New igenatal TM New & Optimized Genomic DNA Extraction Kit (FOR 50 EXTRACTIONS) ilab Tech SL, Gustavo Fernández Balbuena 11, 28002 Madrid Tel: +34 91 510 29 99 Fax: +34 91 51913 26
HIGH QUALITY GENOMIC DNA EXTRACTION KIT FROM PRENATAL SAMPLES...3 General instructions:... 3 Kit contents... 3 Technical considerations... 3 Identification of the substance/mixture... 4 SOLUTION A...4 SOLUTION B...4 SOLUTION C...4 SOLUTION D...5 SOLUTION E...6 SOLUTION F...6 Storage... 6 Procedure recommendations... 6 DNA Quantity and quality... 6 Concentration...6 Ratio 260/230 and 260/280...6 Genomic DNA isolation procedure for amniotic fluid samples... 8 Genomic DNA isolation procedure for chorionic villi samples... 10 KIT DE EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO DE ALTA CALIDAD A PARTIR DE MUESTRAS PRENATALES...12 Consideraciones generales... 12 Contenido del Kit... 12 Consideraciones técnicas... 13 Identificacion de la sustancia o preparado... 13 SOLUCIÓN A...13 SOLUCION B...13 SOLUCIÓN C...13 SOLUCIÓN D...14 SOLUCIÓN E...15 SOLUCIÓN F...15 Condiciones de almacenamiento... 15 Recomendaciones del protocolo... 16 Cantidad y Calidad del ADN... 16 Concentración...16 Ratios 260/230 y 260/280...16 Protocolo de extracción de ADN genómico a partir de líquido amniótico... 18 Protocolo de extracción de ADN genómico a partir de vellosidad corial... 20 2
HIGH QUALITY GENOMIC DNA EXTRACTION KIT FROM PRENATAL SAMPLES General instructions: To ensure proper use and handling, please, READ THE ENTIRE MANUAL BEFORE using the Kit. Labelling the top of each vial upon arrival of the kit is highly recommended to avoid mistakes. Fluorometric based method should be used in order to get accurate and reliable concentration readings. For Nanodrop measurement, the extraction procedure could be done in parallel in one more tube without sample (without liquid or villi) to be used after extraction, like a negative control. This DNA Kit has been designed for research use, from minimal amounts of amniotic fluid or chorionic villi. The approximate processing time is 90 minutes (for amniotic fluid samples), and 120 minutes (for chorionic villi samples). Kit contents 20 extractions kit 50 extractions kit Solution A 7 ml 16 ml Solution B 2.5ml 6 ml Solution C 850µl 2.5 ml Solution D 10 ml 22 ml Solution E 12 ml 25.5 ml Solution F 1 ml 3 ml Technical considerations This Kit was specially designed with the aim of obtaining, in a reproducible manner, high quality genomic DNA for subsequent uses in genetic diagnostic procedures. Purified genomic DNA has been successfully tested specifically, both in quality and in quantity, for the diagnosis of chromosomal anomalies using prenatal BoBs TM and Constitutional Chip technologies (Perkin Elmer TM ). 3
Even with minimal amounts of starting material (2ml of amniotic fluid or 1-5mg of chorionic villi) high yield (approximately >10µgr/mg villi sample or >1µgr/ml of amniotic fluid) can be guaranteed. Likewise, the quality of the obtained DNA is very high and with a high electrophoretic mobility showing very low contamination and fragmentation rate. The following features: high yield, low contamination by protein and another macromolecules, minimal fragmentation and short processing time, and low amounts of starting required allow purified genomic DNA to be used downstream even for complex genetic studies (RFLP, Southern Blot, acgh, etc.) either immediately or for later use. Identification of the substance/mixture SOLUTION A Non Hazardous SOLUTION B Non Hazardous SOLUTION C: Contains sodium acetate solution 1. HAZARDS IDENTIFICATION a. Classification of the substance or mixture - Classification according to Regulation (EC) No 1272/2008 Eye irritation (Category 2) Not a hazardous substance or mixture according to EC-directives 67/548/EEC or 1999/45/EC. b. Label elements 2. HANDLING a. Precautions for safe handling Avoid contact with skin and eyes. Avoid inhalation of vapour or mist. Normal measures for preventive fire protection. 3. ACCIDENTAL RELEASE MEASURES a. Personal precautions, protective equipment and emergency procedures Use personal protective equipment. Avoid breathing vapors, mist or gas. Ensure adequate ventilation. b. Environmental precautions Do not let product enter drains. 4
c. Methods and materials for containment and cleaning up Soak up with inert absorbent material and dispose of as hazardous waste. Keep in suitable, closed containers for disposal. SOLUTION D: Contains 2-Propanol 1. HAZARDS IDENTIFICATION a. Classification of the substance or mixture - Classification according to Regulation (EC) No 1272/2008 Flammable liquids (Category 2) Eye irritation (Category 2) Specific target organ toxicity - single exposure (Category 3) - Classification according to EU Directives 67/548/EEC or 1999/45/EC Highly flammable. Irritating to eyes. Vapours may cause drowsiness and dizziness. b. Label elements 2. HANDLING a. Precautions for safe handling Avoid contact with skin and eyes. Avoid inhalation of vapour or mist. Keep away from sources of ignition - No smoking.take measures to prevent the build up of electrostatic charge. b. Skin protection Handle with gloves. Gloves must be inspected prior to use. Use proper glove removal technique (without touching glove's outer surface) to avoid skin contact with this product. Dispose of contaminated gloves after use in accordance with applicable laws and good laboratory practices. Wash and dry hands. 3. ACCIDENTAL RELEASE MEASURES a. Personal precautions, protective equipment and emergency procedures Use personal protective equipment. Avoid breathing vapors, mist or gas. Ensure adequate ventilation. Remove all sources of ignition. Evacuate personnel to safe areas. Beware of vapours accumulating to form explosive concentrations. Vapours can accumulate in low areas. b. Environmental precautions Prevent further leakage or spillage if safe to do so. Do not let product enter drains. 5
SOLUTION E Non Hazardous SOLUTION F Non Hazardous Storage Keep container tightly closed in a well-ventilated place. All buffers can be stored at room temperature (15-25ºC). If temperature exceeds 25ºC, is recommended to storage at least solution A and C, in a cool place (2-8ºC). Remember, if stored at (2-8ºC) solutions should be homogenized and equilibrated to room temperature before use. All buffers are stable for up to 6 months when stored at room temperature (15-25ºC) but only until the kit expiration date. Procedure recommendations - Samples The extraction procedure can be performed from fresh or cultured amniotic fluid and from fresh or cultured chorionic villi. Althought extraction starts with a larger amount of amniotic fluid it is not necessary to increase the solutions volume, however we recommend reducing the speed of the first centrifugation. - Solutions Gently homogenize every solution before use. - Agitation It is important not to exceed G-force specified in agitation steps, in order to avoid DNA fragmentation. - Dry It is recommended not overdrying the final pellet in order to avoid a difficult DNA solubilization. Add F solution when the pellet starts drying. DNA Quantity and quality Concentration Fluorometric based method should be used in order to get accurate and reliable concentration readings. Ratio 260/230 and 260/280 DNA quality can be determined based on 260/230 and 260/280 ratios, however, with small DNA amount ratios may change without affecting DNA quality. 6
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Genomic DNA isolation procedure for amniotic fluid samples 1. Take at least 2 ml of amniotic fluid fresh or 50000-150000 cells of cultured amniotic fluid, previously re-suspended, and put it into a 2 ml eppendorf type tube (preferably safe lock). Note: Yield depends on gestation week of the fetal material from which the sample was sourced. The kit has been tested to yield >2ugr using starting materials of at approximately 2 ml of amniotic fluid obtained from fetal amniocentesis at 15 weeks of gestation or more. 2. Centrifuge at 11200g (approximately 12000rpm) for 5 minutes at room temperature. 3. Discard the supernatant with care. 4. Add 300µl of Solution A and vortex gently Note: Mix gently before addition if Solution A was stored at 4ºC 5. Incubate at 55ºC for 30 minutes. Use of a horizontal shaker (at 100-150rpm) is optional but preferable. 6. Cool the samples (from step 5) by incubating approximately 5 minutes on ice or refrigerator. 7. Add 100µl of Solution B and vortex gently. 8. Centrifuge at 17000g (approx. 13500 rpm) for 10 min., at room temperature 9. Carefully pipet the supernatant into a sterile 1.5 ml eppendorf type tube, discarding the remaining pellet. 10. Add 40µl of Solution C and 400µl of Solution D. 11. Shake slightly by inverting the tube several times until a homogenous solution is observed. 12. Incubate the tube at room temperature for 10 minutes in a vertical position 13. Centrifuge at 11200g (12000rpm) for 5min at room temperature Note: Usually, a little pellet forms. 14. Discard the supernatant with care. 15. Add 500µl of Solution E. 16. Centrifuge at 11200g (12000rpm) for 5min at room temperature. 17. Discard the supernatant with care and place the tube (containing the pellet) open and upside down, over a filter paper, for 5-10 minutes. Note: Do not completely dry the pellet 8
18. Add 30µl of Solution F and pipet up and down carefully to resuspend the genomic DNA. 19. Optional, incubate the tube at 37ºC for 30 minutes to help DNA solubilisation. 20. Use immediately or store at 4ºC (if used during the next 48 hours) or at -20ºC (for longer storage) 9
Genomic DNA isolation procedure for chorionic villi samples 1. Take a small amount of chorionic villi (1-5 mg) or 50000-150000 cells of cultured chorionic villi and place it into a 2 ml eppendorf type tube (preferably safe lock). 2. Add 300µl of Solution A and vortex gently. If you start with cell culture first centrifuge at 11200g (approximately 12000rpm) for 5min at room temperature and discard the supernatant with care. Then add 300µl of solution A. Note: Mix gently before addition if Solution A was stored at 4ºC. 3. Incubate at 55ºC for 60 minutes. Use of a horizontal shaker (at 100-150rpm) is optional but preferable 4. Cool the samples (from step 5) by incubating approximately 5 minutes on ice or refrigerator. 5. Add 100µl of Solution B and vortex gently. 6. Centrifuge at 17000g (approx. 13500 rpm) for 10 min., at room temperature. 7. Carefully pipet the supernatant into a sterile 1.5 ml eppendorf type tube, discarding the remaining pellet. 8. Add 40µl of Solution C and 400µl of Solution D. 9. Shake slightly by inverting the tube several times until a homogenous solution is observed. 10. Incubate the tube at room temperature for 10min in a vertical position. 11. Centrifuge at 11200g (12000rpm) for 5 minutes, at room temperature. Note: Usually a little pellet forms. 12. Discard the supernatant with care. 13. Add 500µl of Solution E. 14. Centrifuge at 11200g (12000rpm) for 5 minutes, at room temperature. 15. Discard the supernatant with care and place the tube (containing the pellet) open and upside down, over a filter paper, for 5-10 minutes. Note: Do not completely dry the pellet 16. Add 30-50µl of Solution F and pipet up and down carefully to resuspend the genomic DNA. 17. Optional, incubate the tube at 37ºC for 30 minutes to help DNA solubilisation. 10
18. Use immediately or store at 4ºC (if to be used during the next 48 hours) or at -20ºC (for longer storage). 11
KIT DE EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO DE ALTA CALIDAD A PARTIR DE MUESTRAS PRENATALES (LÍQUIDO AMNIÓTICO Y VELLOSIDAD CORIAL). Consideraciones generales LEER TODO EL PROTOCOLO ANTES de empezar. Para evitar errores en el uso de las soluciones del kit, se recomienda rotular los viales de cada solución en la tapa, a la llegada del mismo. Se recomienda cuantificar la concentración de ADN obtenido por fluorimetría. Si se va a medir la muestra en Nanodrop, para obtener un valor exacto de concentración, se recomienda llevar en paralelo una extracción sin muestra (sin líquido o vellosidad) que sirva de control negativo. Mantener las soluciones bien cerradas y en una zona bien ventilada. Las soluciones pueden almacenarse a temperatura ambiente (15-25ºC), en el caso de que la temperatura supere los 25ºC es recomendable mantener, al menos las soluciones A y C en un lugar frío (2-8ºC). Recuerde que si se almacenan las soluciones en un lugar refrigerado se deben homogeneizar y atemperar antes de su uso. Este kit está indicado para su uso en investigación, a partir de mínimas cantidades de líquido amniótico o vellosidad corial. El tiempo aproximado de procesamiento es de 90 minutos a partir de líquido amniótico y de 120 minutos en el caso de vellosidad corial. Contenido del Kit Kit 20 extracciones Kit 50 extracciones Solución A 7 ml 16 ml Solución B 2.5ml 6 ml Solución C 850µl 2.5 ml Solución D 10 ml 22 ml Solución E 12 ml 25.5 ml Solución F 1 ml 3 ml 12
Consideraciones técnicas Este kit ha sido especialmente diseñado con el objetivo de obtener, de forma reproducible, ADN genómico de alta calidad para su uso posterior en procedimientos de diagnóstico genético. En concreto, el ADN genómico obtenido (tanto en cantidad como en calidad) ha sido eficazmente testado en el diagnóstico de anomalías cromosómicas usando las tecnologías BoBs y Constitutional Chip (Perkin Elmer R ). En cantidades mínimas de partida de líquido amniótico (2ml) y de vellosidad corial (1-5mg) se asegura un rendimiento alto (aprox. >10µgr/mg vellosidad y >1µgr/ml de líquido amniótico). Así mismo, la calidad del ADN obtenido es muy alta con una movilidad electroforética alta indicando la baja contaminación y fragmentación del mismo. Estas características genéricas de alta concentración, baja contaminación por proteínas y otras macromoléculas y mínima fragmentación, junto a la rapidez del procedimiento y mínima muestra de partida, hacen que el ADN genómico obtenido pueda ser usado directamente para estudios genéticos complejos (RFLP, Southern Blot, acgh, etc.) o bien, conservado para un análisis posterior. Identificacion de la sustancia o preparado SOLUCIÓN A No peligrosa SOLUCION B No peligrosa SOLUCIÓN C: Contiene acetato de sodio 1. IDENTIFICACIÓN DE LOS PELIGROS a. Identificación de la sustancia o preparado. - Clasificación de acuerdo con la regulación (EC) No 1272/2008 [EU-GHS/CLP] Irritación ocular (Categoría 2) No es una sustancia o preparado peligroso, de acuerdo con las directivas comunitarias 67/548/EEC or 1999/45/EC. b. Etiquetado 13
2. MANIPULACIÓN Y ALMACENAMIENTO a. Precauciones para una correcta manipulación Evitar contacto con piel y ojos. Evitar la inhalación de gases y vapores. Tomar las medidas normales en protección contra incendios. b. Almacenamiento Almacenar en un lugar fresco. Conservar el envase herméticamente cerrado en un lugar seco y bien ventilado. 3. MEDIDAS EN CASO DE VERTIDO ACCIDENTAL a. Equipo de protección del personal y procedimientos de emergencias Usar equipo de protección. Evite respirar los gases o vapores que desprenda Asegúrese de que hay buena ventilación b. Información medioambiental No dejar que el producto entre en el sistema de alcantarillado c. Material y métodos de contención y limpieza Absorber con un material inerte y tirar a contenedores apropiados y cerrados para su eliminación. SOLUCIÓN D: Contiene 2-Propanol 1. IDENTIFICACIÓN DE LOS PELIGROS a. Identificación de la sustancia o preparado. - Clasificación de acuerdo con el Reglamento (CE) 1272/2008 [EU- GHS/CLP] Líquidos inflamables (Categoría 2) Irritación ocular (Categoría 2) Toxicidad específica en determinados órganos - exposición única (Categoría 3) - Clasificación de acuerdo con las Directivas de la UE 67/548/CEE ó 1999/45/CE Fácilmente inflamable e irritante. La inhalación d los vapores puede provocar somnolencia y vértigo. b. Etiquetado 14
2. MANIPULACIÓN a. Precauciones para una correcta manipulación Evítese el contacto con los ojos y la piel. Evitar la inhalación de vapor o neblina. Conservar alejado de toda llama o fuente de chispas - No fumar. Tomar medidas para impedir la acumulación de descargas electrostáticas. b. Protección de manos Manipular con guantes. Los guantes deben ser inspeccionados antes de su uso. Utilice la técnica correcta de quitarse los guantes (sin tocar la superficie exterior del guante) para evitar el contacto de la piel con este producto. Deseche los guantes contaminados después de su uso, de conformidad con las leyes aplicables y buenas prácticas de laboratorio. Lavar y secar las manos. 3. MEDIDAS EN CASO DE VERTIDO ACCIDENTAL a. Equipo de seguridad el personal y procedimiento de emergencia Utilícese equipo de protección individual. Evitar respirar los vapores, la neblina o el gas. Asegúrese una ventilación apropiada. Retirar todas las fuentes de ignición. Evacuar el personal a zonas seguras. Tener cuidado con los vapores que se acumulan formando así, concentraciones explosivas. Los vapores pueden acumularse en las zonas inferiores. b. Información medioambiental Impedir nuevos escapes o derrames si puede hacerse sin riesgos. No dejar que el producto entre en el sistema de alcantarillado. SOLUCIÓN E No peligroso. SOLUCIÓN F No peligroso. Condiciones de almacenamiento Conservar las botellas, bien cerradas, en lugar ventilado. Todas las soluciones se pueden almacenar a temperatura ambiente (15-25ºC). Si la temperatura es superior a 25ºC se recomienda almacenar, al menos las soluciones A y C en un lugar refrigerado (2-8ºC) 15
Si se han conservado las soluciones en frío, éstas deberán ser homogeneizadas y atemperadas a temperatura ambiente antes de su uso. Todas las soluciones son estables durante 6 meses cuando se almacenan a temperatura ambiente (15-25 º C), siempre y cuando no se exceda la fecha de caducidad del kit. Recomendaciones del protocolo - Muestras La extracción puede hacerse a parir de líquido amniótico fresco o previamente cultivado; así como a partir de vellosidad corial fresca o previamente cultivada. Aunque la extracción se haga a partir de un volumen mayor de líquido amniótico no es necesario aumentar el volumen de las soluciones. Sin embargo se recomienda disminuir la velocidad de la primera centrifugación. - Soluciones Homogenizar suavemente cada solución antes de usar. - Agitación Es importante no exceder las rpm (o fuerza-g) especificadas en los pasos de agitación, con el fin de evitar posible fragmentación del ADN. - Secado Es importante no excederse en el secado final del pellet obtenido, ya que podría dificultar la solubilización del ADN. Añadir la solución F cuando el pellet empiece a secarse. Cantidad y Calidad del ADN Concentración Para obtener valores de concentración reales y fiables, se recomienda utilizar métodos fluorimétricos Ratios 260/230 y 260/280 La calidad del ADN obtenido se puede determinar basándose en los ratios 260/230 y 260/280, no obstante, con concentraciones muy bajas de ADN los ratios pueden variar sin que ello indique una menor calidad del ADN. 16
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Protocolo de extracción de ADN genómico a partir de líquido amniótico. 1. Pipetear 2 ml de líquido amniótico fresco o 50000-150000 células de líquido cultivado, previamente resuspendido, en un tubo tipo eppendorf de 2ml (preferible safe lock) Nota: En función de la semana de gestación la concentración final podrá fluctuar. Se ha comprobado de forma reproducible la obtención de >2ugr a partir de 2ml de Líquido Amniótico de 15 semanas o más. 2. Centrifugar a 11200g (aproximadamente 12000rpm) durante 5 minutos a temperatura ambiente. 3. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente con la ayuda de una pipeta. 4. Añadir 300µl de Solución A y agitar con vortex suavemente. Nota: si la Solución A se ha guardado a 4ºC, mezclar suavemente antes de añadirla. 5. Incubar a 55ºC durante 30 minutos, preferiblemente en agitación horizontal (100-150rpm). 6. Enfriar las muestras incubando 5 minutos en hielo o en una nevera. 7. Añadir 100µl de Solución B y agitar con vortex unos 15 segundos. 8. Centrifugar a 17000g (aprox. 13500 rpm) durante 10 minutos a temperatura ambiente. 9. Pipetear el sobrenadante a un nuevo tubo tipo eppendorf estéril normal de 1,5 ml. Desechar el pellet. 10. Añadir 40µl de Solución C y 400µl de Solución D. 11. Agitar suavemente por inversión hasta lograr homogeneidad. 12. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos en posición vertical. 13. Centrifugar a 11200g (12000rpm) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Nota: En la mayoría de los casos es posible observar un pellet pequeño. 14. Eliminar el sobrenadante con cuidado. 15. Añadir 500µl de Solución E. 16. Centrifugar a 11200g (12000rpm) durante 5 minutos a temperatura ambiente. 17. Eliminar el sobrenadante con cuidado y dejar el tubo abierto e invertido sobre un papel de filtro o papel absorbente durante 5-10 minutos. Nota: NO secar totalmente 18
18. Añadir 30µl de Solución F y pipetear arriba y abajo suavemente para solubilizar el ADN. 19. Opcionalmente se puede incubar a 37ºC durante 30 minutos para solubilizar el ADN genómico. 20. Utilizar inmediatamente, o bien, guardar a 4ºC (uso en las siguientes 48 horas) o a -20ºC (para prolongada conservación). 19
Protocolo de extracción de ADN genómico a partir de vellosidad corial 1. Depositar una pequeña cantidad de vellosidad corial (entre 1-5mg) o 50000-150000 células de vellosidad cultivada, en un tubo tipo eppendorf de 2ml (preferible tipo safe lock). Nota: En la Figura 1 se muestra el volumen que representa una cantidad ideal. Cantidades superiores a la indicada pueden generar ADN de calidad inferior. 2. Añadir 300µl de Solución A y agitar con vortex suavemente. Si se parte de cultivo celular, centrifugar a 11200g (12000rpm) durante 5minutos a temperatura ambiente, descartar el sobrenadante con cuidado y añadir 300µl de solución A. Nota: si la Solución A se ha guardado a 4ºC, mezclar suavemente antes de añadirla 3. Incubar a 55ºC durante 60 minutos, preferiblemente en agitación horizontal (100-150rpm). 4. Enfriar las muestras incubando 5 minutos en hielo o en una nevera. 5. Añadir 100µl de Solución B y agitar con vortex unos 15 segundos. 6. Centrifugar a 17000g (aprox. 13500 rpm) durante 10 minutos a temperatura ambiente. 7. Pipetear el sobrenadante a un nuevo tubo tipo eppendorf estéril normal de 1,5 ml. Desechar el pellet. 8. Añadir 40µl de Solución C y 400µl de Solución D. 9. Agitar suavemente por inversión hasta lograr homogeneidad. 10. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos en posición vertical. 11. Centrifugar a 11200g (12000rpm) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Nota: En la mayoría de los casos es posible observar un pellet pequeño. 12. Eliminar el sobrenadante con cuidado. 13. Añadir 500µl de Solución E. 14. Centrifugar a 11200g (12000rpm) durante 5 minutos a temperatura ambiente. 15. Eliminar el sobrenadante con cuidado y dejar el tubo abierto e invertido sobre un papel de filtro o papel absorbente durante 5-10 minutos Nota: NO secar totalmente 16. Añadir 30-50µl (dependiendo del tamaño del pellet) de Solución F pipeteando suavemente para solubilizar el ADN. 20
17. Opcionalmente se puede incubar a 37ºC durante 30 minutos para solubilizar el ADN genómico. 18. Utilizar inmediatamente, o bien, guardar a 4ºC (uso en las siguientes 48 horas) o a -20ºC (para prolongada conservación). 21