CAPITULO II FERMENTACIONES MICROBIANAS 2.1. VÍA DE EMBDEN-MEYERHOF-PARNAS La glucólisis, también denominada glicólisis o ruta de Embden-Meyerhoff, es la secuencia metabólica en la que se oxida la glucosa. Consiste de nueve reacciones enzimáticas que producen dos moléculas de piruvato y dos equivalentes reducidos de NADH, los que, al introducirse en la cadena respiratoria, producirán cuatro moléculas de ATP. Cuando hay ausencia de oxígeno, la glucólisis es la única vía que produce ATP en los animales. Los organismos primitivos se originaron en un mundo cuya atmósfera carecía de O2 y, por esto, la glucólisis se considera como la vía metabólica más primitiva. Está presente en todas las formas de vida actuales. Es la primera parte del metabolismo energético y en las células eucariotas ocurre en el citoplasma. En esta fase, por cada molécula de glucosa se forman 2 ATP y 2 NADH. La reacción global de la glucólisis es: Glucosa + 2 NAD+ + ADP + 2 Pi 2 NADH + 2 Piruvato + 2 ATP + 4 H+ 2.1.1. Proceso Bioquímico de la Glucólisis La degradación escalonada de la glucosa se denomina glucólisis y puede ser dividida en dos partes principales. La primera parte es una serie de reacciones preparatorias que no implican oxido reducción y que conducen a la producción del intermediario clave, el gliceraldehído3-fosfato. En la segunda parte tienen lugar reacciones de oxidación-reducción, se produce energía originada en el enlace fosfato rico en energía en forma de ATP, y son liberados los productos de fermentación, el etanol y el C02. (Figura Nº 2.1). 56
Figura Nº 2.1 Vía de Embden-Meyerhoff dividida en dos partes principales Fuente: (Gómez G.J. y C. Nieto., 2002). 57
Esta vía bioquímica se denomina a veces vía de Embden-Meyerhoff, del nombre de dos de sus descubridores. Inicialmente, la glucosa es fosforilada por el ATP, produciendo glucosa-6-fosfato. A menudo, previamente a la oxidación tienen lugar reacciones de fosforilación de este tipo. Cuando el ATP se convierte en ADP, se disipa energía porque el enlace orgánico del fosfato en la glucosa-6-fosfato se encuentra a un nivel energético inferior al que estaba el enlace fosfato del ATP, (la energía utilizada en este paso será recuperada posteriormente en la secuencia de la reacción). La fosforilación inicial de la glucosa activa la molécula para posteriores reacciones. Una isomerización y otra fosforilación conducen a la producción de la fructosa-1,6difosfato, que es un producto intermediario clave en el proceso de degradación. La enzima aldolasa cataliza ahora la escisión de la fructosa-1,6-difosfato en dos moléculas tricarbonadas, el gliceraldehído-3-fosfato y el fosfato de dihidroxiacetona. Nótese que todavía no ha habido ninguna oxidación, puesto que todas las reacciones se han realizado sin ninguna transferencia electrónica, aunque se han utilizado dos enlaces fosfato ricos en energía procedentes del ATP. La primera reacción de oxidación se produce en la conversión del gliceraldehído-3fosfato en ácido 1,3-difosfoglicérico. En esta reacción, la coenzima NAD acepta dos electrones y queda convertido en NADH, mientras el fosfato inorgánico se convierte en una forma orgánica. Al contrario que el enlace fosfato orgánico de los fosfatos de hexosa, el nuevo enlace fosfato del ácido difosfoglicérico representa la síntesis de un nuevo enlace fosfato rico en energía. La energía que de otra manera se habría liberado como calor en esta oxidación es así conservada. Las reacciones posteriores mostradas conducen últimamente a la síntesis de ácido piruvico y a la transferencia de la energía de los enlaces fosfato ricos en energía al ADP, formando ATP. Inicialmente se utilizan dos moléculas de ATP para fosforilar el azúcar, sintetizándose después cuatro moléculas (dos por cada fragmento tricarbonado), de tal modo que la ganancia neta es de dos moléculas de ATP por molécula oxidada de glucosa. 58
2.1. 2. Regulación de la Vía de Embden-Meyerhof-Parnas La glucólisis se regula enzimáticamente en los tres puntos irreversibles de esta ruta, esto es, en la primera reacción (G -->G-6P), por medio de la hexoquinasa; en la tercera reacción (F-6P --> F-1,6-BP) por medio de la PFK1 y en el último paso (PEP --> Piruvato) por la piruvato quinasa. La hexoquinasa es un punto de regulación poco importante, ya que se inhibe cuando hay mucho G-6P en músculo. Es un punto poco importante ya que el G-6P se utiliza para otras vías. HQ: Inhibe G-6P La PFK1 es la enzima principal de la regulación de la glucólisis, actúa como una llave de agua, si está activa cataliza muchas reacciones y se obtiene más Fructosa 1,6 bifosfato, lo que permitirá a las enzimas siguientes transformar mucho piruvato. Si está inhibida, se obtienen bajas concentraciones de producto y por lo tanto se obtiene poco piruvato. Esta enzima es controlada por regulación alostérica de la siguiente forma: Por un lado se activa gracias a niveles energéticos elevados de ADP y AMP, inhibiéndose en abundancia de ATP y citrato, Por otro se activa en presencia de un regulador generado por la PFK2 que es la Fructosa-2,6-Bisfosfato (F-2,6-BP), que no es un metabolito ni de la glucolisis ni de la gluconeogénesis, sino un regulador de ambas vías que refleja el nivel de glucagón en sangre. La lógica de la inhibición y activación son las siguientes: ATP: Inhibe esta enzima pues si hay una alta concentración de ATP entonces la célula no necesita generar más. Citrato: Si la concentración de citrato es alta el Ciclo de Krebs va más despacio de lo que el sustrato (Acetil-CoA) llega para degradarse, y la concentración de glucosa será más alta. 59
En el Ciclo de Krebs se produce mucho NADH y FADH2, para que funcionen se han de reoxidar en la cadena de transporte electrónico creando gradiente de protones, si el gradiente no se gasta las coenzimas no se reoxidan y el Ciclo de Krebs se detiene. AMP, ADP: La alta concentración de estas moléculas implica que hay una carencia de ATP, por lo que es necesario realizar glucólisis, para generar piruvato y energía. PFK1: Inhibe: ATP - Activa: ADP, AMP y F-2,6-BP. La piruvatoquinasa se regula distintamente según el tejido en el que trabaje, pero en hígado se inhibe en presencia de ATP y Acetil Coenzima-A (Acetil-CoA), y se activa gracias de nuevo ante la F-2,6-BP y la concentración de fosfoenolpiruvato. PQ: Inhibe: ATP, A-CoA - Activa: PEP y F-2,6-BP. 2.1.3. Fenómenos que caracterizan a la vía EMP Fosforilación preliminar; se consumen 2 ATP Rompimiento de la molécula. Oxidación y formación de enlace fosfatídico de alta energía; se produce NADH y ATP. Reordenamiento molecular par la formación de un enlace fosfatídico de alta energía, se genera otro ATP. (Figura Nº 2.2). Por otra parte, hay que considerar tres tipos de reacciones fundamentales: 1. Transferencia de grupos fosfato. 2. Transferencias de H+. 3. Roturas del enlace C C. La enzima característica de la vía de Embden-Meyerhof es la fosfofructoquinasa. 60
Figura Nº 2.2. Vía de Embden-Meyerhof 1. Glucoquinasa; 2. Fosfohexosa isomerasa; 3. Fosfofructoquinasa; 4. Aldolasa; 5. Gliceraldehido-3 -Fosfato Deshidrogenasa; 6. Fosfogliceroquinasa; 7. Fosfoglicero mutasa; 8. Enolasa; 9. Piruvico quinasa; 10 Descarboxilasa Piruvica;11. Deshidrogenasa Alcohólica; 12 Deshidrogenasa Láctica. Fuente: (Nelson D.L., M.M. Cox y C.M. Cuchillo., 2005). 61
2.2. FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA Es la transformación cuantitativa de la glucosa en etanol y CO2. Se la encuentra en levaduras, otros hongos y algunas bacterias. Proceso de fermentación llevado a cabo por Saccharomyces. El piruvato se reduce para formar etanol y CO2: La fermentación alcohólica es la base de las siguientes aplicaciones en la alimentación humana, pan, cerveza, vino y otras bebidas fermentadas. Aparte la levadura, solamente se ha encontrado en Zymomonas mobilis, aunque este microorganismo sigue una ruta metabólica completamente distinta. La fermentación alcohólica (denominada también como fermentación del etanol o incluso fermentación etílica) es un proceso biológico de fermentación en plena ausencia de aire (oxígeno - O2), originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por regla general azúcares: como pueden ser por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidón, etc.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol (cuya fórmula química es: CH3-CH2OH), dióxido de carbono (CO2) en forma de gas y unas moléculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energético anaeróbico. El etanol resultante se emplea en la elaboración de algunas bebidas alcohólicas, tales como el vino, la cerveza, la sidra, el cava, etc. Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar también etanol mediante la fermentación a nivel industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible. Sobre la Fermentación Alcohólica, Mesas, J. M. y M. T. Alegre (1999) estudiaron los principales microorganismos implicados en la elaboración del vino y de las posibles alteraciones del mismo. Muestran los principales grupos de microorganismos y los mecanismos bioquímicos por los que se llevan a cabo las distintas alteraciones. Finalmente tratan las tendencias actuales de la microbiología enológica destacando algunos de las principales técnicas empleadas en la manipulación genética de los microorganismos del vino y los factores que influyen en las fermentaciones y enfermedades anaeróbicas del vino. Al respecto Cotillas, P. E. (2004) menciona que las clarificaciones en vinos se acompañan de cambios como la disminución general de los compuestos fenolicos y del color, disminución de partículas de los compuestos poco o muy fuertemente polimerizados con una reducción de la astringencia. Informan además que según las 62
dosis de clarificante y del equilibrio clarificante-vino se nota una suavización que puede conllevar a una pérdida de volumen del cuerpo y a una cierta seguridad gustativa. Por su parte, Nelson D. L. y M.M. Cox (2005), refieren que la cerveza se prepara por fermentación etanolica de los glucidos presentes en los granos de cebada por parte de enzimas glucoliticas de la levadura. Los glucidos, básicamente polisacaridos, deben ser previamente degradados a mono y disacáridos por enzimas tales como la amilasa y la maltasa. Las células de levadura pasan a metabolizar el azúcar de forma anaeróbica, fermentan los azucares a etanol y C02. Una vez que se ha detenido la fermentación se separan las células y la cerveza cruda esta lista para el tratamiento final. 2.2.1. Proceso Bioquímico de la Fermentación Alcohólica La fermentación alcohólica tiene como finalidad biológica proporcionar energía anaeróbica a los microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxígeno para ello disocian las moléculas de glucosa y obtienen la energía necesaria para sobrevivir, produciendo el alcohol y CO2 como desechos como consecuencia de la fermentación. Las levaduras y bacterias causantes de este fenómeno son microorganismos muy habituales en las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al sabor de los productos fermentados. Una de las principales características de estos microorganismos es que viven en ambientes completamente carentes de oxígeno (O2), máxime durante la reacción química, por esta razón se dice que la fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico. En las Figuras Nº 2.3 y 2.4 se presentan las distintas etapas comprendidas en la fermentación alcohólica de la glucosa por la levadura. Desde la glucosa hasta la síntesis de piruvato, se trata de una vía metabólica idéntica a la glucólisis muscular, denominada vía de las triosas o de Embden-Meyerhof. Las etapas fundamentales de la misma son: 1. Formación de hexosas fosfato. 2. Formación de triosas fosfato. 3. Oxidación del gliceraldehído-3 P 63
4. Formación del piruvato. 5. Descarboxilación del piruvato. 6. Reducción del acetaldehído. Figura Nº 2.4. Reacciones comprendidas en la fermentación alcohólica de la levadura Fuente: (Pares I.F. y A. Juárez, 1997). 64
En más detalle durante la fermentación etílica en el interior de las levaduras, la vía de la glucólisis es idéntica a la producida en el eritrocito (con la excepción del piruvato que se convierte finalmente en etanol). En primer lugar el piruvato se descarboxila mediante la acción de la piruvato descarboxilasa para dar como producto final acetaldehído liberando por ello dióxido de carbono (CO2) a partir de iones del hidrógeno (H+) y electrones del NADH. Tras esta operación el NADH sintetizado en la reacción bioquímica catalizada por el GADHP se vuelve a oxidar por el alcohol deshidrogenasa, regenerando NAD+ para la continuación de la glucólisis y sintetizando al mismo tiempo etanol. Se debe considerar que el etanol va aumentando de concentración durante el proceso de fermentación y debido a que es un compuesto tóxico, cuando su concentración alcanza aproximadamente un 12% de volumen las levaduras tienden a morir. Esta es una de las razones fundamentales por las que las bebidas alcohólicas (no destiladas) no alcanzan valores superiores a los 20% de concentración de etanol. Figura Nº 2.4. Conversión del Piruvato a Etanol Fuente: (Gómez G.J. y C. Nieto., 2002). 65
2.2.2. Asimilación Oxidativa y Fermentativa de la Glucosa Las levaduras, tanto cuando metabolizan oxidativamente como fermentativamente la glucosa, pueden asimilar una parte de la misma, acumulándola en la biomasa celular en forma de glucógeno, grasa, etc. La asimilación de la glucosa puede tener lugar también en sistemas no proliferantes, donde se excluye la utilización de una parte del sustrato para la biosíntesis. En un sistema no proliferante de células de levadura, puede obtenerse una fermentación activa de la glucosa con concentraciones de 5 al 10% a 30ºC y ph 3-4. En soluciones más diluidas de azúcar es también fácil obtener un rápido consumo aerobio. La fermentación alcohólica y el proceso respiratorio permiten esperar, respectivamente, una producción de 44,8 ml de CO2 o un consumo de 134,4 ml de O2 por milimol de glucosa utilizada. Cuando Saccharomyces cerevisiae utiliza glucosa aerobiamente también consume solamente el 50% del O2 necesario para la respiración del azúcar tomado del medio. Durante la fermentación con exceso de sustrato sólo se producía el 35% del CO2 teórico. En los sistemas no proliferantes, siempre y cuando el sustrato se encuentre en exceso, las levaduras dan lugar a una asimilación oxidativa o fermentativa de una fracción de la glucosa que se incorpora del medio. Se ha demostrado citológica y químicamente que esta glucosa se transforma en una sustancia muy parecida al glucógeno del músculo. La formación de glucógeno tiene lugar a partir de la Glucosa-1-P C6 H12 O6 + ATP G-6-P G-1-P + UTP G-6-P + ADP Hexoquinasa G-1-P Fosfohexosaisomerasa UDP-Glucosa + PPi UTP-glucosa fosforilasa 66
La UDP-glucosa se polimeriza formándose un α-1,4-glucano con la UDP-glucano sintasa. Posteriormente se ramifica rompiéndose enlaces 1,4 y uniéndose de nuevo por enlaces 1,6, por efecto de una amilo-1,6-glucosidasa. Algunas levaduras acumulan también grasa como consecuencia de la asimilación de la glucosa. La grasa de las levaduras está constituida por una mezcla de lípidos. 2.2.3. Fermentación Endógena Las reservas formadas por asimilación de la glucosa pueden utilizarse en ausencia de sustrato exterior. La producción de CO2 por una suspensión de células lavadas a ph 34 después de diferentes tiempos de incubación en glucosa al 10% depende de la intensidad de la fermentación aumenta con el tiempo de incubación y, en consecuencia, en función de la cantidad de reserva acumulada. En condiciones basales se consumen por fermentación endógena 60 mg de glucógeno/h por cada 1000 g de peso seco. Después de 1 h de incubación en glucosa al 10%, se pasa a 200 mg/h por cada 100 g. Esta diferente velocidad de fermentación de glucógeno basal (previamente acumulado) y del de nueva síntesis ha hecho pensar que quizás se trate de dos tipos de glucógeno diferentes. De hecho, hay evidencias que indican que las levaduras pueden sintetizar dos tipos diferentes de moléculas de glucógeno. El carácter endógeno de la fermentación puede ponerse de manifiesto mediante el uso de inhibidores. El nitrato de uranilo a concentración de 4x10-5 M no penetra en la célula, pero inhibe en un 80% la utilización de la glucosa exterior. No obstante, no afecta en absoluto a la fermentación endógena. En cambio, el fluoruro sódico, que a una concentración 10-2 M penetra en la célula impidiendo la formación de piruvato, inhibe un 80% tanto la utilización de la glucosa exterior como la fermentación endógena. El DNP (dinitrofenol) a una concentración 3x10-4 M, como la azida sódica o la aureomicina, inhiben tanto la asimilación oxidativa de la glucosa como la fermentativa. 67
El sistema no proliferante, ya esté en una fase metabólica oxidativa o fermentativa, no se halla ni mucho menos restringido a la oxidación de la glucosa hasta CO2 o a su fermentación hasta etanol y CO2, sino que pueden existir de forma alternativa o concomitante a estos procesos otras actividades metabólicas que provocan la aparición en el medio externo de diferentes tipos de metabolitos o incluso la acumulación intracelular de reservas. 2.3. VÍA DE ENTNER-DOUDOROFF La ruta de Entner-Doudorof es una ruta metabólica alternativa que cataboliza glucosa a piruvato usando una serie de enzimas distintos a la glucólisis y a la ruta de la pentosa fosfato. Es exclusiva de un número reducido de microorganismos carentes de la ruta EmbdenMeyerhof. El 6-fosfogluconato puede deshidratarse a 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato. Este compuesto puede desdoblarse luego en piruvato y gliceraldehido-3-fosfato mediante una aldolasa. Mediante esta ruta se produce menos NADPH que en situación en la que el 6-fosfogluconato es descarboxilado a ribulosa-5-fosfato. Adicionalmente, el gliceraldehido-3-p se oxida a piruvato por la vía de Embden-Meyerhof, descarboxilándose en ambos casos el piruvato y originando acetato. El resultado general de la vía de Etner Doudoroff es el siguiente: Glucosa (C6)+ADP + NAD+ + NADP+ 2 Piruvato (C3) + ATP + NADH + NADPH + 2H+ 68
En Gluconobacter oxydans y Melanogenes, el 6-fosfogluconato puede deshidratarse a 2ceto-3-desoxi-6-fosfogluco neto. Este compuesto puede desdoblarse luego en piruvato y gliceraldehido-3-p mediante una aldolasa. Mediante esta ruta se produce menos NADPH que en la situación en la que el 6-fosfogluconato es descarboxilado a ribulosa-5-p Adicionalmente, el gliceraldehído-3-p se oxida a piruvato por la vía de Embden-Meyerhof, descarboxilándose en ambos casos el piruvato y originando acetato tal como ha sido descrito anteriormente. Esta vía se conoce como vía de Entner-Doudoroff, y es la misma utilizada por Zymonomas mobilis para llevar a cabo una fermentación alcohólica con una estequiometria similar a la de las levaduras (Figura Nº 2.5 y Figura Nº 2.6). Comienza con las mismas reacciones de las pentosas fosfato. Se forma 2-ceto-3desoxi-6-fosfogluconato o KDPG. Desde GAL-3P hasta Piruvato es catalizado por enzimas comunes a la vía Glicolítica. Se produce 1NADPH y 1 NADH por molécula de glucosa metabolizada. (Figura Nº 2.7). Figura Nº 2.5. Reacciones comprendidas en la via de Entner-Doudoroff Fuente: (Mathews, C.K., K.E. Van Holde y K.G. Ahern., 2002). 69
La mayoría de las bacterias tienen las vías glucolítica y de las pentosas fosfato, pero algunas sustituyen la glucólisis por la Vía Entner-Doudoroff. Ejemplo: Pseudomonas G(-), Streptococcus faecalis G(+), Rhizobium G(-), Agrobacterium G(-) y Azotobacter G(-).Pseudomonas. Muy pocos Gram(+). Figura Nº 2.6 Las dos vías del 6-P-gluconato. (a) sistema de la 6-Pgluconato deshidrogenasa (b) reacción clave de la vía de Entner Doudoroff (c) origen de los átomos de C de las moléculas de CO 2 formadas en la fermentación alcohólica de la glucosa por las levad uras (vía de Embden-Meyerhorf) y Zymononas mobilis (vía de Entner Doudoroff). Fuente: (Pares I.F. y A. Juárez, 1997). 70
Figura Nº 2.7. Esquema comparativo de la vía de Embdem Meyerhoff y la vía Etner Doudoroff como estrategias microbianas de fermentación alcohólica. Fuente: (Pares I.F. y A. Juárez, 1997). 71
2.4. VÍA DE HEXOSA MONOFOSFATO También llamada Vía del Monofosfato de Hexosa (Warburg -Dickens) o Pentosa fosfato. Figura 2.8. La glucosa 6-P puede convertirse en diversos azúcares, produciéndose NADPH al mismo tiempo. Esta Vía que permite usar pentosas como fuente de energía por organismos que carecen de la enzima fosfocetolasa. Permite la síntesis de hexosa (en bacterias) cuando crecen en pentosas y sintetiza H7P y E-4P. Producen precursores para biosíntesis de: Ácidos nucleicos, pentosas, aminoácidos aromáticos, vitaminas, ATP. Es fuente de NADPH para reacciones de síntesis y como una ruta de ínterconversión de azucares para dar cadenas de carbono de 3, 4, 5, 6 y 7 C para reacciones biosintéticas, Un ejemplo es la formación de Eritrosa-4 P que puede llevar a la síntesis de ácido Shikimico y de aminoácidos aromáticos, y además, el NADPH es requerido para la producción de ácidos graso y esteres a partir de Acetil-CoA. Ej. Acetobacter xilinum. 72
Figura Nº 2.8. Transformaciones de la Ribulosa-5-P Fuente: (Pares I.F. y A. Juárez, 1997). 73
Si la degradación de la glucosa utilizando el sistema de la glucosa-6-pdeshidrogenasa conduce a la formación de ribulosa-5-p, la misma puede convertirse en xilulosa-5-p y ribosa-5-p. A partir de la xilulosa-5-p, algunas bacterias del ácido láctico pueden producir acetilfosfato y gliceraldehído-3-p. El gliceraldehído-3-p es transformado en lactato siguiendo la vía de Embden Meyerhof. Esta vía metabólica, anaerobia, que fermenta la glucosa produciendo Lactato y Etanol, es conocida como vía de la pentosa, y se caracteriza por la presencia de la pentosa fosfocetolasa que cataliza la transformación de la xilulosa-5-p en acetilfosfato y gliceraldelído-3-p. La ribosa-5-p es importante como precursor para la biosíntesis de las purinas, las pirimidinas y los aminoácidos aromáticos, pera en el contexto del metabolismo de hexosas y pentosas por las bacterias del ácido acético se utiliza en su mayor parte juntamente con xilulosa-5-ppara generar gliceraldehído-3-p y sedoheptulosa-7-.p a través de la transcetolasa. Posteriormente, una serie de transformaciones llevan a producir bien una triosa-p que puede ser degradada por la vía de Embden Meyerhoff o una hexosa-p que entra nuevamente en el ciclo. (Figuras Nº 2.9. y 2.10) Figura Nº 2.9. Vía de Pentosa fosfato. Fuente: (Devlin, T. M. 2004). 74
Figura Nº 2.10. Reacciones de la transcetolasa y la transandolasa del metabolismo microbiano de hexosas y pentosas Fuente: (C.K. Mathews, K.E. Van Holde y K.B. Ahern, 2002. 75
El ciclo de!a hexosa monofosfato puede mineralizar la glucosa, siempre que a través de las cadenas respiratorias se reoxide el NADPH + H+ y se regenere el ATP. para verificar este proceso de acuerdo con el balance global: 6 Glucosa (C6) + 1ATP + 12 NADP+ + 6 H2O 5 G-6-P + 1 ADP + 12 NADPH + H+ + 6 CO2 + Pi 2.4.1. Formación de Gluconato La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) cataliza una oxidación irreversible de la glucosa-6-fosfato a 6-fosfogluconolactona en una reacción dependiente de NADP+ como coenzima. La hexosa monofosfato está regulada primeramente por la G6PD. El NADPH es un potente inhibidor competitivo de la enzima y bajo muchas condiciones metabólicas, la relación NADPH/NADP+ es lo suficientemente elevada para inhibir la actividad catalítica de la enzima. Lo anterior incrementa la demanda de NADPH, por tanto la relación NADPH/NADP+ decrece y la actividad del ciclo aumenta en respuesta a la actividad catalítica de la G6PD. La 6-fosfogluconolactona es hidrolizada por la 6-fosfogluconolactona hidrolasa formando gluconato. La reacción es irreversible, pero no es el paso limitante de la vía. Gluconobacter oxydans ssp. Suboxydans presenta dos Glucosa deshidrogenasas: Que aparentemente es idéntica a la glucosa oxidasa que trabaja con DPI (2,6dinitrofenol indofenol) como aceptor de hidrógeno en lugar de O2, y: En ambos casos, la gluconolactona se hidroliza a gluconato. (Figura Nº 2.11). 76
Figura Nº 2.11. Transformaciones de la Ribulosa-5-P Fuente: (Campbell, M.K. y S.O. Ferrel, 2004). 2.4.2. Utilización del Gluconato La descarboxilación subsiguiente del 6-fosfogluconato es catalizada por la 6fosfogluconato deshidrogenasa. Esta reacción irreversible produce una azúcar pentosa-fosfato, la ribulosa 5-fosfato, CO2 (del C1 de la glucosa) y una segunda molécula de NADPH. En algunos casos el gluconato se oxida con NADP a 2-cetagluconato o a 5cetogluconato y luego, a 2.5-dicetogluconato. Gluconobacter oxydans ssp. suboxydans. puede transformar el 2,5-dicetogluconato en α-cetoglutarato, previa descarboxilación y pasando por una sede de intermediarios que no están caracterizados. 77
Acetobacter aceti ssp. xylilum tiene una glucoquinasa que permite pasar el gluconato a fosfogluconato con ATP. De este modo puede continuar la vía de Warburg-Dickens cortocircuitando la reacción de la glucosa-6-p-deshidrogenasa. Esta glucoquinasa también se ha encontrado en Bifidobacterium. 2.4.3. Sistema de la Fosfocetolasa Acetobacter aceti y A. xylimun puede formar acetil-p a partir de fosfato inorgánico y fructosa-6-p. Esto es debido a la acción de la fosfohexosa fosfocetolasa. Este enzima sólo se ha encontrado además en Bifidobacterium. El acetil-p genera ATP mediante la acetil-p quinasa: 78
En conjunción con la fosfopentosa fosfocetolasa, enzima mucho más difundida, la fosfohexosa fosfocetolasa permite una conversión de la fructosa-6-p en tres moléculas de acetato con la formación de tres de ATP. Figura Nº 2.12. Figura Nº 2.12. Sistema de las fosfocetolasas en las bacterias del ácido acético. Fuente: (Alvarez, B. 1993). Las alternativas consideradas permiten resumir el metabolismo de los glúcidos en las bacterias del ácido acético mediante el esquema que se muestra en la Figura Nº 2.13. 79
Figura Nº 2.13. Resumen del metabolismo de los glúcidos en las bacterias del ácido acético. Fuente: (Pares I.F. y A. Juárez, 1997). 2.5. FERMENTACIÓN GLICÉRICA CON SULFITO 2.5.1. Formación de Glicerina En sus estudios sobre el vino y la cerveza, Pasteur encontró que en la fermentación alcohólica siempre se produce una pequeña cantidad de glicerina. Este proceso puede aumentarse, tal como realizó Neuberg, añadiendo sulfito al sistema a fin de fijar el acetaldehído, lo que provoca que se produzca un mol de glicerina por cada mol de glucosa fermentada: 80
En estas condiciones, al no poder utilizar el acetaldehído como aceptor de hidrógeno, la re oxidación del NADH se hace a partir de la dihidroxiacetona fosfato, generándose entonces glicerina: 2.5.2. Fermentación Aceto-Glicérica En medio alcalino varían los productos finales de la fermentación de la glucosa por la levadura, produciéndose por cada dos moles de glucosa fermentados, dos moles de glicerina, uno de ácido acético y uno de etanol: En estas condiciones, la fermentación de dos moles de glucosa genera tres moles de NADH, dos de ellos formados en la oxidación del gliceraldehído-3p y uno en la transformación de un mol de acetaldehído a acetato: La reoxidación de los tres moles de NADH tiene lugar con la formación de glicerina (2 moles) y etanol (1mol). Figura Nº 2.14. 81
Figura Nº 2.14. Fermentación Aceto-Glicérica 2.6. FERMENTACIÓN PIRUVICO GLICÉRICA Si la fermentación se realiza con extracto seco redisuelto en solución de glucosa, los productos finales obtenidos son piruvato y glicerina: En estas condiciones, el piruvato no se decarboxila y, de este modo, no genera acetaldehído, por lo que la re oxidación del NADH se lleva a cabo en la reacción anteriormente ya comentada de la dihidroxiacetona fosfato, que es transformada en glicerina. (Figura Nº 2.15). 82
Figura Nº 2.15. Conversión de la Dihidroxiacetona fosfato en Glicerina. Fuente: (Murray, R. K. et. al., 2005). 2.7. FERMENTACIÓN ACÉTICA 2.7.1. MODELOS DEL METABOLISMO OXIDATIVO DE LAS BACTERIAS DEL ÁCIDO ACÉTICO El género Acetobacter fue dividido por pasteur en tres grupos: Peroxydans (A. peroxydans y A. paradoxum); Oxydans (A. pasteurianus, levanicux, A. ascendens y A. rauceus) y Mesoxydans (A. aceti, A. xylinum y A. mesoxydans). Actualmente se aceptan sólo tres especies A. aceti, A. pasteurianus y A. peroxydans. Las demás serían subespecies. Con el género Gluconobacter y con las tres especies de Acetobacter pueden hacerse cuatro modelos metabólicos dístanos los detalles de las transformaciones comprendidas en los mismos pueden encenderse fácilmente con lo que se ha 83
descrito más arriba. La acetoina (CH3-CHOH-CO-CH3) se forma a partir del piruvato acetaldehído por la acetoina sintasa de forma semejante a lo que realizan algunas bacterias del ácido láctico. Figura Nº 2.16. Modelos metabólicos los cuatro tipos principales de bacterias del ácido acético. 84
Fuente: (Pares I.F. y A. Juárez, 1997). 85
2.7.2. Fermentación del Acido Acético En las fermentaciones aerobias de las que nos hemos ocupado hasta el momento la cadena 6 C de la hexosa que servía como sustrato era degradada hasta ácido pirúvico a través de la vía de Embden-Meyerhoff, el cual se convertía en acetil-coa por desecarboxilación oxidativa, esta ingresaba en el ciclo del citrato y finalmente los productos de la fermentación se obtenían como resultado de una respiración incompleta debida a la interrupción del ciclo; pero existen una serie de fermentaciones en las que el esqueleto carbonado del sustrato permanece inalterado, cambiando solamente, por vía oxidativa, uno o varios grupos funcionales. Fermentaciones de este tipo de importancia para la tecnología de los alimentos son las siguientes: Etanol, ácido acético, glicerina, dihidroxiacetona, sorbita, sorbosa, glucosa --> ácido glucónico, glucosa, ácido 2-cetoglutárico, glucosa ácido 5-cetoglutárico, glucosa --> ácido isoascórbico y glucosa ácido L-ascórbico. En estos procesos el sustrato pierde átomos de hidrógeno oxidándose a través de la cadena respiratoria y la fosforilaclón oxidativa con formación de agua y acumulación de energía en forma de ATP. La energía obtenida de esta forma por los microorganismos correspondientes es muy inferior a la que se produce en la respiración total a través del ciclo cítrico, pero supera, no obstante, a la que se obtiene en las fermentaciones. Las fermentaciones del tipo al que nos estamos refiriendo se llaman también reacciones directas, transformaciones o síntesis intermedias. La fermentación acética, es decir la preparación de vinagre de mesa a partir de líquidos alcohólicos, como por ejemplo el vino, se emplea desde hace miles de años, En la actualidad con el empleo de los modernos procedimientos de generador: y sumersión, han caído en desuso los antiguos métodos de obtención del vinagre separando el velo que las bacterias acéticas (especies de Acetobacter) formados sobre la superficie del vino. En el procedimiento del generador la solución alcohólica discurre sobre virutas de madera de haya en las que se han 86
desarrollado las bacterias acéticas ("método de fessel"). Después de que el líquido a fermentar ha recorrido este camino puede separarse de él el vinagre. Sin embargo, la técnica más moderna la constituyen los procedimientos de sumersión, en los cuales las bacterias acéticas se cultivan en un medio alcohólico agitado e intensamente aireado, en un fermentador que en este caso recibe el nombre de acetator. Después de filtrar el líquido fermentado se obtiene un vinagre con un elevado contenido en ácido acético. En las destilerías de frutas la infección de las maltas fermentadas con bacterias acéticas, que hacen disminuir el contenido alcohólico y empeoran la calidad de los licores, constituye una fermentación desviada muy frecuente. Al destilar el ácido acético pasa de la malta al licor, a causa de su volatilidad, comunicando un sabor ácido. Además el ácido acético forma con el etanol de los licores ester acético volátil, que se percibe por el olor y por el gusto en concentraciones muy inferiores a las del propio ácido acético. Mientras que trazas de estos esteres contribuyen a aromatizar los licores, su presencia en cantidades mayores les hace inaceptables. Puesto que la formación aerobia de ácido acético, al contrario que la fermentación acética por las bacterias lácticas heterofermentativas, solamente se realiza en presencia del oxígeno del aire, se puede controlar en gran parte eliminando este último. Con esta finalidad es conveniente llenar lo más posible los recipientes de la fermentación y dotarlos de obturadores seguros, así como tratar el mosto, vino y recipientes cocí anhídrido sulfuroso. La fermentación bioquímica del ácido acético puede representarse: CH3 CH2OH + O2 CH3 COOH + H2O + 6 ATP Los pasos intermedios de la formación de ácido acético y agua a partir del etanol. La cadena de reacciones comienza con la deshidrogenación del etanol a acetaldehído (Reacción I) mediada por la alcohol-deshidrogenasa. Esta enzima puede 87
tener como coenzima al NAD, o al NADP, específicas según el tipo de Acetobacter. En el Acetobacter peroxydans se ha caracterizado una alcohol-deshidrogenasa NADP-específica. La reacción 2 no es más que la incorporación de agua al acetaldehído para formar hidrato de acetaldehído. En la reacción 3 el hidrato de acetaldehído se convierte en ácido acético por acción de una aldehído-deshidrogenasa NADP-específica. En las reacciones 4a 4d se representan los pasos ya conocidos de la cadena respiratoria en los que el hidrógeno ligado a las coenzimas reacciona Finalmente con el oxígeno del aire y la energía liberada queda convertida en ATP a través de la fosforilación oxidativa. En la Figura Nº 2.17 se observa que se forman dos moléculas de agua más que las que corresponderían de acuerdo con la reacción global de la fermentación acética. Esto se explica por el hecho de que en una reacción intermedia se incorpora agua para convertir al acetaldehído en su hidrato, cuya posterior deshidrogenación proporciona dos equivalentes de reducción adicionales. En ausencia de oxígeno las bacterias acéticas pueden catalizar la siguiente transformación: 88
Figura Nº 2.17. Pasos intermedios de la formación de ácido acético y agua a partir del etanol. Fuente: (Moat, A. G., Foster, J. W., Spector, M. P., 2002). 89
Esta transformación puede representarse corno una deshidrogenación del hidrato de acetaldehído en la que actúa como aceptor de hidrógeno una molécula de acetaldehído no hidratada. Como producto de la reacción se obtiene también etanol, por lo que el rendimiento en ácido acético es la mitad del que se obtiene en presencia de oxígeno. La formación de agua en la fermentación acética se realiza: Algunas bacterias también forman peróxido de hidrogeno: Al que inmediatamente descompone la catalasa de las acetobacterias aerobias: La oxidación del etanol a ácido acético no es la única producción de las aceto Bacterias de importancia para la tecnología de los alimentos. En especial la oxidación de D-sorbita a L-sorbosa (Figura Nº 2.18). Por el Acetobacter suboxydans, representa una síntesis intermediaria microbiológica industrial para la preparación de ácido L-ascórbico (vitamina C). La síntesis de vitamina C consiste en la combinación de diversas reacciones químicas parciales con la reacción bioquímica antes dicha. 90
El Acetobacter suboxydans oxida también a otros polialcoholes, siempre que posean la siguiente disposición estructural Figura Nº 2.18. Oxidación de D-Sorbita a L-Sorbosa por acetobacterias. 91