GUIA DOCENTE DE LA ASIGNATURA Transporte iónico en las membranas celulares: Homeostasis e imagen del calcio intracelular MÓDULO MATERIA ASIGNATURA CURSO SEMESTRE CRÉDITOS CARÁCTER Docencia MT 34 PROFESOR(ES) Transporte iónico en las membranas celulares: Homeostasis e imagen del calcio intracelular 1 2 3 optativo DIRECCIÓN COMPLETA DE CONTACTO PARA TUTORÍAS (Dirección postal, teléfono, correo electrónico, etc.) agasoler@ugr.es; juan.navarro@uclm.es lydia.jimenez@uclm.es Agatángelo Soler Díaz Juan de Dios Navarrro Lydia Jiménez Díaz MÁSTER EN EL QUE SE IMPARTE Biotecnología HORARIO DE TUTORÍAS Constante OTROS MÁSTERES A LOS QUE SE PODRÍA OFERTAR : Neurociencias PRERREQUISITOS Y/O RECOMENDACIONES (si procede) No BREVE DESCRIPCIÓN DE CONTENIDOS (SEGÚN MEMORIA DE VERIFICACIÓN DEL MÁSTER) Denominación: Transporte iónico en las membranas celulares: Homeostasis e imagen del calcio intracelular. Estudio de canales iónicos con técnicas de Electrofisiología y Biología Molecular. Número de créditos europeos (ECTS): 3 Carácter (obligatorio/optativo): Optativo Unidad Temporal: desde 14/04/11 hasta 01/04/11, por las tardes, entre 3 y 3,30 horas de duración Competencias: Comprensión y aprendizaje práctico de técnicas de estudio de canales, y transportadores primarios y secundarios. Homeostasis del calcio intracelular y técnicas de imagen para observar calcio citosólico in vivo en tiempo real. Requisitos previos (en su caso): Ninguno Página 1
Actividades formativas y su relación con las competencias: Se contemplan teoría, prácticas y trabajo de los alumnos Acciones de coordinación (en su caso): Se debaten los contenidos de de las charlas y la programación de las prácticas Sistemas de evaluación y calificación: Sistema de evaluación continua. Valoración de la asistencia y participación activa en las clases teóricas y prácticas. Capacidad de relacionar conceptos de la asignatura. Corrección 1er ATP 1er ATP en la realización de actividades practicas. Imágenes de Ca2+ citosólico (centro) y de NO, en verde mitocondrias Breve descripción de los contenidos: 1) Las células están compartimentadas. 2) Los compartimentos líquidos celulares, composición electroquímica, coloidosmótica y en ocasiones osmótica. Gradientes electroquímicos, coloidosmóticos y osmóticos que Gradientes de sodio, potasio, calcio y ph y de los mecanismos que los generan, mantienen y modifican. Generación del potencial eléctrico de la membrana en células excitables y no excitables La regulación del volumen celular frente a cambios en la osmolaridad del medio. 3). Introducción a la termodinámica en los procesos de transporte. Energía libre y espontaneidad de los procesos. Difusión de moléculas pequeñas a través de bicapas fosfolipídicas. Mecanismos que generan gradientes (transporte activo primario). Mecanismos que disipan los gradientes principales para crear otros (transporte acoplado activo secundario). Mecanismos que disipan gradientes para generar corriente (canales). Consideraciones especiales cuando el transporte acoplado es electrogénico (El intercambiador 3Na + /1Ca 2+ del sarcolema miocárdico). Familias de proteínas que generan gradientes consumiendo ATP. Árbol filogenético: 1) ATPasas de clase P 1a). Bombas de protones de clase P (en Procariotas y Eucariotas inferiores, y en células gástricas de mamífero). 2a). Bomba Na+/K+ de mamíferos: estructura, subtipos, localizaciones celulares. Cinética y métodos de estudio. La inhibición por digitálicos en la insuficiencia cardíaca y en la génesis de la hipertensión arterial. Rol fisiológico en el transporte transepitelial. El caso de riñón. Expresión y funciones en animales acuáticos de aguas dulces y saladas. 3a). Bombas de Ca2+ : La ATPasa de la membrana plasmática de las células eucariotas. Estructura y funciones. Activación por calmodulina. Cinética y métodos de estudio. 3b).Bombas de Ca2+ : La ATPasa de la membrana del retículo sarcoplásmico de las células musculares (SERCA). Estructura, funciones. Rol en las contracciones de músculo cardíaco, esquelético y liso (vascular y visceral). Regulación (Fosfolanbam). 4.2). Familias de proteinas que generan gradientes de protones consumiendo ATP: 1) ATPasas de clases F y V: 1a).Clase F. Estructura y función. Membranas mitocondrial interna y tilacoide del cloroplasto. Página 2
1b).Clase V. Estructura y función. Membranas de vacuolas en vegetales, Membranas de lisosomas y endosomas en células animales (Estudio de la regulación del ph intracelular en un parásito con estadios intracelulares y extracelulares: Trypanosoma cruzi). Membrana plasmática de células animales secretoras de ácido (Los osteoclastos y el túbulo renal). 2) ATPasas de clase ABC: Centro activo en casette. Retículo endoplásmico y presentación de antigenos de superficie). 4.3. Las flip-flopasas y el mantenimiento de la asimetría en la composición fosfolipídica interna y externa de la membrana plasmática. (Casos de la agregación plaquetaria y la apoptosis). 5. Superfamilias de simportadores y antiportadores: Propiedades generales. Transportadores acoplados de Na+ y glucosa, Transportadores acoplados de Na+, K+ y Cl- (NKCC1, NKCC2, NCC y KCC). Transportadores acoplados de Na+ y Ca2+. Transportadores acoplados de Na+ y Mg2+. Transportadores acoplados de Na+ y H+. Localización y roles fisiológicos. 6. Introducción a las familias, y clases de canales iónicos y de agua (Acuaporinas). Propiedades generales. Estructura. Examen de algunos casos relevantes. Métodos de estudio. Empalamiento con electrodos y pinzamiento de voltaje. Tipos de Patchclamp para registro de un único canal. 7. Metodología del estudio. Permeabilización de membranas externas. Modificación de contenidos intracelulares por ionóforos, electroporación y scratching. Metodología de los estudios cinéticos, Distinción entre transportadores por sus diferencias cinéticas. 8. Uso de agentes farmacológicos para la identificación de transportadores. Utilidad. Mitos y realidades (estudio de casos relevantes). 9. Medida de flujos mediante Espectrometrías de Absorción y de Emisión Atómicas. Métodos y requerimientos (Su utilidad en el diseño de experimentos zero-trans). Medida de flujos mediante radionúclidos (Su utilidad en el diseño de experimentos cis-trans). 10. Introducción al estudio de cambios dinámicos de concentraciones iónicas en tiempo real mediante sondas fluorescentes. Carga y desesterificación con Fura-2 AM, Indo-2 AM y Fluo AM. Metodología y detección de fracasos. Calibraciones y establecimiento de la curva patrón fluorescencia/concentración. Medida de Ca2+ citosólico. Medida de ph intracelular. Medida de potencial de membrana. 11. Imagen de calcio intracelular en células aisladas. Protocolo de carga con Fura-2 AM en células cultivadas. Desarrollo de una curva de concentración respuesta para un agonista y cálculo de la EC50 PROGRAMA DE PRÁCTICAS: 1. Determinación de calcio citosólico mediante Fura-2 AM en sinaptosomas de cerebro completo de ratón en lector de placas de fluorescencia. Apertura de canales VOCC-L mediante depolarización con K + 60 mm. (En colaboración con Luis Gerardo Gónzález Contreras, Dpto. Farmacología, Fac. Medicina) 2. Análisis de imagen de calcio citosólico mediante Fura-2 AM en células endoteliales cultivadas adheridas mediante microscopía de fluorescencia en tiempo real. Apertura de canales IP3 sensitivos en retículo endotelial. Cálculo de ratio en regiones de interés. Estudio de canales iónicos con técnicas de Electrofisiología y Biología Molecular. PROFESORES: Dr. Juan de Dios Navarro López / Dr. Lydia Jiménez Díaz OBJETIVOS: El objetivo de esta parte del curso es formar al alumno en las técnicas empleadas para el estudio de las propiedades bioeléctricas de las células excitables en cultivo o en rodajas de cerebro, con especial énfasis en el uso de la técnica de registro electrofisiológico de patch-clamp y registro intracelular. Además se incluirán fundamentos de expresión génica en cultivos celulares y rodajas de sistema nervioso. Página 3
(Pipetas registrando en una neurona con proteínas fluorescentes verde y cían, Pipeta en rodaja de hipocampo. Registro de los potenciales de acción tras la estimulación eléctrica de la neurona) PROGRAMA DE LA ACTIVIDAD: Se estudiará la metodología para levar a cabo un registro intracelular mediante la utilización de pipetas de cristal de menos de 1 mm de diámetro, las cuales son estiradas hasta obtener puntas extremadamente finas. Estas pipetas se rellenan con una solución similar al líquido intracelular y se acoplan a un alambre de cloruro de plata conectado al amplificador para registrar las señales bioeléctricas. En la realización de un registro intracelular, se debe insertar la punta de la pipeta dentro de la célula, de modo que se pueda medir la diferencia de potencial entre el interior y el exterior celular. En 1963, Sir Alan Hodgkin y Sir Andrew Huxley obtuvieron el Premio Nobel de Fisiología y Medicina por su contribución a la comprensión de los mecanismos subyacentes a la generación de potenciales de acción en las neuronas mediante el uso de este tipo de técnicas. Además se analizará la combinación de este tipo de técnicas con la biología molecular, especialmente con el estudio de los patrones de expresión génica de receptores en tejido nervioso. Analizaremos las distintas partes que componen un sistema de registro electrofisiológico. Propiedades eléctricas de membrana. Conceptos relacionados con potencial de reposo en la membrana de las células excitables, gradientes electroquímicos, gradientes de concentración y potencial de equilibrio de los distintos iones (mediante un simulador informático: http://www.nernstgoldman.physiology.arizona.edu/ que permite modificar las concentraciones en el medio extra e intracelular, y permeabilidades de los distintos iones -sodio, potasio y cloro- y muestra el valor que alcanzaría el potencial de equilibrio para un ión y el potencial de membrana calculados mediante las ecuaciones de Nernst y Goldman). Se usará el programa informático Neurosim for Windows para estudiar las bases iónicas del potencial de acción y de la neurotransmisión así como el efecto de distintos fármacos y toxinas. Fundamentos de las distintas configuraciones de registro electrofisiológico en la técnica de patch-clamp. Obtención del contenido celular/neuronal mediante pipetas de patch-clamp. Expresión génica en cultivos celulares y rodajas de sistema nervioso. Fundamentos y metodología específica para el desarrollo de RT-PCR (convencional y cuantitativa) en célula única. COMPETENCIAS GENERALES Y ESPECÍFICAS DEL MÓDULO OBJETIVOS (EXPRESADOS COMO RESULTADOS ESPERABLES DE LA ENSEÑANZA) Página 4
TEMARIO DETALLADO DE LA ASIGNATURA BIBLIOGRAFÍA : Artículos y textos especializados ENLACES RECOMENDADOS METODOLOGÍA DOCENTE EVALUACIÓN (INSTRUMENTOS DE EVALUACIÓN, CRITERIOS DE EVALUACIÓN Y PORCENTAJE SOBRE LA CALIFICACIÓN FINAL, ETC.) CRITERIOS DE EVALUACIÓN: Sistema de evaluación continua. Valoración de la asistencia y participación activa en las clases teóricas y prácticas. Capacidad de relacionar conceptos de la asignatura. Corrección en la realización de actividades practicas. Asistencia diaria (50%) Resúmen final como trabajo en texto y powerpoint (50%) 3 ECTS (75h) Teoría 55 h Prácticas 20 h Presencialidad 40 % INFORMACIÓN ADICIONAL Página 5