de la población comprometida. Toxoplasmosis congénita: T. gondii cruza la placenta en madres que sufren una infección primaria durante el embarazo, pudiendo causar una infección diseminada en el feto con consecuencias más o menos graves dependiendo del periodo de gestación (producción de abortos y partos prematuros, infecciones perinatales con microcefalia-hidrocefalia, lesiones cerebrales, retardo mental o muerte fetal). Por dicho motivo es rutina obstétrica realizar un estudio de toxoplasmosis en el embarazo. Las mujeres infectadas antes de la concepción no suelen transmitir la toxoplasmosis al feto. Cuanto más precoz ocurra la infección durante el embarazo, mayor el riesgo de severidad de la afección fetal. El riesgo de infección transplacentaria aumenta desde el 15% hasta el 30 y el 60% cuando la madre se contagia durante el primero, el segundo o el tercer trimestre del embarazo, respectivamente.
DIAGNÓSTICO DE LA TOXOPLASMOSIS Los procedimientos más comúnmente utilizados para el diagnóstico de la toxoplasmosis incluyen métodos directos, los cuales evidencian la presencia del parásito en muestras de fluidos o tejidos, principalmente durante la fase aguda de la infección. Estos son la PCR, los cultivos celulares, la inoculación en ratón, coloraciones de frotis o cortes, así como también el xenodiagnóstico, utilizado en etapas experimentales. Los métodos indirectos que evidencian la presencia del parásito detectando la presencia de anticuerpos específicos contra el mismo, involucrando pruebas serológicas. PRUEBAS SEROLÓGICAS: Dentro de las pruebas serológicas se incluyen: Sabin-Feldman, Hemoaglutinación directa e indirecta, Aglutinación en látex, ensayo inmunoenzimático (ELISA), fijación de complemento, inmunofluorescencia indirecta (IFI) y radioinmunoensayo directo e indirecto. Las diferentes técnicas serológicas difieren en el tipo de antígeno que emplean (parásitos enteros, porciones solubles citoplasmáticas o de membrana, productos de secreción-excreción), y presentan diferente sensibilidad, especificidad, reproducibilidad, valor predictivo y valor clínico (también diferente según el isotipo de Ig considerado). La reacción de Sabín-Feldman tiene alta sensibilidad y especificidad pero requiere una infraestructura compleja. La IFI presenta igual sensibilidad y especificidad que la anterior pero requiere equipo de microscopía adecuado y experiencia del operador. Además permite diferenciar anticuerpos IgM e IgG. La hemoaglutinación indirecta (HAI) es sensible y específica para laboratorios de rutina pero para diagnóstico individual debe complementarse con otras técnicas, con títulos similares a los de IFI en la población inmune. ELISA y aglutinación en látex: ver más abajo. En el curso de la infección por T. gondii Los títulos de IgM aparecen tempranamente después de la infección y decrecen rápidamente por lo que se utiliza para la detección de la enfermedad en su estado agudo. En cambio, los títulos de IgG permanecen bajos durante las primeras semanas y posteriormente se incrementan significativamente.
Para estudiar si una infección es reciente o es crónica se estudian: - IgM versus IgG - Avidez de IgG En algunos individuos, el título de IgM se mantiene a lo largo de la infección y de allí que se considere un mejor marcador de etapas aguda/crónica, al índice de avidez de las IgG, (ver más abajo). El diagnóstico de la enfermedad depende de si se trata de un paciente inmunocompetente o inmunodeprimido. Para el primer caso, la toxoplasmosis ganglionar implica características clínicas observables más una serología con un perfil de agudo. Para el diagnóstico de toxoplasmosis ocular, implica un examen oftalmológico, con una serología y PCR positivas junto con la presencia de IgA en humor acuoso. Para el caso de inmunodeprimidos, se analiza la presencia de toxoplasmosis cerebral, junto con imagenología y métodos directos de análisis en sangre y líquido cefalorraquídeo. Para el caso de diagnóstico de infección aguda en la gestante, implica el análisis de seroconversión, presencia de IgM o IgA específica, junto con un aumento de IgG específica de baja avidez. Para el diagnóstico de infección fetal, se analizan signos ecográficos junto con análisis de líquido de amniocentesis en inoculaciones en ratones, PCR y cultivo celular del mismo. Para el caso del diagnóstico de infección en el recién nacido, se aplican métodos directos en sangre de placenta y cordón umbilical, junto con la búsqueda de anticuerpos específicos IgM e IgA.
ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) El principio general de esta técnica se basa en la unión del antígeno a un anticuerpo marcado con una enzima, interacción que ocurre dentro de la placa de polivinilo. La transformación del sustrato por la enzima es proporcional a la concentración de anticuerpo o antígeno desconocido presente en la solución problema. De esta manera, los anticuerpos específicos pueden ser estimados cuantitativamente y en poco tiempo. Ag + Ac AgAc Cuanto mayor sea la afinidad del Ac por el Ag, mayor sensibilidad tendrá el ensayo. Tipos de ELISA: ELISA directo: cuando los anticuerpos conjugados a la enzima son dirigidos directamente contra el antígeno unido a la placa. ELISA indirecto: cuando los anticuerpos conjugados son dirigidos contra inmunoglobulinas humanas o de animales que sufren la enfermedad en cuestión. ELISA sándwich (doble determinante): Cuando se utilizan dos anticuerpos específicos que reconocen un mismo antígeno, uno de ellos marcado radiactivamente o unido a una enzima. Este tipo de ensayo es particularmente útil para la captura de antígenos circulantes (solubles). Este ensayo se inicia con la adsorción de las proteínas (antígeno) a una superficie inerte, generalmente una placa de polivinilo de 96 pocillos. Luego se agrega una solución de una proteína no específica, generalmente leche descremada, gelatina o
seroalbúmina bovina, para bloquear la superficie evitando que otras proteínas se unan a ella. En un tercer paso se añade el suero problema que contiene los anticuerpos que reconocen al antígeno de manera específica (en el caso que la muestra sea positiva). Seguido a ello se agrega un anticuerpo secundario que reconocerá al anticuerpo primario unido al antígeno. Este anticuerpo secundario está conjugado a una enzima que cataliza una reacción colorimétrica. Finalmente se añade el sustrato de la enzima y se registra la densidad óptica. Ventajas: - Método altamente sensible y específico - cuantitativo - permite diferenciar IgM, IgG, y la medida del índice de avidez de los anticuerpos - sencillo, rápido, automatizable AGLUTINACION EN LATEX El antígeno parasitario se halla adsorbido sobre partículas de látex, que se aglutinan en presencia de anticuerpos específicos. Ventajas: 1. Es un método sencillo, rápido y barato (no requiere instrumental) 2. Utiliza poca cantidad de muestra, sin tratamiento especial 3. Muy utilizado en medicina para el diagnóstico masivo Limitaciones: 1. Sensibilidad media (comparado con ELISA) 2. Es un método semi-cuantitativo 3. Lectura puede ser subjetiva (importante la interpretación de resultados por la misma persona)
Detección de IgG e IgM+IgG: reacciones de aglutinación con y sin 2-mercaptoetanol En muchos casos es útil conocer si el paciente posee anticuerpos de tipo IgM o IgG mediante una técnica de aglutinación porque eso puede facilitar el seguimiento del paciente o determinar un tratamiento. Para ello, se ha desarrollado la técnica de aglutinación en ausencia y en presencia de 2-ME. Cuando se realiza la titulación del suero del paciente por aglutinación en ausencia de 2-ME y se informa un título, en realidad se está informando una actividad aglutinante que es la suma de la actividad aglutinante de la IgM y de la IgG. Si se realiza la técnica en presencia de 2- mercaptoetanol, este produce una reducción suave / parcial de las IgM. Como la IgM monomérica resultante no es aglutinante, el título que se obtiene al realizar la técnica de aglutinación en presencia de 2-ME corresponderá exclusivamente a la actividad aglutinante de la IgG. De este modo, la realización de la aglutinación en presencia y ausencia de 2-ME permitirá determinar la presencia de IgG e IgM contra el Ag sensibilizante. En el caso de toxoplasmosis es importante determinar la presencia de IgM porque es indicio de infección activa. La caída en el título del suero por aglutinación en ausencia vs. presencia de 2-ME es indicio de la presencia de IgM específica para el parásito. OBJETIVOS de la PRÁCTICA: Primera aproximación a técnicas de uso rutinario en un laboratorio de inmunología: ELISA y aglutinación sobre partículas de látex Marco Teórico: Diagnóstico de la Toxoplasmosis Discusión de la aplicación y comparación de las técnicas para el diagnóstico de Toxoplasma gondii.
TÉCNICA DE ELISA: 1) Sensibilización: Sembrar 100 ul/pocillo de una solución de 5 ug/ml en PBS. Incubar a Temperatura Ambiente (TA) toda la noche. 2) 2 lavados con PBS-Tween 0,1% 3) Bloqueo: Sembrar 200 ul de PBS gelatina (1%) por pocillo, incubar durante 1 hora a 37 ºC 4) 3 lavados con PBS-Tween 0,1% 5) Incubación con los sueros: 8 diluciones seriadas al medio partiendo de una dilución propuesta de los sueros problema 1, 2 y 3 en PTG (0.5% gelatina-pbs + 0.1% Tween) ver diagrama de la placa. Sembrar 100 ul/ pocillo e incubar 45 min a 37 ºC. 6) 3 lavados con PBS-Tween 0,1% 7) Incubación con el suero policlonal anti-ig de conejo producido en cabra y conjugado a peroxidasa - dilución 1/1000 en PTG, sembrar 100 µl por pocillo e incubar 45 min a 37 ºC 8) 5 lavados con PBS-Tween 0,1% 9) Revelado: Sembrar 100ul/pocillo de la solución de revelado, e incubar durante 30 min a TA en la oscuridad. Solución de revelado: 3mg de ABTS (ácido 2'2-azino-bis-[3-etilbenzotiazol-6- sulfónico) + 10ml de buffer citrato 0.1 M ph 5 + 8.3ul de H 2 O 2 al 24%. Medir la densidad óptica a 405 nm. NOTA: los pasos 1 al 4 fueron realizados previo al práctico.
Suero Suero Suero Suero Suero Suero Suero Suero Suero Pb 1 Pb 2 Pb3 Pb 1 Pb2 Pb3 Pb1 Pb2 Pb3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A BCO BCO BCO B s/ag s/ag s/ag C D E F G H s/ suero s/ suero s/ suero MESA 1 MESA 2 MESA 3 Graficar DO vs. Dilución de anticuerpos (título) TÉCNICA AGLUTINACIÓN EN LÁTEX: Preparación de las partículas de látex: Unidad de Biotecnología, Polo Tecnológico de la Facultad de Química. El antígeno de T. gondii fue adsorbido a las partículas de látex y luego se saturó con seroalbúmina bovina 1. Sueros: se realizan 4 diluciones seriadas al medio en PBS partiendo de la muestra provista por el docente. Las diluciones se hacen sobre la placa oscura. El volumen final de cada dilución es de 50 μl. Se utiliza PBS como blanco. 2. Mezclar con 35 μl de látex en cada una de las diluciones, comenzando de la más diluida a la más concentrada, incluyendo el blanco 3. Agitar durante 5 minutos
4. El título se define como el inverso de la última dilución en que se observa aglutinación. Llenar la siguiente tabla, especificando la ausencia o presencia de aglutinación para cada suero y cada dilución, y determinar el título de anticuerpos anti-t. gondii para cada caso. Suero problema 1 Suero problema 2 Suero problema 3 Dilución de partida Dilución 1 Dilución 2 Dilución 3 Título Comparar la sensibilidad de las técnicas, teniendo en cuenta las diluciones de partida de cada muestra.
Anexo Técnicas inmunológicas aplicadas al diagnóstico de enfermedades Método de Sabin-Feldman Este método consiste en analizar la pérdida en la capacidad de tinción de los taquizoitos libres con azul de metileno básico, en presencia de anticuerpos específicos contra ellos y un factor accesorio, presente en el suero normal de todas las personas. El título del suero está dado por la máxima dilución en la que permanecen sin colorearse más del 50% de los toxoplasmas. Inmunofluorescencia Cuando se marca el propio anticuerpo o el anticuerpo antiinmunogloblulina utilizado para detectarlo con un pigmento fluorescente, la técnica se conoce como inmunofluorescencia. El pigmento fluorescente puede unirse de forma covalente y directa al anticuerpo específico pero en general, el anticuerpo unido se detecta mediante una inmunoglobulina fluorescente. El primer caso se conoce como Inmunofluorescencia directa mientras que el segundo, Inmunofluorescencia indirecta. Los pigmentos escogidos en inmunofluorescencia se excitan mediante luz de una longitud de onda y emiten en una longitud de onda distinta en el espectro visible. Los pigmentos más comunes son la fluoresceína y el Texas Red. Para el caso de diagnóstico de toxoplasmosis, las ventajas que presenta esta técnica con respecto a Sabin-Feldman es su sencillez, no se requieren toxoplasmas vivos, no se necesita factor accesorio y se pueden discriminar IgG de IgM. Inmunohistoquímica Un método alternativo a la inmunofluorescencia para detectar antígenos en secciones de tejidos es la inmunohistoquímica, en la cual el anticuerpo específico se conjuga químicamente con una enzima. Esta convierte el sustrato incoloro en un producto coloreado in situ. El anticuerpo se une de forma estable a su antígeno, lo cual permite la eliminación del anticuerpo no unido mediante lavados. La deposición localizada del producto coloreado donde el anticuerpo se ha unido puede observarse con un microscopio óptico. Este método es un análogo del ELISA y generalmente utiliza las mismas enzimas conjugadas. La diferencia principal se encuentra en la detección, ya que los productos coloreados son insolubles y precipitan en el lugar donde se forman.
Western blot y Dot blot Es una técnica inmunoenzimática que se utiliza para la detección de proteínas de una muestra. El método consta de distintas fases: - separación mediante electroforesis en gel de poliacrilamida - transferencia de las proteínas mediante aplicación de un campo eléctrico a una membrana de nitrocelulosa - saturación de todos los lugares de unión de proteínas de la membrana no ocupados para evitar la unión no específica de anticuerpos - adición de un anticuerpo primario contra las proteínas que se quieren detectar - adición de un anticuerpo secundario conjugado con una enzima, que reconoce al anticuerpo primario - revelado Hay otros métodos de transferir o aplicar proteínas sobre la membrana, aparte del electroblotting. El más sencillo es aplicarlas directamente en forma de una pequeña gota de una solución concentrada sobre la membrana. La absorción de la gota provoca la adhesión de la proteína a la membrana, quedando en forma de una mancha o 'dot' (es el caso del dot blot). El resto del procedimiento es el mismo que el descrito para el western blot. Citometría de flujo La citometría de flujo es un método analítico que permite la medición rápida de ciertas características físicas y químicas de células o partículas suspendidas en líquido que producen una señal de forma individual al interferir con una fuente de luz. Una de las características analíticas más importantes de los citómetros de flujo es su capacidad de medir múltiples parámetros celulares, como el tamaño, forma y complejidad y, por supuesto, cualquier componente celular o función que pueda ser marcada con un fluorocromo. En este sentido, si previamente a su análisis se coloca a las células en presencia de anticuerpos monoclonales marcados con moléculas fluorescentes, se pueden evaluar que células poseen los antígenos complementarios a los anticuerpos monoclonales usados. Las aplicaciones más relevantes de la citometría de flujo en la práctica médica se relacionan con la hematología e inmunología clínicas, midiendo parámetros como número y clasificación de células sanguíneas. Esta técnica es empleada también en el conteo de subpoblaciones de linfocitos en pacientes con el virus de la inmunodeficiencia humana, así como la caracterización de leucemias agudas y síndromes linfoproliferativos crónicos, entre otros padecimientos.