Tema 13 Genética de hongos filamentosos: Neurospora crassa
Genética Molecular de Neurospora crassa Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Genética de Neurospora Genética molecular de Neurospora Transformación Herramientas disponibles Inactivación génica El genoma de Neurospora
Genética Molecular de Neurospora crassa Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Genética de Neurospora Genética molecular de Neurospora Transformación Herramientas disponibles Inactivación génica El genoma de Neurospora
Neurospora en la naturaleza
Neurospora crece sobre troncos que han sido quemados
Primera descripción de Neurospora como el hongo que causó la contaminación de panaderías francesas en 1843
Shear CL y Dodge BO (1927) Life stories and heterotallism of the red bread mold fungi of the Monilia sitophila group. J. Agric. Res. 34: 1019-1042. Describió las estructuras sexuales y la segregación del tipo sexual en varias especies de Neurospora. Bernard O. Dodge (1872-1960)
Ciclos de vida de Neurospora crassa
Especies de Neurospora Heterotálicas N. crassa N. discreta N. intermedia N. sitophila Pseudohomotálica N. tetrasperma Homotálicas N. africana N. dodgei N. galapagosensis N. lineolata N. terricola N. pannonica
Ciclo sexual de una especie heterotálica
Ciclo sexual de una especie homotálica
Ciclo sexual de una especie pseudohomotálica
Ciclo vegetativo de Neurospora crassa germinación conidios micelio conidióforos
Hifas de Neurospora
Conidiación de Neurospora crassa
Conidios de Neurospora crassa
Macroconidios y microconidios de Neurospora
Un reloj circadiano regula la conidiación
Genética Molecular de Neurospora crassa Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Genética de Neurospora Genética molecular de Neurospora Transformación Herramientas disponibles Inactivación génica El genoma de Neurospora
Cultivos de Neurospora crassa
Cultivos de Neurospora crassa
Medio con sorbosa
Genética Molecular de Neurospora crassa Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Genética de Neurospora Genética molecular de Neurospora Transformación Herramientas disponibles Inactivación génica El genoma de Neurospora
Mutagénesis Agentes mutagénicos usados en Neurospora Radiaciones Ultravioleta Rayos X Agentes químicos Ácido nitroso Metanosulfonato de etilo (EMS) Metilhidroxiamina ICR170 Nitrosoguanidina
medio completo Búsqueda de mutantes auxótrofos medio mínimo medio con grupos de nutrientes medio con distintos aminoácidos el medio con arginina permite el crecimiento
Premio Nobel de Fisiología o Medicina 1958 George W. Beadle (1903-1989) Edward L. Tatum (1909-1975) El aislamiento y la caracterización mutantes auxótrofos de Neurospora les permitió formular la hipótesis de que un gen era responsable de una enzima.
Enriquecimiento por filtración Los protótrofos se quedan en el filtro Medio mínimo Silvestres protótrofos Mutantes nutricionales (auxótrofos) Sembrar Los auxótrofos pasan a través del filtro Los auxótrofos crecen Medio con leucina
Ruta de la carotenogénesis de Neurospora
Medio con sorbosa Mutante albino
Mutantes de la carotenogénesis de Neurospora Naranja (silvestre) Albino Amarillento Rojizo
Mutantes morfológicos de Neurospora
0.5 Frecuencia de los conidios 0.4 0.3 0.2 0.1 0.15 0.46 0.25 0.09 0 1 0.03 0.01 0.01 2 3 4 5 6 7 Núcleos por conidio
Heterocariosis Los heterocariontes nos dan información sobre los mutantes: Permite saber si las mutaciones son dominantes of recesivas Permite identificar grupos de complementación
El micelio de Neurospora es un cenocito
Complementación en Neurospora Células arg-1 alteradas en una enzima de la ruta de síntesis de arginina Células arg-2 alteradas en una enzima distinta de la ruta de síntesis de arginina Fusión El heterocarionte crece sin arginina
Grupos de complementación: grupo I II III IV V mutantes 1, 5 2, 4, 6, 7 3 8, 10 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 o + o + + o + o + o o + + + o + o + o + o + o + o + o o + + + + + + + o + + + + + + + + o + + + + + + + o + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 o
Ciclo sexual de Neurospora
Ciclo sexual de Neurospora Niveles bajos de C y N Peritecio Formación de protoperitecios
Ciclo sexual de Neurospora Meiosis
Ascosporas
Las octadas ordenadas permiten detectar el ligamiento al centrómero
El reparto de los cromosomas en la octada permite observar varios patrones de segregación
Productos de la meiosis en Neurospora Desarrollo de ascas con el resultado de la meiosis de un diploide producto de un cruzamiento entre dos mutantes de la coloración de la ascospora. Se observa la segregación en la primera y segunda división meiótica.
Durante la recombinación se producen moléculas de ADN heterodúplices
Detección de la conversión génica
Estimación de la distancia genética por recombinación
cyhr: resistente a cicloheximida hom: auxórofo de homoserina nic: auxórofo de nicotóico al: albino cyhr al hom nic cyhr al hom nic silvestre + + + + 1 2 3 cyhr al hom nic + + + + parentales 99 106 cyhr + + + + al hom nic cyhr al + + + + hom nic rec en 1 rec en 2 22 22 4 8 cyhr al hom + + + + nic rec en 3 22 17 cyhr + hom nic + al + + rec en 1 y 2 1 1 cyhr + + nic + al hom + rec en 1 y 3 0 0 cyhr al + nic + + hom + rec en 2 y 3 3 5
Estimación de la distancia genética por recombinación cyhr al hom nic + + + + 1 2 3 17.4 % 4.5 % 15.2 % cyhr al hom nic 17.4 4.5 15.2
Grupo de ligamiento I Existen unos 1000 marcadores genéticos localizados en siete grupos de ligamiento
Detección de mutaciones en el ADN mitocondrial
Genética Molecular de Neurospora crassa Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Genética de Neurospora Genética molecular de Neurospora Transformación Herramientas disponibles Inactivación génica El genoma de Neurospora
Ingeniería genética en Neurospora Introducción de ADN: Transformación de esferoplastos Electroporación de conidios Plásmidos integrativos Resistencia a benomilo e higromicina Otras herramientas: Promotores regulables: qa-2 Fusiones con lacz, GFP y luciferasa para medir transcripción y detectar proteínas. Inactivación génica.
Integración del ADN en hongos Vector Receptor de la transformación Cromosoma I Cromosoma II Reemplazamiento génico Duplicación Integración ectópica Vector
Receptor vector Integración ectópica Integración ectópica múltiple Integración homóloga Reemplazamiento
Transformación en Neurospora La competencia es una propiedad del núcleo (co-transformación). Cuando ocurre integración homóloga no suele ocurrir integración ectópica en el mismo núcleo. El 1% de los transformantes estables han sufrido recombinación homóloga (si es posible). 10% de transformantes ectópicos han sufrido alteraciones cromosómicas con frecuencia. 100% de transformantes por recombinación homóloga en estirpes con una mutación en el gen mus-51 o mus-52 responsables de la recombinación no homóloga.
Genética Molecular de Neurospora crassa Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Genética de Neurospora Genética molecular de Neurospora Transformación Herramientas disponibles Inactivación génica El genoma de Neurospora
Cósmidos para construir genotecas en Neurospora
Clonación en Neurospora por selección de grupos (sib selection)
Núcleos de Neurospora marcados con H1-GFP
Microtúbulos de Neurospora marcados con tubulina-gfp
Genética Molecular de Neurospora crassa Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Genética de Neurospora Genética molecular de Neurospora Transformación Herramientas disponibles Inactivación génica El genoma de Neurospora
Genética Molecular de Neurospora crassa Ciclo de vida Neurospora en el laboratorio Genética de Neurospora Genética molecular de Neurospora Transformación Herramientas disponibles Inactivación génica El genoma de Neurospora
El genoma de Neurospora Tamaño: 42 Mb Genoma secuenciado: 39.225.835 bp (rel. 7) Cromosoma I II III IV V VI VII Tamaño (Mb) 10.3 9.2 5.7 5.1 4.6 4.0 4.0
Contenido G+C Total: 50% ADN codificante: 44% ADN no codificante: 56% Intrones Presentes en el 80% de los genes Longitud promedio: 134 pb Promedio de 1,7 intrones por gen Un transposón activo, Tad, muchas copias de transposones inactivos (RIP),
Tamaño (Mb) Genes Haemophilus Saccharomyces C. elegans Drosophila Homo 1,8 12 100 165 3000 1.709 6.144 18.266 13.338 20.000 Neurospora 42? 10.620
Fin