Transcripción en eucariontes
Diferentes tipos de RNA polimerasas 1. RNA Polimerasa I sintetiza RNA ribosomal (rrna) 5.8S, 18S y 28S. 2. RNA Polimerasa II sintetiza RNAs mensajeros (mrna), RNAs pequeños nucleolares (snorna), micro RNAs (mirna), RNAs pequeños interferentes (sirna) y la mayoría de RNAs pequeños nucleares (snrna). 3. RNA polimerasa III sintetiza RNAs de transferencia (trnas), rrna 5S y algunos RNAs pequeños nucleares (snrnas). En plantas hay RNA Polimerasa IV y V involucradas en la síntesis de ciertos sirnas y silenciamiento epigenético.
Promotores eucariontes Clase II (RNA pol II) para mrnas
Factores de transcripción Clase II (TFII) TFIID: TBP (proteína de unión a caja TATA) y factores accesorios TFIIA: Estabiliza la unión de TFIID TFIIB: Ayuda a posicionar al complejo de factores y la RNA pol II sobre el promotor TFIIF: Proporciona la ocupación de +30 pb, tiene actividad de helicasa para abrir la doble cadena en el sitio +1 TFIIE: Une a TFIIH y recluta a la RNA pol II al promotor TFIIH: Complejo de 9 subunidades que se une a la RNA pol II, actividad de cinasa para fosforilar el Dominio Carboxilo Terminal (CTD) de la RNA pol II, actividad de helicasa, actividad de exonucleasa para reparar errores en NER
La unión de TBP a un sitio TATA distorsiona la cadena y permite el reconocimiento del sitio +1 por las tres polimerasas eucariontes
La RNA polimerasa II - 12 subunidades formando un complejo de mas de 500 kda cola que se fosforila (CTD) RNA pol bacteriana
TAFs: Proteínas activadoras o inhibidoras de la transcripción
TFIIs: Factores basales de transcripción (se unen de manera secuencial) TAFs: Factores de transcripción accesorios (facilitan la unión de TFIIs) PIC: Complejo de pre-inicio de la transcripción
Complejo cerrado Complejo abierto
Relevancia de la fosforilación del CTD 1. Pasar de complejo cerrado a complejo abierto 2. Unión de factores para el procesamiento del RNA 3. Escape del promotor G. Orphnides and D. Reinberg (2002) A Unified Theory of Gene Expression. Cell 108: 439-451.
Organización nuclear eucarionte Nucleolo Territorios cromosómicos Fábricas transcripcionales Poros nucleares Complejos ribonucleoprotéicos nucleares
EUCROMATINA VS HETEROCROMATINA B A
Fábricas transcripcionales Chakalova et al., 2005
Fábricas de Transcripción identificadas con fluorouridina Sitios de replicación identificados con Bromo-desoxiuridina Sitios de reparación después de un estrés genotóxico identificados mediante fosforilación de la variante de histona H2AX
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Unidades transcripcionales Clase I (Transcritos por RNA pol I) ARN ribosomal 18S, 28S, 5.8S
Unidades transcripcionales Clase III (Transcritos por RNA pol III) Los promotores de Clase III (RNA pol III) se distinguen por ubicarse dentro de la región que se transcribe (entre +41 y +87) Unidades transcripcionales de trnas y rrna 5S, otros snrnas El complejo de RNA pol III es el mas grande y pesa 700 kda
Inhibidores de la transcripción eucarionte + N H Acridina Actinomicina D L-Pro Sar L-meVal L-Pro Sar L-meVal D-Val L-Thr O D-Val L-Thr O O C C O N NH 2 Se intercala entre bases G y C O CH 3 CH 3 O
a-amanitina Es un octapéptido bicíclico que se obtiene del hongo Amanita phalloides. Inhibe la transcripción de la RNA polimerasa II eucarionte.
Procesamiento del RNA mrna: solo en eucariontes trna y rrna: tanto en eucariontes como en procariontes Otros RNAs no codificantes: tanto en eucariontes como en procariontes
1. mrna Adición de Cap (7 m GpppN) en el extremo 5 1) La fosfatasa remueve un fosfato del 5 2) Una guanil transferasa agrega GMP 3) Una metil transferasa agrega el grupo metilo
Para qué el Cap? 1. Le da estabilidad al mrna en el extremo 5 (evita corte por exonucleasas de ARN). 2. Permite la exportación nuclear del mrna, o en su caso la retención en el núcleo. 3. Permite el inicio de la traducción en mrnas eucariontes. 4. Permite la degradación de mrnas cuando están las señales celulares apropiadas.
Remoción de intrones Reacción de corte en la unión exón-intrón a) Catalizada por el propio mrna
Existen secuencias específicas en los límites exón-intrón R= purinas Y= pirimidinas
b) Catalizada por partículas ribonucleoprotéicas (snrnps) snrnps: U1, U2, U4, U5, U6 BBP U2AF El apareamiento de las moléculas de snrna requiere complementación de bases con el pre-mrna La molécula de RNA es responsable del corte: RIBOZIMA
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Puede existir corte alternativo de intrones/exones en el pre-mrna: Fuente de variabilidad genética, dependiendo de tejido, desarrollo, etc. Un gen 5 mrnas maduros 5 proteínas diferentes
Poliadenilación (terminación de la transcripción)
Proteínas específicas reconocen las secuencias de poliadenilación
El ARN es cortado y la enzima Poli-A polimerasa (PAP) agrega A s
Proteínas de unión al poli-a se unen al extremo 3 hasta que el mensaje sale del núcleo
La elongación está acoplada al procesamiento
La salida del mrna es coordinada por proteínas unidas a la molécula
El receptor de exporte nuclear dirige la salida
Procariontes 1. Todas las especies de RNA son sintetizadas por la misma especie de RNA polimerasa. 2. El mrna se traduce durante la transcripción. 3. Los genes son segmentos contiguos de DNA alineados ininterrumpidamente con el RNA traducido a proteína. 4. Los mrnas son frecuentemente policistrónicos 5. La RNA polimerasa solo requiere a sigma para reconocer el promotor 6. No hay procesamiento posttranscripcional del mrna Eucariontes 1. Hay 3 diferentes RNA polimerasas responsables de la transcripción de diferentes moléculas de RNA 2. El mrna es procesado antes de ser transportado a citoplasma (adición de CAP, cola de polia, remoción de intrones 3. Los genes frecuentemente se interrumpen por intrones. 4. Los mrnas son monocistrónicos 5. Las RNA polimerasas requieren múltiples factores adicionales para reconocer el promotor llamados TF basales. 6. El mrna sufre procesamiento extenso durante y después de la transcripción