TEMA 9: MUTACIÓN Dr. Pedro F. Mateos I. BASES MOLECULARES DE LA MUTACIÓN Los cambios en el genotipo son producidos mediante mutación y por recombinación genética. Mutación: es un cambio heredable en la secuencia de bases de los ácidos nucleicos contenidos en el genoma de un organismo. Recombinación genética: es el proceso por el cual los elementos genéticos contenidos en dos genomas separados se juntan en uno solo. Mientras que la mutación conlleva sólo una pequeña cantidad de cambios genéticos en una célula, la recombinación genética normalmente conlleva cambios más grandes ya que pueden transferirse entre organismos genes, conjunto de genes e incluso cromosomas enteros. En el pasado prácticamente no existían procedimientos para conseguir la recombinación genética en cepas de producción industrialmente importantes, de forma que el espectacular éxito del desarrollo de cepas en la industria se debe básicamente a la aplicación extensiva de la mutación y selección. Las mutaciones pueden ocurrir espontáneamente o después de la inducción con agentes mutagénicos. Las mutaciones espontáneas pueden ocurrir debido a la acción de las radiaciones naturales e incluso durante la replicación del DNA debido a errores en la lectura de las bases. Estos errores ocurren con una frecuencia de 10-7 - 10-11 por pares de bases durante una replicación. Debido a la baja frecuencia de las mutaciones espontáneas, no es económico aislar tales mutantes para el desarrollo industrial de cepas. La frecuencia de mutación (la proporción de mutantes en la población) puede aumentarse significativamente con el uso de mutágenos. De esta manera puede incrementarse hasta 10-5 - 10-3 en el aislamiento de mejores productores de metabolitos secundarios e incluso hasta 10-2 - 10-1 en el aislamiento de mutantes auxotrofos. Tanto los mutantes espontáneos como los inducidos se producen como resultado de los siguientes cambios estructurales en el genoma: La mutación en el genoma puede causar cambios en el número de cromosomas. La mutación en el cromosoma puede cambiar el orden de los genes dentro del cromosoma. La mutación puntual puede resultar de cambios en la secuencia de bases dentro de un gen. Las mutaciones utilizadas para la mejora de cepas microbianas generalmente son mutaciones puntuales. Estas mutaciones puntuales son de dos tipos: (i) Sustitución de un nucleótido por otro nucleótido; (ii) Corrimiento de lectura. 1.- Sustitución de un nucleótido por otro nucleótido La sustitución de un nucleótido por otro en un gen puede originar las siguientes mutaciones: 41
Mutación silenciosa: cuando el codon alterado continua codificando para el mismo aminoácido y por lo tanto se sintetiza la misma proteína. Mutación de sentido erróneo: cuando el codon alterado codifica para un aminoácido diferente que puede alterar las propiedades de la proteína, o incluso convertirla en no funcional. Mutación sin sentido: cuando la sustitución del nucleótido produce un codon de terminación de la cadena resultando en una parada de la síntesis de la proteína en la traducción. El producto es una proteína incompleta que probablemente no es funcional. funcionales. Un ejemplo lo tenemos en la adición o eliminación de una letra en una frase: ven sin sus dos... ven sit nsu sdo s.. Mutaciones por corrimiento de lectura Una característica de las mutaciones puntuales es que pueden revertir. Un revertiente se define como una cepa en la cual se restaura el fenotipo de la cepa salvaje que se había perdido en el mutante. Existen dos tipos de revertientes: Revertientes de un mismo sitio: cuando la mutación que restaura la actividad ocurre en el mismo sitio donde ocurrió la mutación original. Mutaciones por sustitución de nucleótidos 2.- Mutaciones por corrimiento de lectura Mutaciones de inserción: cuando se añaden uno o más nucleótidos en un gen. Mutaciones de delección: cuando se eliminan uno o más nucleótidos en un gen. Estos dos tipos de mutación conllevan a la formación de proteínas no Revertientes de segundo sitio: cuando la mutación que restaura la actividad ocurre en un sitio diferente del DNA. II. MUTÁGENOS Existen una gran variedad de agentes físicos y químicos que pueden inducir mutaciones. A continuación discutimos algunos de los principales grupos y su modo de acción. 1.- Mutágenos químicos Se conocen varios productos químicos que son mutagénicos, clasificándose según su modo de acción en: 42
A. Análogos de bases B. Agentes que reaccionan con el DNA C. Agentes intercalantes A. Análogos de bases Debido a su similitud estructural los análogos de bases como el 5- Bromouracilo o la 2-Aminopurina se incorporan en el DNA que se replica en lugar de las bases correspondientes timina y adenina. Cuando uno de estos análogos de bases se incorpora en el DNA, la replicación puede ocurrir normalmente aunque ocasionalmente, ocurren errores de lectura que resultan en la incorporación de bases erróneas en la copia de DNA. Así por ejemplo, el 5-Bromouracilo se puede aparear con guanina (la timina se aparea con adenina) ocasionando la transición de AT a GC (la guanina se aparea con citosina). La 2-Aminopurina puede aparearse con citosina ocasionando la transición de AT a GC. deficiencia de timina. Por tanto se utilizan auxotrofos de timina, lo que puede dar lugar a una producción reducida de la sustancia que se desea. B. Agentes que reaccionan con el DNA Existen una serie de agentes químicos que reaccionan directamente sobre el DNA que no se está replicando ocasionando cambios químicos en las bases lo que provoca un apareamiento incorrecto. Acido nitroso (HNO 2 ). Deamina la adenina a hipoxantina y la citosina a uracilo. Debido a las distintas propiedades de apareamiento de los productos de deaminación (hipoxantina aparea con citosina; uracilo con adenina) se producen transiciones AT ----> GC y/o GC ----> AT Análogos de bases Los análogos de bases son de poca importancia para la aplicación práctica ya que para las cepas industriales, que son poco conocidas genéticamente, puede ser bastante costoso establecer las condiciones óptimas para la mutagénesis. Por ejemplo, la incorporación de 5-Bromouracilo en el DNA tiene lugar sólo si el organismo está creciendo en condiciones de Ácido Nitroso Hidroxilamina (NH 2 OH). Reacciona con la citosina donde el grupo amino es reemplazado por un grupo hidroxilamino. Este derivado de la 43
citosina se aparea con adenina produciéndose transiciones GC ----> AT ya no se aparea con la citosina provocando la transición GC ----> AT El N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), cancerígeno, es uno de los mutágenos químicos más efectivos. Se obtienen, en condiciones óptimas, un gran número de mutantes con una tasa de muerte baja. Hidroxilamina Agentes alquilantes. Otro grupo de productos químicos que afectan al DNA que no se replica son los agentes alquilantes. Junto con la luz ultravioleta son los sistemas mutagénicos más potentes para aplicaciones prácticas. Los compuestos utilizados más frecuentemente incluyen el etil metano sulfonato (EMS), metil metano sulfonato (MMS), dietil sulfato (DES), diepoxi butano (DEB), N-metil-N-nitro-Nnitrosoguanidina (NTG), N-metil-Nnitroso urea y gas mostaza. La mutagénesis con agentes alquilantes se produce a través de varias vías ya que originan la formación de un espectro completo de bases alquiladas en el DNA lo que origina transiciones y delecciones. El etil metano sulfonato (EMS) introduce un metilo en la guanina que Nitrosoguanidina C. Agentes intercalantes Un grupo interesante de sustancias, acridinas y bromuro de etidio, son moléculas planas que se insertan entre dos pares de bases del DNA, separándolas entre sí. Durante la replicación, esta conformación anormal puede conducir a microinserciones o microdelecciones en el DNA, originando mutaciones por corrimiento de lectura. Aunque las acridinas son útiles en investigación, no son muy adecuadas para el aislamiento rutinario de 44
mutantes durante el desarrollo de cepas ya que tienen poco o ningún efecto mutagénico en bacterias. Bromuro de etidio con un óptimo a 254 nm que es la absorción máxima del DNA. La radiación a longitudes de onda entre 300 y 400 nm tiene menos efectos letales y mutagénicos que la luz UV de longitud de onda corta. Los productos más importantes de la acción de la luz UV son dímeros (timina-timina; timina-citosina; citosina-citosina) que se forman entre pirimidinas (T, C) adyacentes, lo que incrementa enormemente la probabilidad de que durante la replicación del DNA, la DNA polimerasa inserte un nucleótido incorrecto en tal posición. 2.- Radiaciones Tanto la luz ultravioleta como las radiaciones ionizantes se utilizan en estudios de mutagénesis. Sin embargo, los mecanismos de mutagénesis son bastante diferentes para cada tipo de radiación. Dímeros de timina Radiaciones A. Luz ultravioleta Uno de los agentes mutagénicos más efectivos es la radiación ultravioleta de longitud de onda corta. La longitud de onda efectiva para la mutagénesis está comprendida entre los 200 y 300 nm El tipo más frecuente de fuente de radiación UV que se usa para mutagénesis es la lámpara microbicida que emite grandes dosis de radiación UV en la región de 260 nm. Se suele utilizar una dosis de radiación UV que produzca un 90% - 95% de muerte en la población buscándose posteriormente, entre los supervivientes, los mutantes. La radiación UV es muy útil en el aislamiento de mutantes de cultivos bacterianos. Cuando las poblaciones irradiadas con luz UV son expuestas subsecuentemente a la luz visible de una longitud de onda de 300 a 450 nm, la velocidad de supervivencia aumenta y la frecuencia de mutación desciende. 45
Esto se debe a la activación de un enzima de fotorreactivación que corta los dímeros de timina. En presencia de luz, el enzima corta los dímeros originando pirimidinas monoméricas. Hasta el 80% de los dímeros de timina que existen en el genoma pueden ser fotorreactivados. Para aumentar la frecuencia de mutación deben evitarse los mecanismos de fotorreactivación, llevando a cabo todas las manipulaciones bajo luz visible de longitud de onda larga (> 600 nm). B. Radiación ionizante La radiación ionizante es una forma de radiación más potente e incluye rayos de longitud de onda corta como los rayos X, rayos cósmicos y rayos gamma. Esta radiación causa la ionización del agua y de otras sustancias; produciéndose indirectamente efectos mutagénicos debido a esta ionización. Entre las potentes especies químicas formadas por la radiación ionizante se encuentran radicales libres, siendo el más importante el radical hidroxilo (OH - ). Los radicales libres reaccionan en la célula con macromoléculas, como el DNA, y las inactivan produciendo rupturas que dan lugar a cambios estructurales importantes como son las mutaciones cromosomales. A bajas dosis de radiación ionizante sólo ocurren unos cuantos impactos sobre el DNA, pero a mayores dosis ocurren impactos múltiples que conducen a la muerte de la célula. Al contrario que la radiación UV, la radiación ionizante penetra fácilmente el vidrio y otros materiales. Por esta razón, la radiación ionizante se usa con frecuencia para inducir mutaciones en animales y plantas donde su poder de penetración hace posible alcanzar con facilidad las células germinales de estos organismos; pero, debido a que es más peligrosa de usar y está menos disponible, se emplea poco con microorganismos donde la penetración de la radiación UV no es un problema. Por consiguiente, se utilizan preferiblemente para la mutagénesis en el desarrollo industrial de cepas la radiación ultravioleta o los agentes químicos. 3.- Métodos adicionales de mutagénesis Las cepas utilizadas industrialmente están peor caracterizadas genéticamente que los organismos que se utilizan normalmente en investigación básica no existiendo prácticamente, en la actualidad, procesos aplicables diferentes a la mutagénesis por radiación o con agentes químicos. Por lo tanto, a continuación mencionamos otras posibilidades que en un futuro pueden tener claras aplicaciones. A. Mutagénesis por elementos transponibles Si se produce la inserción de un elemento transponible dentro de un gen se pierde, en general, la función del gen ya que se altera la secuencia codificadora del gen en el que se inserta. Los elementos transponibles se usan con profusión por los genéticos microbianos como agentes mutagénicos ya que pueden integrarse en el cromosoma en varias localizaciones. Mutagénesis por transposición 46
Hay tres tipos de elementos transponibles: secuencias de inserción (IS), transposones (Tn) y algunos virus especiales (Mu). En los procariotas, las secuencias de inserción (IS) son el tipo más simple ya que no llevan otra información genética que la requerida para desplazarse a nuevos lugares. Los transposones (Tn) son más largos que las secuencias de inserción (IS) y llevan otros genes, algunos de los cuales confieren importantes propiedades al organismo que los porta (marcadores de resistencia a fármacos y otros genes fácilmente seleccionables). La mutagénesis dirigida tiene muchos usos en genética microbiana y en biología molecular y resulta especialmente útil en estudios sobre estructura y función de enzimas y otras proteínas. Elementos transponibles B. Mutagénesis dirigida Los métodos de mutagénesis que han sido discutidos hasta este momento son completamente al azar. La tecnología del DNA recombinante y el uso de DNA sintético hacen que sea posible inducir mutaciones específicas en genes específicos. Cuando se aísla y se determina la secuencia de un fragmento de DNA que contiene un gen específico, es posible construir una forma modificada de este gen cambiando una base o una serie de bases. Este DNA modificado puede luego insertarse en una célula receptora y seleccionar mutantes que se diferenciarán del tipo silvestre por el cambio introducido en ese sitio específico. Mutagénesis dirigida III. SELECCION DE MUTANTES 1.- Aislamiento de mutantes resistentes a análogos 2.- Aislamiento de mutantes resistentes a antibióticos 3.- Aislamiento de auxotrofos 4.- Aislamiento de productores de antibióticos 5.- Aislamiento de productores de enzimas 47