Uso del Nucleocounter en los centros de inseminación artificial Jornada de CIAs (ANPS) Control de calidad seminal Rocío Hernández-Gil 19 de Octubre de 2016
EVOLUCIÓN DE LOS CIAS Instalaciones - Bioseguridad Automatización de procesos Especialización del personal Actualización de sistemas de evaluación seminal Integración de Sistemas de gestión de Calidad Mejor eficiencia y rentabilidad productiva Calidad seminal garantizada
Centro de inseminación Mejorar la eficiencia Incrementar la productividad Determinación de la CALIDAD Y CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
DIRECTOS CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA Cámaras de recuento celular Citómetría de flujo FACS Count Sistemas CASA Nucleocounter SP-100
CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA INDIRECTOS Visual Colorímetría Coulter counter
CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA Cámaras de recuento Colorimetría Sistemas CASA Nucleocounter La estimación precisa de la concentración espermática de los eyaculados es esencial para uso eficiente de los verracos en los Cias
CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA CÁMARAS DE RECUENTO Requiere seguir un procedimiento laborioso: tiempo y entrenamiento Al ser necesarios varios pasos en el procedimiento, las fuentes de error van aumentando durante el proceso: - Falta de homogeneidad en la toma de muestra del eyaculado - Falta de exactitud en volumen muestra: sin calibración o pipeteo inadecuado - Error en llenado de cámaras - Datos insuficientes Gran variabilidad en réplicas: resultados inconsistentes Altos coeficientes de variación (hasta un 20%)
CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA COLORÍMETRÍA IMPORTANTE o Rango de concentración: escoger una dilución adecuada que permita obtener datos de absorbancia dentro del rango óptimo de lectura del equipo o Curva patrón validada (datos actualizados periódicamente) Medida indirecta de la concentración espermática pero también otros tipos de células, bacterias, proteínas, aglutinación sobreestimación (hasta 30%). El coeficiente de variación es bajo <5%, pero hay factores a tener en cuenta: grado de dilución empleado y concentración de la muestra, errores en la técnica de preparación de la muestra, presencia de otras partículas La exactitud de la medida de concentración dependerá de la fiabilidad curva obtenida de la ecuación de regresión
CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA SISTEMAS CASA o Varios factores pueden afectar a los resultados, concentración del eyaculado, problemas durante el procedimiento (dilución, llenado ), tipo y calidad de cámara de recuento empleada, captura de imágenes inadecuada. o Puede haber cierto grado de subjetividad al seleccionar los campos a evaluar. o Es necesario entrenamiento previo del protocolo establecido. o En caso de muestras muy concentradas: sobreestimación de la concentración, debido a que el sistema puede contabilizar el mismo espermatozoide dos veces por las colisiones espermáticas. o Aglutinaciones espermáticas
NUCLEOCOUNTER
NUCLEOCOUNTER El fundamento del Nucleocounter es un sistema integrado por un microscopio de fluorescencia, una fuente de luz (LED), sistema óptico que incluye lentes, y filtros de excitación y emisión y un sistema de captura y análisis de imágenes. Está diseñado para detectar señales procedente de los nucleos de los espermatozoides
NUCLEOCOUNTER 1. Rotura de membranas espermáticas mediante solución de lisis 2. Tinción con yoduro de propidio incluido en los cassetes de los núcleos de los espermatozoides 3. Captura de imagen de núcleos teñidos tras iluminar con luz fluorescente. 4. Análisis de imagen y recuento de núcleos espermáticos
NUCLEOCOUNTER Qué VENTAJAS aporta este equipo a la estimación de la concentración? Método directo, rápido y sencillo. Sin calibración, ni mantenimiento. No hay interferencias con partículas de gel, restos celulares, o contaminación
NUCLEOCOUNTER Qué VENTAJAS aporta este equipo a la estimación de la concentración? Alta repetibilidad Linealidad Reproducibilidad excelente
NUCLEOCOUNTER Qué VENTAJAS aporta este equipo a la estimación de la concentración? Además: Evaluación de integridad de la membrana (viabilidad espermática)
CONCENTRACIONES (Millones de spz/ml) MACHO CAMARA DE BURKER Colorímetro 1 NUCLEOCOUNTER 1 2 3 4 MEDIA CV(%) MEDIA CV(%) 1 2 MEDIA CV (%) 501 140 140 80 130 122,5 23,4 NO NO 198,9 205,9 202,4 2,4 313 280 310 380 270 310 16,0 85,56 85,56 85,56 0 416,8 440,1 428,45 3,8 310 70 140 180 190 145 37,6 275,18 275,18 275,18 0 307,5 299,8 303,65 1,8 1 820 1180 860 750 902,5 21,1 1054,59 1054,6 1054,6 0 1335 1331 1333 0,2 4 400 540 460 530 482,5 13,6 780,74 801,81 791,28 1,8829 636,7 622 629,35 1,7 212 1180 1240 1310 1340 1268 5,7 1644,41 1665,5 1654,9 0,8998 1751 1802 1776,5 2,0 312 1110 980 950 1240 1070 12,4 717,55 759,68 738,62 4,0333 1459 1450 1454,5 0,4 112 810 730 640 560 685 15,8 338,38 359,44 348,91 4,2681 675,7 652,6 664,15 2,5 113 650 610 750 770 695 11,1 549,03 591,12 570,08 5,2207 1151 1099 1125 3,3 603 730 880 790 990 847,5 13,4 591,12 591,12 591,12 0 1425 1370 1397,5 2,8 315 490 350 490 400 432,5 16,1 464,77 422,64 443,71 6,714 699,8 658,2 679 4,3 147 300 320 370 400 347,5 13,2 190,92 190,92 190,92 0 556,9 529,2 543,05 3,6 129 130 170 120 170 147,5 17,8 NO NO 235,5 242,2 238,85 2,0 305 110 60 100 160 107,5 38,3 NO NO 200,3 188,9 194,6 4,1 132 690 720 730 560 675 11,6 738,61 738,61 738,61 0 1241 1236 1238,5 0,3 327 590 680 570 620 615 7,8 759,68 696,48 728,08 6,1379 1352 1361 1356,5 0,5 312 410 370 460 390 407,5 9,5 296,25 275,18 285,72 5,2145 772 756,5 764,25 1,4 325 180 150 130 80 135 31,1 NO NO 213,8 193,7 203,75 7,0 37 480 500 520 450 487,5 6,1 633 633 633 0 809,8 790,5 800,15 1,7 35 200 270 290 360 280 23,5 149 149 149 0 427,1 445 436,05 2,9 19 270 420 380 340 352,5 18,1 191 212 201,5 7,3694 534,6 505,3 519,95 4,0 200 210 320 240 170 235 27,0 86 86 86 0 358,1 359,1 358,6 0,2 MEDIA 488,6 17,7 531,49 2,3189 756,7 2,4
MACHO CAMARA DE BURKER Colorimetro 2 NUCLEOCOUNTER 1 2 3 MEDIA CV(%) 1 2 3 MEDIA CV(%) 1 2 3 MEDIA CV (%) Y1148 200 190 120 170 25,641 136 147 144 142,33 3,995 171,6 166,6 148,5 162,2333 7,4913 R746 430 340 410 393,3 12,015 332 331 324 329 1,3249 453,6 474,7 452,8 460,3667 2,6977 T437 220 160 220 200 17,321 140 128 138 135,33 4,7506 177,9 183,4 196,9 186,0667 5,2544 Y1903 330 360 250 313,3 18,148 313 312 310 311,67 0,4901 410,6 438,7 429,3 426,2 3,3562 R5471 580 460 490 510 12,245 372 373 379 374,67 1,0105 520,7 500,6 512,5 511,2667 1,9768 R89 280 240 280 266,7 8,6603 254 247 245 248,67 1,9005 326 309 302,7 312,5667 3,856 R745 270 280 350 300 14,53 332 323 332 329 1,5794 405,4 381,6 384,5 390,5 3,3252 T82 280 300 260 280 7,1429 237 230 233 233,33 1,5051 291,2 299,6 296,4 295,7333 1,4336 T1768 280 270 350 300 14,53 265 261 262 262,67 0,7925 354,5 362,4 332,8 349,9 4,3803 W2448 220 140 210 190 22,942 148 148 152 149,33 1,5465 188,5 184,9 169,2 180,8667 5,6742 E7329 260 320 330 303,3 12,481 311 307 305 307,67 0,993 376,2 363,6 378,2 372,6667 2,124 R282 370 440 490 433,3 13,91 397 405 410 404 1,6231 521,3 501,2 513,1 511,8667 1,9745 MEDIA 305 14,964 268,97 1,7926 346,6861 3,6287
CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA Aplicaciones prácticas del NUCLEOCOUNTER Control de concentración espermática de los eyaculados en la producción diaria Evaluación de viabilidad espermática en la conservación Control de calidad final de un % de las dosis producidas: monitorización Validación de equipos / Construcción de curvas patrón
Otros sistemas CV>5% Nucleocounter CV<3%
CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA NUCLEOCOUNTER Sencillez y rapidez de uso Estimación más precisa y objetiva de la concentración: fiabilidad Evaluación de viabilidad espermática (semen conservado) Producción de dosis más homogénea: estandarización de producto Mejora de productividad y rentabilidad económica Sistema de referencia para validación de otros sistemas de evaluación. Monitorización externa de concentración
Muchas gracias