C I B I O R en base a los parámetros de la OMS y fragmentación del ADN espermático. 10, 11,12 y 13 de Junio de 2015 PONENTES: Dra. Rosalina Reyes Luna Escuela de Biología, BUAP Dra. Dolores López Morales Escuela de Biología, BUAP M. en C. Ubaldo Quiroz López Escuela de Biología, BUAP M. en C. Juan Carlos Flores Alonso CIBIOR IMSS, Escuela de Biología, BUAP Dr. Isaías J. Rivera Castillo IMSS, Equipo de Fertilidad Sta. Teresa, Puebla APOYO TÉCNICO: P.B. Gabriela Paola Gutiérrez Gutiérrez Escuela de Biología, BUAP P.B. Juan Carlos Zúñiga Morales Escuela de Biología, BUAP 1
Introducción El análisis del líquido seminal es un estudio que se utiliza en la evaluación de la fertilidad masculina, detección de procesos infecciosos, monitoreo de una vasectomía, realización de chequeos pre y post operatorio, entro otros. Consiste en la evaluación macroscópica y microscópica de una muestra de semen para determinar su estado general. Aun cuando en la mayoría de los laboratorios donde se realiza este tipo de estudio se siguen las normas básicas recomendadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS), las interpretaciones y reportes de los resultados obtenidos pueden presentar algunas diferencias, ya que estos dependen de la experiencia del profesional que evalué la muestra, de la diversidad de las características de los varones (ubicación geográfica, factores ambientales que lo afectan, hábitos de vida, etcétera), de los términos y vocabulario utilizados, así como el complejo conocimiento necesario para alcanzar los diagnósticos. En México aun no se ha logrado una estandarización importante del Análisis de Semen en la mayoría de los laboratorios clínicos. Existen entre los laboratorios diversos sistemas de evaluación que no emplean lineamientos estandarizados de organismos o instituciones expertas en el área, esta diversidad de criterios para evaluar las muestras de semen, tiene como consecuencia problemas serios en la interpretación de resultados confiables, por ejemplo cuando se trata de parejas infértiles referidas de una clínica a otra; los resultados de los análisis de semen entre los laboratorios involucrados son diferentes, es decir un paciente puede ser clasificado como normal en un laboratorio y anormal en otro. Hasta el momento se ha intentado estandarizar esta prueba clínica en el ámbito mundial debido a que en muchos países el problema es similar al de México. La 2
Organización Mundial de la Salud (OMS) ha realizado importantes esfuerzos para establecer lineamientos estandarizados y ha publicado manuales de laboratorio con el fin de igualar criterios de evaluación entre todos los laboratorios. La integridad ADN es vital para los procesos de reproducción y la transmisión de la información genética a la siguiente generación. Se sabe que la fragmentación del ADN espermático es determinante en la fertilidad masculina y su valoración es sumamente recomendable en la aplicación de tratamientos de reproducción asistida. Las principales técnicas para determinación de la fragmentación del ADN empleadas como TUNEL, SCD, SCSA así como el ensayo cometa en condiciones alcalinas varían en el grado de sensibilidad y de complejidad metodológica que presentan, sin embargo suelen ser costosas en tiempo y dinero. El ensayo de difenilamina para medir la concentración de ADN fue propuesto por Schneider (1957). La reacción de difenilamina incluye ácido acético y ácido sulfúrico, cuando son calentados en presencia de ADN, rompen los enlaces fosfodiester e hidrolizan los enlaces glucosídicos entre la desoxirribosa y la base nitrogenada. La 2- desoxiribosa libre forma el aldehido ω-hidroxilevulinil, el cual reacciona con la difenilamina produciendo componentes de coloración azúl que muestran una absorbancia característica a 595 nm. La reacción es específica para la 2- desoxiribosa por lo que la presencia de ARN no interfiere con la cuantificación. En la presente práctica presentamos una modificación del ensayo de difenilamina que considera la obtención de ADN oligosomal (DNA fragmentado) y ADN de alto peso molecular (ADN no dañado) como una medida de la integridad del ADN en espermatozoides humanos. Definiciones 1.- El Semen Humano.- El semen o eyaculado es un fluido biológico compuesto por espermatozoides (elementos celulares) producidos en los 3
testículos y por plasma seminal; resultante de la secreción combinada de las glándulas sexuales (bulbo uretrales, uretrales, epidídimo, próstata y vesículas seminales). 2.- Espermatozoide.- Es una célula muy diferenciada que para poder participar con éxito en el proceso reproductor debe poseer una serie de propiedades características como motilidad, mecanismos de reconocimiento del ovocito, secreción de enzimas acrosomicas y mecanismos de fusión de membrana. Condiciones de recolección de la muestra de semen Una adecuada recolección de la muestra de semen es importante para un buen análisis seminal, por ello es necesario cubrir una serie de pasos que nos permitirán obtener un buen resultado. Instrucciones a los pacientes: Se deberá entregar un formato escrito al paciente con las instrucciones claras y precisas sobre las condiciones generales de recolección, los cuales son: Abstinencia sexual de 2 a 7 días. Efectuar lavado genital con agua y jabón. Colectar la muestra por masturbación. Depositar la muestra completa de semen en un recipiente de polipropileno estéril. Si la muestra es colectada desde su hogar: Entregar al laboratorio con un máximo de 1 hora después de haber sido colectada y mantenerla lo más cercano a temperatura corporal. 4
Abstinencia sexual: El tiempo de abstinencia es importante ya que tiene una gran influencia sobre la concentración espermática. El tiempo requerido de abstinencia es de 3 a 5 días y nunca menos de 2 ni mayor a 7. El estandarizar las condiciones e intervalos de abstinencia permitirá una adecuada comparación de los resultados. Recipientes colectores: Los frascos de polipropileno con tapa de rosca de polietileno con capacidad de 100 ml son los más óptimos para la recolección de la muestra. De preferencia el frasco debes estar tibio para tratar de mantener la temperatura ideal de la muestra (37ºC). Recolección del semen: La masturbación es el único método aceptado para la recolección del semen por ser el único que permite la colecta completa y libre de contaminación. Si el paciente no realiza la colecta de la muestra por este método, puede realizar un coito empleando preservativos especiales libres de lubricantes y espermicidas. Las muestras incompletas deben rechazarse ya que el análisis no reflejara el total del eyaculado. Manejo y traslado de muestras: Las muestras colectadas en el hogar deben de entregarse no rebasando los 60 minutos después de su obtención, ya que si se deja pasar más tiempo la muerte celular se incrementa y la composición bioquímica se altera por la actividad de hidrolasas. No deben someterse a temperaturas extremas, las bajas temperaturas causan inmovilización de la célula y altas temperaturas daño al espermatozoide, como alteraciones bioquímicas e incremento bacteriano. Al recibir la muestra se debe realizar un cuestionario al paciente y confirmar los de días de abstinencia, la colección completa del eyaculado, edad y hora de recolección. Análisis de semen 5
El análisis macroscópico del semen se debe hacer con la muestra fresca, es decir no debe pasar más de una hora entre la toma de la muestra y su análisis, ya que de lo contrario no se podrán evaluar algunos aspectos como la licuefacción, y se podrían alterar los parámetros de movilidad y viabilidad, ya que trascurrido cierto periodo de tiempo los espermatozoides comienzan a pararse y morir debido a las condiciones ambientales, es especial de temperatura, por lo que también es muy importante que la muestra se mantenga a 37ºC durante su evaluación. Parámetros macroscópicos Su evaluación se realiza a simple vista y con la ayuda de algunos instrumentos de laboratorio, como pipetas Pasteur, tiras indicadoras de ph o tubos para centrífuga graduados. Coagulación.- El semen se emite en estado líquido pero rápidamente se trasforma en un estado semisólido. La coagulación se produce por efecto de la semenogelina, producida por las vesículas seminales, por lo que su ausencia impide la coagulación del semen, lo que se asocia a la falta de fructuosa en el plasma seminal. Licuefacción.- La muestra se licua a 37º C dentro de los primeros 60 minutos de su obtención, lo que se produce por acción de la serín-proteasa denominada antígeno prostático específico (PSA), en cuya activación interviene la kalikreína glandular humana 2 y el zinc del fluido prostático. Además del PSA, otros factores influyen en la licuefacción del coagulo. La adecuada licuefacción es un indicativo de un funcionamiento normal de la próstata (Remohí, 2012). Si la licuefacción es incompleta se observan hilos de moco o coágulos gelatinosos. Esto debe anotarse porque dificultaría el conteo espermático, además de ser un probable indicador de prostatitis y debido a que los espermatozoides no son liberados del coagulo puede ser causa de infertilidad (OMS, 2010). 6
Aspecto.- Se refiere al color que presenta el eyaculado. Una muestra normal es de color gris o blanco opalescente o ligeramente amarillenta con el incremento de los días de abstinencia. Si presentan algún otro color o se observan cuerpos extraños puede deberse a una contaminación a la hora de su colecta o inclusive a alguna patología, una coloración trasparente puede deberse a una baja en la concentración de espermatozoides y marrón (Remohí, 2012). cuando contiene glóbulos rojos Volumen.- Se mide transfiriendo directamente la muestra completa a un tubo cónico de 15 ml, no se deben emplear jeringas plásticas ni agujas de inyección ya que afectan la movilidad de los espermatozoides (OMS, 2010). El volumen normal del eyaculado tras 3 a 5 días de abstinencia sexual es de 1.5 a 6 ml. El líquido seminal es producido fundamentalmente por las vesículas seminales y la próstata, con una pequeña cantidad procedente de las glándulas bulbouretrales y el epidídimo. Volúmenes bajos pueden deberse a muestras incompletas, hipogonadismo, obstrucción secundaria a infecciones, ausencia congénita o disfunción de las vesículas seminales y deferentes o eyaculación retrógrada. Volúmenes superiores a 6 ml pueden ser secundarios a abstinencia sexual prolongada (Remohí, 2012). Viscosidad.- Para medir la viscosidad se aspira la muestra con una pipeta Pasteur permitiendo la caída libre de gotas, en las que se observa la longitud del filamento y se clasifica como: Normal.- Gotas pequeñas bien definidas con caída libre con cierta consistencia. Disminuida.- Gota con caída libre con consistencia de agua. Aumentada.- No forma gotas y presenta filancia (filamentos mayores a 2 cm). 7
El semen es ligeramente más viscoso que el agua. El incremento de la viscosidad puede ser indicativo de un funcionamiento anormal de la próstata, secundario a una infección del tracto genital (OMS, 2010). Procesamiento de muestras viscosas.- Cuando la muestras presentan una alta viscosidad se puede emplear quimiotripsina para romper el coágulo, también se puede usar PBS v/v. ph.- Se coloca una gota de la muestra de semen, previamente homogenizada en la tira reactiva de ph, colocada la gota se compara el color obtenido de la tira con la escala del contenedor del papel indicador. El rango que abarca el ph de semen debe estar de 7.2 a 8. El ph del eyaculado es el resultado del equilibrio de las secreciones de las glándulas accesorias, especialmente la secreción de ácida de la próstata. En caso de prostatitis aguda, vesiculitis o epididimitis bilateral, suele ser mayor a 8. En caso de infecciones crónicas el ph tiende a ser más ácido. En caso de obstrucción de conductos eyaculatorios o agenesia de deferentes el ph es inferior a 7 y se asocia a volúmenes bajos del eyaculado (Remohí, 2012). Análisis microscópico Se realiza con un microscopio óptico de contraste de fases y se requiere de algunos reactivos, soluciones y tinciones para el correcto análisis de la viabilidad, morfología y concentración. Movilidad espermática.- Los espermatozoides deben presentar movilidad para poder migrar por el moco cervical en el tracto vaginal femenino y penetrar el cumulus oophorus que rodea al ovocito. El espermatozoide sin movilidad alguna no podría llevar a cabo ninguna de las funciones y por ende no llegaría a obtenerse una fertilización. La proporción de la movilidad espermática progresiva se relaciona con las tasas de embarazos (OMS, 2010). 8
Para la evaluación de la movilidad se observa la muestra a un objetivo a 40x, se hace un conteo de 200 espermatozoides en diferentes campos; estos se deben contar en dirección a las manecillas del reloj y se clasifica en porcentaje en las siguientes categorías: A. Movilidad progresiva: espermatozoides que se mueven activamente, tanto linealmente como en un gran círculo, independientemente de la velocidad. B. Movilidad no progresiva: cualquier otro patrón de movilidad en ausencia de progresión. C. Inmóviles: espermatozoides que no presentan ningún movimiento. La movilidad total se expresa en porcentaje, y es la suma de la movilidad A más la movilidad B. A partir de la clasificación anterior, se define como astenozoospermia cuando existe igual o menos del 32% de espermatozoides con movilidad progresiva o menos de 40% con movilidad total (Remohí, 2012). Preparación de alícuota para observar al microscopio.- Para la toma de la alícuota lo primero que se hace es homogenizar la muestra con una pipeta Pasteur, hecho esto se toma una alícuota de 10 µl para posteriormente colocarla en un portaobjetos de 25X75 mm y se cubre la gota con un cubreobjetos de 22X22 mm esto nos permite tener un espesor aproximado de 22 µm. El peso del cubreobjetos distribuye la muestra uniformemente, esto que nos permite observar de manera adecuada la movilidad en el microscopio a 40x. Si al observar varios campos estos presentan variaciones muy altas en el conteo de espermatozoides esto quiere decir que la muestra no está bien homogenizada y se tiene que volver a homogenizar la muestra. 9
Fig 1. Muestra se semen observada en microscopio óptico en 40x para el conteo de la movilidad espermática. No requiere ninguna tinción. Aglutinación.- Consiste en la unión: cabeza-cabeza, pieza intermedia-pieza intermedia, cola-cola. La presencia de aglutinación sugiere un problema inmunológico causante de infertilidad. La presencia de anticuerpos antiespermáticos debe tenerse en cuenta, aunque la aglutinación no es suficiente evidencia para deducir una causa inmunológica de infertilidad. En caso de presentar aglutinación, debe considerarse realizar un cultivo de semen y la determinación de anticuerpos (OMS, 2010). A) C) Agregación inespecífica.- Es la unión de espermatozoides a otras células no espermáticas como detritus celular, células redondas u otros tipos. B) Fig 2. Patrones de aglutinación del espermatozoide humano. A) Cabeza- Cabeza, B) Cola-Cola, C) Puntas de la cola. 10
A) B) Procedimiento: Fig 3. A) Aglutinación específica, B) Agregación inespecífica de espermatozoides a otros tipos celulares. Homogenizar la muestra con una pipeta Pasteur. Tomar una alícuota de 10 µl. Observar la muestra a un objetivo de 40x, tomando solo los campos centrales. Nota: La aglutinación y agregación espermática se reporta en porcentaje de acuerdo a la cantidad encontrada en 100 campos que son elegidos al azar donde cada campo representa el 1%. Interpretación de resultados: La aglutinación es considerada positiva si es >10%, en estos casos se recomienda la determinación de Anticuerpos Anti Espermáticos. Viabilidad espermática.- La viabilidad espermática nos proporciona información importante de la cantidad de espermatozoides vivos, estos se someten a un colorante vital según las estimaciones de la evaluación de la integridad de la membrana de las células, se puede determinar rutinariamente en todas las muestras, pero es especialmente importante para las muestras con menos de 40% espermatozoides con movilidad progresiva. Este examen puede proporcionar un control de la evaluación de la motilidad, ya que el porcentaje de células muertas 11
no debe exceder (dentro del error de muestreo) el porcentaje de espermatozoides inmóviles, por lo tanto el porcentaje de células viables debe ser igual o superior a la de las células móviles (OMS, 2010). Permite diferenciar la necrozoospermia de la alteración de en la movilidad por alteraciones estructurales en el flagelo, como en el síndrome de Kartagener. El porcentaje de espermatozoides viables es del 58%. La necrozoospermia puede ser indicativa de patología epididimaria (Remohí, 2012). Para la evaluación de este parámetro se observa la preparación a un objetivo a 40x, se hace un conteo de 200 espermatozoides en diferentes campos; estos se deben contar en dirección a las manecillas del reloj. Preparación de soluciones.- Normalmente se emplea eosina amarillenta al 5% o eosina nigrosina, así como emplear PBS comercial o prepararlo de la siguiente forma: Solución salina de fosfatos (PBS) 0.15 M ph 7.4 Cloruro de sodio 0.8 g /dl Cloruro de potasio 0.02 g/dl Fosfato de sodio bibásico 0.115 g/dl Fosfato de potasio monobásico 0.02 g/dl Se ajusta ph 7.4 con NaOH 1N aforado con agua desmineralizada Procedimiento: 1.- Se homogeniza la muestra con una pipeta Pasteur 2.- Se colocan 10 µl de colorante en un portaobjetos 3.- Se añade 10 µl de semen 4.- Se homogenizan ambas muestras en con hisopo de madera 5.- Se cubre con un cubreobjetos de 24X40 mm 6.- Se deja estabilizar la muestra por 1 min 7.- Se hace el conteo de espermatozoides vivos y muertos 12
Se clasifican como: Espermatozoides vivos (no teñidos) Espermatozoides muertos (teñidos) Nota: El porcentaje de viabilidad debe ser igual o mayor al porcentaje total de la movilidad espermática, cuando sucede lo contrario se debe verificar ambas mediciones. Interpretación y reporte de resultados: Se obtiene el porcentaje de espermatozoides vivos (no teñidos), tomando el total de espermatozoides contados. Fig 4. Imagen de espermatozoides vivos (L) y espermatozoides muertos (D1 y D2) teñidos con colorante eosina nigrosina, observados en un objetivo de 40x. Concentración espermática.- La concentración espermática es muy importante para saber el número de espermatozoides presentes en la muestra y saber la cantidad de espermatozoides adecuada para lograr la fertilización. La concentración de espermatozoides (número de espermatozoides por mililitro) y número de espermatozoides totales por eyaculado (también denominado concentración de espermatozoides por volumen seminal) son dos términos diferentes que no deben confundirse. Para realizar el recuento espermático lo más recomendable es utilizar una cámara hemocitométrica, dentro de las cuales la más utilizada es la cámara de Neubauer, aunque también se usa la cámara de Makler. 13
Cuando no existe ninguna obstrucción de la vía seminal, el número de espermatozoides por eyaculado se relaciona con el volumen testicular, aunque esta correlación es relativamente baja, por lo que no sería específica de la función testicular. Sin embargo la concentración si está directamente relacionada con la capacidad de fertilización de los espermatozoides y la tasa de embarazos. De acuerdo al manual de la Organización Mundial de la Salud del 2010 se denomina oligozoospermia a una concentración espermática inferior a 15 millones/ml. Cuando no se encuentran espermatozoides en el eyaculado se debe recurrir al centrifugado de la muestra y la pastilla se examinará de nuevo. Si en este centrifugado aparecen espermatozoides se denominará criptozoospermia (<100,000 espermatozoides/ml) y si no se observan espermatozoides se dirá que es azoospermia (Remohí, 2012). Preparación del diluyente: Pesar 5 gr de bicarbonato de sodio + 0.025 g de Azul de Tripán y medir 1 ml de Formaldehido (36-40%). Disolver en 100 ml de agua destilada y filtrar en papel Whatman (No. 1). Almacenar a 4ºC. Preparación de la disolución.- Para el conteo de espermatozoides se recomienda emplear un hemocitómetro. Primero se evalúa la muestra ya homogenizada, al observar una preparación con 10 µl de semen en un microscopio óptico con el objetivo 40x, se realiza un conteo grueso en 3 diferentes campos y se obtiene la media de los 3 conteos. Con base al número de espermatozoides obtenidos de la media se realizara la disolución recomendada en Tabla 1. La muestra de semen se diluye con la solución diluyente para la inmovilización de espermatozoides en un tubo cónico. La disolución se homogeniza perfectamente con una pipeta Pasteur para que la obtención de la alícuota sea representativa, se toman alícuotas de 10µL para llenar cada cámara 14
del hemocitómetro. Se deja 3 minutos en ambiente húmedo para que se estabilice la muestra. Tabla 1. Disoluciones de semen para el conteo de concentración en el Hemocitómetro. No. de espermatozoides contados por campo con objetivo de 40x Disolución (semen + diluyente) Semen (µl) Diluyente (µl) <15 1:5 (1+4) 100 400 15-40 1:10 (1+9) 50 450 40-200 1:20 (1+19) 50 950 >200 1:50 (1+49) 50 2450 Conteo en el Hemocitómetro.- El hemocitómetro (Cámara de Neubauer) tiene 2 lados iguales, cada una con una cuadrícula formada por 5 cuadros principales (A, B, C, D, E), el cuadro central (E) esta divido en 25 cuadros más pequeños (E1, E2, E,...E25) a su vez estos últimos está divido por 16 cuadros. El principal cuadro tiene 5 mm de longitud, 1 mm de ancho y 0.1 mm de profundidad, el volumen total del cuadro principal es de 10 mm. El conteo se realiza con base a lo siguiente: 1.- El cuadro central del hemocitometro de Neubauer contiene 25 cuadros, cada uno de los cuales contiene 16 cuadros más pequeños. Fig. 5. 2.- Primero se cuenta el número de espermatozoides presentes en el primer cuadro superior izquierdo de la cámara. 3.- Dependiendo el número de espermatozoides contados en el primer cuadro superior izquierdo serán los cuadros a contar del hemocitometro. Tabla 2. 15
E1 Fig 5. Representación de los 25 cuadros centrales de una de las cuadrículas de Hemocitómetro (Cámara Neubauer) E25 Tabla 2. Relación de espermatozoides contados en el primer cuadro superior izquierdo del hemocitometro con respecto al número de cuadros a contar. Número de espermatozoides encontrados en el cuadro superior izquierdo Numero de cuadros evaluados del cuadro central del Hemocitometro. < 10 Espermatozoides 25 cuadros 10-40 Espermatozoides 10 cuadros <40 Espermatozoides 5 cuadros Si un espermatozoide está en la línea que divide a dos cuadros adyacentes, solo se debe contar el que esta de lado superior e izquierdo del cuadro que se estudia. Fig 6. Representación de un cuadro de los 25 centrales del hemocitometro donde se marcan los lados en donde se deben contabilizar los espermatozoides que se encuentran presentes sobre las líneas en cada cuadro. Interpretación y reporte de resultados: La concentración de espermatozoides se expresa en millones/ ml. Para la obtención de esto se utiliza la media del 16
conteo de las dos cámaras del hemocitómetro y se divide entre el factor de conversión correspondiente. El resultado obtenido se expresa en millones de espermatozoides/l de semen. Los factores de conversión se presentan en la siguiente tabla. Tabla 3. Factores de conversión, para obtener el número de espermatozoides por ml de eyaculado. Disolución utilizada (semen + diluyente) Numero de cuadros contados 25 cuadros 10 cuadros 5 cuadros 1:5 (1+4) 20 8 4 1:10 (1+9) 10 4 2 1:20 (1+19) 5 2 1 1:50 (1+49) 2 0.8 0.4 Para obtener la cuenta total de espermatozoides se realiza lo siguiente: Cuenta total: volumen de eyaculado x concentración espermática x ml. Morfología espermática.- Debido a que existe una gran variabilidad en la morfología espermática es difícil establecer la apariencia normal de los espermatozoides con capacidad fertilizante. Las características morfológicas para definir a un espermatozoide como normal se basan en la apariencia de los observados en el moco del canal endocervical durante una prueba postcoital. Los parámetros para definir a un espermatozoide como normal se basan en los denominados criterios estrictos de Kruger. Cualquier forma borderline se considera anormal. Sin embargo, trazar una línea clara entre lo normal y anormal es muy difícil. Así, uno de los grandes problemas a la hora de evaluar la morfología espermática es la reproductibilidad de los resultados, ya que la responsabilidad recae directamente en el observador (Remohí, 2012). La determinación de la morfología permite distinguir la cabeza, pieza media y la cola del espermatozoide. En el espermatozoide ideal a cabeza debe ser ovalada, 17
tener una longitud entre 4-5 µm, tomando en cuenta el cambio de tamaño que induce la fijación y el teñido; y un ancho de 2.5-3.5 µm, debe presentar una región acrosomal claramente definida, delgada, con un ancho menor a 1 µm, colocada en la región apical de la cabeza y cubrir más de la mitad de la misma. La pieza intermedia es delgada y representa menos de la tercera parte del ancho de la cabeza, se encuentra alineada con el eje longitudinal de la cabeza. Las gotas citoplasmáticas deben ser menores que la mitad de una cabeza normal. La cola debe ser derecha y uniforme, más estrecha que la pieza media y medir aproximadamente 45 µm de largo. Dentro de los defectos de los espermatozoides se encuentran las siguientes anormalidades: 1. Defecto de cabeza: Puede ser grande, pequeña, acintada, piriforme, amorfa, vacuolada (>20% del área ocupada por vacuolas no teñidas), cabezas con área acrosomal pequeña (< 40% del área de la cabeza), cabezas dobles y toda combinación entre estos. 2. Defecto de pieza intermedia: Incluyen la ausencia de la cola, el cuello doblado (el cuello y la cola forman un ángulo mayor de 90 º con respecto al eje longitudinal de la cabeza), inserción asimétrica de la pieza media a cabeza, pieza media gruesa o irregular, pieza media anormalmente fina y toda combinación entre estos. 3. Defecto de flagelo: El flagelo puede ser corto, múltiple, en horquilla, roto, doblado (>90º), de espesor irregular, enrollado y toda combinación entre estos. 4. Presencia de gota citoplasmática: Mayor a 1/3 del área de una cabeza normal. Las gotas citoplasmáticas se encuentran generalmente en la pieza media. La alteración de la morfología se denomina teratozoospermia y de acuerdo a la OMS el valor inferior de referencia para las formas normales es del 4%, por lo que al parecer este parámetro cada vez es menos considerado como un factor relevante en la capacidad de fecundación de una muestra de semen. La aparición 18
de un alto porcentaje de espermatozoides con gota citoplasmática es indicativo de falta de maduración epididimaria y se corresponde con una pérdida de fertilidad (Chenoweth, 1997). Es muy importante mencionar que solo se consideran células reconocibles como espermatozoides con su cola en el conteo morfológico diferencial; las células inmaduras, incluyendo el estadio de espermátide redonda no se cuentan como espermatozoides. Las cabezas aisladas y de alfiler no se cuentan como espermatozoides ni se consideran en el conteo. Fig 7. Esquema que representa la estructura normal de un espermatozoide humano. Soluciones.- Se empleara un kit de tinción rápida para la morfología de los espermatozoides marca Fig 8. Morfología del espermatozoide humano. (A-C) variaciones en la forma normal de la cabeza. (D) espermatozoide normal con baja incidencia de vacuolas. (E) cabeza normal vista en forma lateral. (F-O) defectos de cabeza: F= microcéfalo; G= macrocéfalo; H,I= formas en punta; J,K= piriforme; L=contracción; M= región reducida del acrosoma; N= tinción amorfa o densa; O= vacuolado, (P) gota citoplasmática. (Q) Inserción asimétrica de la cola. (R) Cola doble. (S) Defecto de pieza intermedia. (T) Pieza intermedia delgada debido a la ausencia de mitocondrias. (U) Cola no insertada. (V-Z) Defectos de cola: V= Cola enrollada; W= Cola corta; X= Gota terminal en la cola; Y= cola en forma de U; Z= Cola seccionada. (AA) Forma unida. 19
EspermaForm, el cual consta de un fijador y dos colorantes. Procedimiento: Se toma una alícuota de 30 µl y se hace un frotis que se deja secar al aire. Posteriormente se sumerge en el fijador por 3 minutos, se enjuaga con agua destilada y se deja secar nuevamente. Para la tinción, primero se introduce por 5 minutos en el colorante A, se enjuaga y se deja secar, finalmente se introduce por 7 minutos en el colorante B se enjuaga y se deja secar. Las células teñidas se observan en un microscopio óptico en campo claro, con un objetivo de 100x de inmersión. La evaluación de la morfología se debe llevar a cabo en el centro del portaobjetos. Se deben de contar al menos 200 espermatozoides consecutivos. Se emplea un contador de células de laboratorio que posea varias teclas. Cada una de ellas representara los espermatozoides normales, defectos de cabeza, de pieza media y defecto de cola. Un espermatozoide con un único defecto, por ejemplo de cabeza, es anotado apretando la única tecla correspondiente. Sin embargo, si un espermatozoide tiene defecto de pieza media y cola, se presionan ambas teclas al mismo tiempo, y si un espermatozoide tiene defecto de cabeza, pieza media y cola se presionan las tres teclas al mismo tiempo, de esta forma se contaran los 3 defectos en un solo espermatozoide. Fig 9. Kit de tinción rápida EspermaForm para el análisis de la morfología de los espermatozoides. 20
1) 2) Fig 10. 1) Espermatozoides con morfología normal. 2) Espermatozoides con defectos de A) Cabeza, B) Pieza media, C) Cola. Algunos presentan más de un defecto. Interpretación y reporte de resultados: La morfología se valora al contar 200 espermatozoides en diferentes campos elegidos al azar y se clasifican en 4 grupos de acuerdo a la siguiente tabla. Tabla 4. Criterios de clasificación para la Morfología Espermática. A B C D NORMALES DEFECTO DE CABEZA DEFECTO DE PIEZA INTERMEDIA DEFECTO DE FLAGELO Otros tipos celulares.- El semen contiene de manera normal células diferentes a los espermatozoides como células epiteliales del tracto uretral, células inmaduras (células de la espermatogénesis) y leucocitos, sin embargo si exceden cierto rango es importante reportarlas porque podrían estar indicando alguna patología. A estas células se les llama redondas y son reportadas como número de otras células por campo. Las bacterias, residuos y detritus, se reportan como escasas, 21
regulares o abundantes, de acuerdo a la concentración encontrada por campo (OMS, 2010). a) Leucocitos.- Con frecuencia se presenta en el semen, pueden ser de origen prostático o de inflamación de las glándulas accesorias, la leucospermia se define como >1x10 6 leucocitos/ml y se asocia con tasas más bajas de fertilidad, tanto de forma espontánea como en inseminación intrauterina, además hay que descartar una infección aunque en la mayoría de los casos no existen signos de esta o de respuesta inmune. b) Eritrocitos.- Su presencia en el semen puede ser indicador, aunque en pocas ocasiones, de alguna patología. c) Células epiteliales.- Escamosas, cubicas y transicionales generalmente están presentes en bajo número. Su presencia no se ha relacionado con alguna patología. d) Células inmaduras.- Células prevenientes de la espermatogénesis que no completaron su ciclo normal, provenientes del epitelio seminífero. Puede ser indicativo de daño testicular e) Bacterias.- Su presencia en grandes cantidades se asocia con algún tipo de infección, por lo que no se deben encontrar cantidades importantes en el semen, pero su presencia en cantidad moderada es normal. f) Residuo.- Incluye pequeños residuos de citoplasma nucleado de la cabeza del espermatozoide u otros restos celulares. En el semen siempre existe residuos, el encontrar residuo moderado no es necesariamente normal. Sin embargo en abundancia puede ser anormal. Es muy raro no encontrar residuos en el semen. Soluciones: Se emplea la misma tinción usada para el conteo de morfología o se toma una alícuota de 10 µl y se valora a un objetivo de 40x. Procedimiento: Para diferenciar las células, se puede utilizar la tinción de EspermaForm utilizada para evaluar la morfología. La evaluación también puede 22
ser realizada utilizando el Hemocitómetro de manera simultánea cuando se avalúa la concentración espermática, o evaluando 100 campos en preparaciones pre teñidas. En el hemocitómetro se realiza con la siguiente fórmula: C = NxS/100. Donde C= Cantidad celular en millones, N= Cantidad de un tipo celular dado (leucocitos, eritrocitos, etc.) encontrado en el conteo y S= Cantidad de espermatozoides en millones/ml encontrado en el conteo. Fig 11. Muestra de semen con presencia de A) Espermátides, B) Leucocitos. Fig 12. Muestra de semen con presencia se eritrocitos. Fig 13. Muestra de semen con presencia de una célula epitelial Fig 14. Muestra de semen con presencia de espermatogonia. 23
Interpretación de resultados: Un eyaculado normal debe tener menos de 5 x 10 6 células redondas por ml y el número de leucocitos debe ser de < 1 x 10 6 /ml. Cuando se encuentran alterados algunos parámetros microscópicos en una muestra de semen, lo más frecuente es encontrar una combinación de anomalías en el recuento, la morfología y la movilidad, lo cual se denomina oligoastenoteratozoospermia. Mientras que cuando todos los parámetros son caen dentro de los valores de referencia se denomina normozoospermia (Remohí, 2012). Análisis de fragmentación de ADN por el ensayo de difenilamina. Soluciones PBS : 10 mm de fosfato de sodio, 150 mm de NaCl, ph 7.4. TCA: 5% y 10%, diluir en agua bidestilada. Buffer de lisis: Tris-HCl 5 mm, EDTA 20 mm ph 8.0, y Triton X-100 0.5%. Buffer TE: 1 mm de EDTA a ph 8.0, 10 mm de Tris. Solución de difenilamina (DPA): diluir 1.5 gr de difenilamina en 100 ml de ácido acético y añadir 1.5 ml de H2SO4 (almacenarlo en la obscuridad). El reactivo es estable hasta por 3 meses a 4 C sin acetaldehído. Antes de usar se añade el acetaldehído en un cuarto frio para una concentración final de 16 µg/ml. Procedimiento 1 Utilizar 2.5x10 6 células en 1 ml de medio mr1ecm. 2 Incubar con las diferentes condiciones experimentales para inducir daño al ADN (paso opcional como control de daño) 3 Centrifugar a 250 g a por 10 minutos para empaquetar a las células. 4 Resuspender en 1ml de PBS y centrifugar nuevamente a 250 g a por 10 minutos para empaquetar a las células 24
5 Resuspender el pellet celular en 1 ml de buffer de lisis frio, pasando por la punta de la micropipeta por lo menos 5 veces. 6 Incubar sobre cama de hielo durante 30 minutos. 7 Centrifugar el lisado a 13 000 g a 4 C por 15 minutos. 8 ransferir todo el sobrenadante sin turbar con una micropipeta (ADN oligosomal) aproximadamente de 1.0 ml a un microtubo (transferir con cuidado). 9 Resuspender el pellet que contiene al ADN de alto peso molecular en 1 ml de TE. 10 Añadir a cada tubo 0.5 ml de TCA al 20% e incubar por 10 minutos (PROBAR TIEMPOS 10, 30 Y 60 MINUTOS) en un cuarto a temperatura ambiente. 11 Centrifugar a 500 g a 4 C por 15 minutos y descartar el sobrenadante. 12 Resuspender los precipitados en 0.7 ml de TCA al 5%. 13 Hervir a 100 C por 15 minutos (Nota tener el agua lista) y después enfriar en un cuarto a temperatura ambiente. 14 Centrifugar cada tubo a 300 g a 4 C por 15 minuto). 15 Transferir 0.5 ml del sobrenadante con micropipeta sin turbar el precipitado a un nuevo tubo de vidrio. 16 Añadir 1 ml de reactivo de difenilamina a cada tubo (pellet y sobrenadante) e incubar toda la noche a 30 C o 16 horas. 17 Medir la absorbancia a 600 nm. 18 Aplicar la fórmula: Fragmentacion de ADN = OD600 de sobrenadante (OD600 de sobrenadante + OD600 de pellet) X 100 25
Bibliografía: Chenoweth, P.J.(1997). Bull libido/serving capacity. Vet Clin North Am Food Anim Pract, 13(2): 331-44. OMS. (2002). Manual de Laboratorio de la OMS para el examen del semen humano y de la interacción entre el semen y el moco cervical. Editorial Panamericana. 4ª edición. Madrid, España. 1-32. Remohí, J., Bellever, J., Matorras, R., Ballesteros, A. & Pellicer, A. (2012). Manual práctico de Esterilidad y Reproducción Humana. 4º edición. Editorial Medica Panamericana. España. WHO. (2010). Laboratory manual for the Examination and processing of human semen. 5ª edición. 17-30, 56-58. 26
VALORES DE REFERENCIA Valores de referencia y terminología para el diagnóstico de un análisis de semen de acuerdo al Manual de Laboratorio para la Examinación y Procesamiento del semen humano de la Organización Mundial de la Salud del 2010. VARIABLES MACROSCÓPICAS LIMITES DE REFERENCIA Volumen >=1.5 ml Color Grisáceo a ligeramente amarillento Coagulo Presente Licuefacción 60 minutos Viscosidad Normal ph 7.2-8.0 VARIABLES MICROSCÓPICOS LIMITES DE REFERENCIA Concentración. 15 x 10 6 espermatozoides./ml Cuenta total. >39 x 10 6 espermatozoides. Motilidad total (Progresivos y no >=40% progresivos) Motilidad progresiva >=32 % Viabilidad >=58% vivos Morfología >=4% Leucocitos < 1 x 10 6 /ml Otros Tipos Celulares Valores Normales Células inmaduras < 5 por campo Bacterias Escasas Aglutinación. < 10% TERMINOLOGIA VARIABLE Aspermia No hay eyaculado Hipospermia < 1.5 ml Oligozoospermia < 15 x 10 6 espermatozoides/ml Azoospermia Ausencia de espermatozoides Astenozoospermia < 40% (Categorías A y B) Teratozoospermia Necrozoospermia Oligoastenoteratozoospermia < 5% espermatozoides normales < 58% de viabilidad Perturbación de tres variables. 27
Laboratorio de Biología de la Reproducción, Escuela de Biología BUAP. ANDROLOGÍA ANÁLISIS DE SEMEN Paciente: Edad: Fecha: Valores de referencia de acuerdo al Manual de la OMS para el examen de semen humano y de la interacción entre el semen y el moco cervical. Editorial Panamericana, 5ta edición, 2010. Días de abstinencia: 3-7 Aspecto: Licuefacción: Viscosidad: Observaciones: Diagnóstico del Laboratorio: ANÁLISIS MACROSCÓPICO VALORES DE REFERENCIA Normal (blanco, gris blanco opalescente o ligeramente amarillenta) Anormal (colores distintos) 15 a 60 minutos Normal (gotas definidas) Disminuida (consistencia de agua) Aumentada (filancia >2 cm) >1.5 ml Volumen: ph: 7.2-8 ANÁLISIS MICROSCÓPICO Motilidad A: B: C: A + B: >= 40 % Concentración: Concentración Total: Vitalidad >= 58 % Aglutinación < 5 % Agregación < 5 % Otras células Leucocitos: Eritrocitos: Céls. Epiteliales: Céls. Germinales: Detritus Celulares: Bacterias: Morfología Normales: Anormales: Defectos de cabeza: Defectos de pieza media: Defectos de flagelo: >= 15 mill./ml >= 39 mill./eyaculado - - < 5 céls/campo - - _ Escasa (+) _ Moderadas (++) Abundantes (+++) >= 4 % 28