MÓDULO MATERIA ASIGNATURA CURSO SEMESTRE CRÉDITOS CARÁCTER BREVE DESCRIPCIÓN DE CONTENIDOS (SEGÚN MEMORIA DE VERIFICACIÓN DEL MÁSTER)

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1 GUIA DOCENTE DE LA ASIGNATURA Transporte iónico en las membranas celulares: Homeostasis e imagen del calcio intracelular MÓDULO MATERIA ASIGNATURA CURSO SEMESTRE CRÉDITOS CARÁCTER Docencia MT 34 PROFESOR(ES) Transporte iónico en las membranas celulares: Homeostasis e imagen del calcio intracelular optativo DIRECCIÓN COMPLETA DE CONTACTO PARA TUTORÍAS (Dirección postal, teléfono, correo electrónico, etc.) HORARIO DE TUTORÍAS MÁSTER EN EL QUE SE IMPARTE Biotecnología OTROS MÁSTERES A LOS QUE SE PODRÍA OFERTAR : Neurociencias PRERREQUISITOS Y/O RECOMENDACIONES (si procede) No BREVE DESCRIPCIÓN DE CONTENIDOS (SEGÚN MEMORIA DE VERIFICACIÓN DEL MÁSTER) Las células compartimentalizadas. Los compartimentos líquidos celulares, composición electroquímica, coloidosmótica y osmótica. Gradientes electroquímicos,coloidosmóticos y osmóticos. Gradientes de sodio, potasio, calcio y ph. Generación del potencial eléctrico de membrana de células excitables y no excitables (la neurona y el glóbulo rojo). Regulación del volumen celular frente cambios en la osmolaridad del medio. Introducción a la termodinámica en procesos de transporte. Energia libre y espontaneidad de los procesos. Difusión de moléculas pequeñas. Familias de proteínas que generan gradientes. Flip-flopasas y el mantenimiento de la asimetría en la composición fosfolipídica de la membrana. Superfamilias de simportadores y antiportadores. Familias de canales iónicos y de agua. Permeabilización de membranas externas. Uso de agentes farmacológicos par al identificación de transportadores. Medidas de flujo. Introducción al estudio de cambios dinámicos de iones a tiempo real. Imagen de Calcio intracelular en células aisladas. Página 1

2 Comprensión y aprendizaje práctico de técnicas de estudio de canales y transportadores primarios y secundarios. Homeostasis del calcio intracelular y técnicas de imagen para observar calcio citosólico in vivo en tiempo real. COMPETENCIAS GENERALES Y ESPECÍFICAS DEL MÓDULO Competencias generales CB6 - Poseer y comprender conocimientos que aporten una base u oportunidad de ser originales en el desarrollo y/o aplicación de ideas, a menudo en un contexto de investigación CB7 - Que los estudiantes sepan aplicar los conocimientos adquiridos y su capacidad de resolución de problemas en entornos nuevos o poco conocidos dentro de contextos más amplios (o multidisciplinares) relacionados con su área de estudio CB8 - Que los estudiantes sean capaces de integrar conocimientos y enfrentarse a la complejidad de formular juicios a partir de una información que, siendo incompleta o limitada, incluya reflexiones sobre las responsabilidades sociales y éticas vinculadas a la aplicación de sus conocimientos y juicios CB9 - Que los estudiantes sepan comunicar sus conclusiones y los conocimientos y razones últimas que las sustentan a públicos especializados y no especializados de un modo claro y sin ambigüedades CB10 - Que los estudiantes posean las habilidades de aprendizaje que les permitan continuar estudiando de un modo que habrá de ser en gran medida autodirigido o autónomo. Competencias específicas CE1 - Identificar, diseñar, implementar e interpretar métodos Biotecnológicos; CE2 - Organizar y diseñar actividades en el campo de la experimentación en Biotecnología; CE3 - Manejar las tecnologías de la información para la adquisición, procesamiento y difusión de resultados en investigación; CE4 - Emitir juicios en función de criterios y razonamiento crítico y aprender a reconocer los parámetros de calidad en investigación; CE6 - Trabajar en equipo y abordar los problemas de una forma interdisciplinar CE7 - Elaborar adecuadamente y con cierta originalidad composiciones escritas, proyectos de trabajo o artículos científicos en el área de la Biotecnología. CE9 - Reconocer y adaptarse a la diversidad y multiculturalidad. CE43 - Comprender y aprender técnicas de estudio de canales, y transportadores primarios y secundarios y obtener una visión global de la homeostasis del calcio intracelular y de las técnicas de imagen para su seguimiento in vivo en tiempo real. OBJETIVOS (EXPRESADOS COMO RESULTADOS ESPERABLES DE LA ENSEÑANZA) El objetivo del curso es formar al alumno en las técnicas empleadas para el estudio de las propiedades bioeléctricas de las células excitables en cultivo o en rodajas de cerebro, con especial énfasis en el uso de la técnica de registro electrofisiológico de patch-clamp y registro intracelular. Además se incluirán fundamentos de expresión génica en cultivos celulares y rodajas de sistema nervioso. TEMARIO DETALLADO DE LA ASIGNATURA Página 2

3 1. Las células compartimentadas. 2. Los compartimentos líquidos celulares, composición electroquímica, coloidosmótica y en ocasiones osmótica. Gradientes electroquímicos, coloidosmóticos y osmóticos. Gradientes de sodio, potasio, calcio y ph. Generación del potencial eléctrico de la membrana en células excitables y no excitables (la neurona y el glóbulo rojo). La regulación del volumen celular frente a cambios en la osmolaridad del medio. 3. Introducción a la termodinámica en los procesos de transporte. Energía libre y espontaneidad de los procesos. Difusión de moléculas pequeñas a través de bicapas fosfolipídicas. Mecanismos que generan gradientes (transporte activo primario). Mecanismos que disipan los gradientes principales para crear otros (transporte acoplado activo secundario). Mecanismos que disipan gradientes para generar corriente (canales). Consideraciones especiales cuando el transporte acoplado es electrogénico (El intercambiador 3 Na +1 /1 Ca 2+ del sarcolema miocárdico). Familias de proteínas que generan gradientes consumiendo ATP. Árbol filogenético: 1) ATPasas de clase P 1a). Bombas de protones de clase P (en Procariotas y Eucariotas inferiores y en células gástricas de mamífero). 2a). Bomba Na+/K+ de mamíferos: estructura, subtipos, localizaciones celulares. Cinética y métodos de estudio. La inhibición por digitálicos en la insuficiencia cardíaca y en la génesis de la hipertensión arterial. Rol fisiológico en el transporte transepitelial. El caso de riñón. Expresión y funciones en animales acuáticos de aguas dulces y saladas. 3a). Bombas de Ca 2+ : La ATPasa de la membrana plasmática de las células eucariotas. Estructura y funciones. Activación por calmodulina. Cinética y métodos de estudio. 3b).Bombas de Ca 2+ : La ATPasa de la membrana del retículo sarcoplásmico de las células musculares (SERCA). Estructura, funciones. Rol en las contracciones de músculo cardíaco, esquelético y liso (vascular y visceral). Regulación (Fosfolanbam) Familias de proteínas que generan gradientes de protones consumiendo ATP: 1) ATPasas de clases F y V: 1a).Clase F. Estructura y función. Membranas mitocondrial interna y tilacoide del cloroplasto. 1b).Clase V. Estructura y función. Membranas de vacuolas en vegetales, Membranas de lisosomas y endosomas en células animales (Estudio de la regulación del ph intracelular en un parásito con estadios intracelulares y extracelulares: Trypanosoma cruzi). Membrana plasmática de células animales secretoras de ácido (Los osteoclastos y el túbulo renal). 2) ATPasas de clase ABC: Centro activo en casette. Retículo endoplásmico y presentación de antigenos de superficie Las flip-flopasas y el mantenimiento de la asimetría en la composición fosfolipídica interna y externa de la membrana plasmática. (Casos de la agregación plaquetaria y la apoptosis). 5. Superfamilias de simportadores y antiportadores: Propiedades generales. Transportadores acoplados de Na+ y glucosa, Transportadores acoplados de Na+, K+ y Cl- (NKCC1, NKCC2, NCC y KCC). Transportadores acoplados de Na+ y Ca2+. Transportadores acoplados de Na+ y Mg2+. Transportadores acoplados de Na+ y H+. Localización y roles fisiológicos. 6. Introducción a las familias y clases de canales iónicos y de agua (Acuaporinas). Propiedades generales. Estructura. Examen de algunos casos relevantes. Métodos de estudio. Empalamiento con electrodos y pinzamiento de voltaje. Tipos de Patchclamp para registro de un único canal. 7. Metodología del estudio. Permeabilización de membranas externas. Modificación de contenidos intracelulares por ionóforos, electroporación y scratching. Metodología de los estudios cinéticos, Distinción entre transportadores por sus diferencias cinéticas. Página 3

4 8. Uso de agentes farmacológicos para la identificación de transportadores. Utilidad. Mitos y realidades (estudio de casos relevantes). 9. Medida de flujos mediante Espectrometrías de Absorción y de Emisión Atómicas. Métodos y requerimientos (Su utilidad en el diseño de experimentos zero-trans). Medida de flujos mediante radionúclidos (Su utilidad en el diseño de experimentos cis-trans). 10. Introducción al estudio de cambios dinámicos de concentraciones iónicas en tiempo real mediante sondas fluorescentes. Carga y desesterificación con Fura-2 AM, Indo-2 AM y Fluo AM. Metodología y detección de fracasos. Calibraciones y establecimiento de la curva patrón fluorescencia/concentración. Medida de Ca2+ citosólico. Medida de ph intracelular. Medida de potencial de membrana. 11. Imagen de calcio intracelular en células aisladas. Protocolo de carga con Fura-2 AM en células cultivadas. Desarrollo de una curva de concentración respuesta para un agonista y cálculo de la EC50 PROGRAMA DE PRÁCTICAS: 1. Determinación de calcio citosólico mediante Fura-2 AM en sinaptosomas de cerebro completo de ratón en lector de placas de fluorescencia. Apertura de canales VOCC-L mediante depolarización con K+ 60 mm. 2. Análisis de imagen de calcio citosólico mediante Fura-2 AM en células endoteliales cultivadas adheridas mediante microscopía de fluorescencia en tiempo real. Apertura de canales IP3 sensitivos en retículo endotelial. Cálculo de ratio en regiones de interés. Estudio de canales iónicos con técnicas de Electrofisiología y Biología Molecular. PROGRAMA DE LA ACTIVIDAD: Se estudiará la metodología para levar a cabo un registro intracelular mediante la utilización de pipetas de cristal de menos de 1 mm de diámetro, las cuales son estiradas hasta obtener puntas extremadamente finas. Estas pipetas se rellenan con una solución similar al líquido intracelular y se acoplan a un alambre de cloruro de plata conectado al amplificador para registrar las señales bioeléctricas. En la realización de un registro intracelular, se debe insertar la punta de la pipeta dentro de la célula, de modo que se pueda medir la diferencia de potencial entre el interior y el exterior celular. En 1963, Sir Alan Hodgkin y Sir Andrew Huxley obtuvieron el Premio Nobel de Fisiología y Medicina por su contribución a la comprensión de los mecanismos subyacentes a la generación de potenciales de acción en las neuronas mediante el uso de este tipo de técnicas. Además se analizará la combinación de este tipo de técnicas con la biología molecular, especialmente con el estudio de los patrones de expresión génica de receptores en tejido nervioso. Analizaremos las distintas partes que componen un sistema de registro electrofisiológico. Se usará el programa informático Neurosim for Windows para estudiar las bases iónicas del potencial de acción y de la neurotransmisión así como el efecto de distintos fármacos y toxinas. Fundamentos de las distintas configuraciones de registro electrofisiológico en la técnica de patchclamp. Propiedades eléctricas de membrana. Conceptos relacionados con potencial de reposo en la membrana de las células excitables, gradientes electroquímicos, gradientes de concentración y potencial de equilibrio de los distintos iones (mediante un simulador informático: que permite modificar las concentraciones en el medio extra e intracellular, y permeabilidades de los distintos iones -sodio, potasio y cloro- y muestra el Página 4

5 valor que alcanzaría el potencial de equilibrio para un ión y el potencial de membrana calculados mediante las ecuaciones de Nernst y Goldman) Obtención del contenido celular/neuronal mediante pipetas de patch-clamp. Expresión génica en cultivos celulares y rodajas de sistema nervioso. Fundamentos y metodología específica para el desarrollo de RT-PCR (convencional y cuantitativa) en célula única. BIBLIOGRAFÍA : Artículos y textos especializados ENLACES RECOMENDADOS METODOLOGÍA DOCENTE Colección, estudio y análisis bibliográfico Clases magistrales Experimentación EVALUACIÓN (INSTRUMENTOS DE EVALUACIÓN, CRITERIOS DE EVALUACIÓN Y PORCENTAJE SOBRE LA CALIFICACIÓN FINAL, ETC.) Sistema de evaluación continua. Valoración de la asistencia y participación activa en las clases teóricas y prácticas. Capacidad de relacionar conceptos de la asignatura. Corrección en la realización de actividades practicas. Asistencia diaria: 50% Resúmen final como trabajo en texto y presentación del mismo: 50% INFORMACIÓN ADICIONAL Página 5