1 Histotecnología aplicada a la Odontología Dimitrius Leonardo Pitol PhD FORP/USP
2 Yo trabajo en la Facultad de Odontología de Ribeirão Preto de la Universidad de São Paulo. Utilizamos la Histotecnología, como una herramienta de auxilio en la enseñanza y en la investigación.
3 Facultad de Odontología de Ribeirão Preto Universidad de São Paulo En nuestra facultad tenemos programas de Posgrados de Maestría y Doctorado: Odontopediatria. Rehabilitación Oral. Odontología Restauradora. Cirugía Buco-Maxilo facial. Periodoncia. Biología Oral.
4 Facultad de Odontología de Ribeirão Preto Universidad de São Paulo Con seis programas de posgrado, nuestra facultad se destaca con producción científica de calidad. La Histotecnología se torno una herramienta indispensable en la mayoría de investigaciones realizadas en nuestra facultad.
Facultad de Odontología de Ribeirão Preto Universidad de São Paulo Investigaciones con diferentes objetivos: Probar sustancias capaces de inducir reparación ósea. Probar sustancian que puedan combatir la progresión de la osteoporosis. Probar Biomateriales que puedan ser utilizados en Implantes dentales. Aplicación de terapia con laser.
Facultad de Odontología de Ribeirão Preto Universidad de São Paulo 6 En esta charla abordaremos las técnicas utilizadas de rutina en nuestra Facultad de Odontología. Preparación de especímenes calcificados para estudios del Esmalte dental. Preparación de especímenes calcificados con dispositivos médicos u odontológicos. Preparación de especímenes descalcificados.
Preparación histológica de Dientes por Desgaste 7 Para realizar cortes por desgaste debemos incluir los dientes en resina acrílica. Resina Acrílica auto polimerizable. De uso Odontológico
8 Para la preparación de los bloques utilizamos un molde de silicona, en el cual colocamos el diente más la resina. Así obtenemos el diente listo para ser cortado.
9 Preparación de cortes histológicos de dientes por desgaste Este es uno de los equipos que tenemos en nuestro laboratorio, en el cual podemos realizar los costes que nos permiten analizar la estructura inorgánica de los dientes.
Preparación de cortes histológicos de dientes por desgaste 10 Observen que el tiene un disco diamantado. Las mangueras derraman agua sobre el disco para su refrigeración. El bloque de resina queda preso en el equipo y es empujado hacia el disco con ayuda de la manivela. Este equipo fue diseñado por nuestros técnicos con la finalidad de reducir costos.
Preparación de cortes histológicos de dientes por desgaste 11 Tenemos también este equipo con un disco diamantado y refrigeración de agua. En los dos equipamentos logramos cortes entre 100 y 120 micrómetros. Lo ideal es obtener cortes con menos de 80 micrómetros.
Acabado de los cortes de dientes por desgaste 12 Para evaluar se el espesor del corte es de menos de 80 micrómetros Contamos con ayuda de un lente milimetrado que colocamos no ocular del microscopio.
Acabado de los cortes de dientes por desgaste 13 Esta es una imagen de un lente milimetrado en la ocular. Observen que la espesura esta entre 80 micrómetros. Este acabado del corte inicial de 120 micrómetros para 80 micrómetros es realizado con lijas. Estos cortes pueden ser levemente coloreados.
14 Penachos del esmalte Lamelas del Esmalte Dentina Unión Amelo-dentinaria
15 Especímenes con Dispositivos Médicos u Odontológicos Algunas investigaciones realizadas en nuestra facultad requieren cortes histológicos por desgaste, que además de cortar el material calcificado consiga cortar los dispositivos médicos u odontológicos. Estas investigaciones son importantes para el desarrollo de nuevas técnicas quirúrgicas buco maxilofaciales. Y para probar la biocompatibilidad de nuevos dispositivos.
16 Especímenes con Dispositivos Médicos u Odontológicos Equipo (micrótomo) que corta especímenes con dispositivos médicos u odontológicos. Los especímenes deben ser incluidos en resina LR White.
17 S.K. SINGHRAO ET AL MICROSCOPY RESEARCH AND TECHNIQUE 75:576 585 (2012)
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19 Fijación de Dientes Utilizamos formol Tamponado a 4 %. (paraformaldehido 40g diluído en 960 ml de Tampón PBS). Los dientes cortados por la técnica de desgaste con el objetivo de estudiar el esmalte también deben ser fijados. El tiempo de fijación debe ser de 24 a 48 horas de acuerdo con el tamaño del diente.
Preparación de los especímenes descalcificados 20 El tejido mineralizado contiene 33% de matriz orgánica siendo que el 28% corresponde al colágeno tipo I y los otros 5% son: Osteonectina. Osteocalcina. Proteglicanos. Sialoproteina. Proteina morfogenética ósea.
Preparación de los especímenes descalcificados 21 El otro 67% corresponde a la matriz inorgánica conteniendo: fosfato, magnesio, potasio, sodio y citrato. De estos elementos, el calcio es el que se encuentra en mayor cantidad, y para estudiar los contituyentes celulares, tenemos que retirarlo del tejido.
EDTA 10 % 22 En nuestro laboratorio utilizamos como descalcificador el EDTA 10%. Esto hace que el EDTA 10 % sea un descalcificador de óptima calidad para la morfología del tejido, y es muy bueno cuando trabajamos con microscopia electrónica, inmuno-histoquímica, y también para las técnicas de biología molecular. Y es el mejor descalcificador. Promueve la descalcificación lenta.
23 Como Saber el punto ideal de descalcificación de un diente?
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25 Métodos de inclusión Parafina (Histosec Merck) Historesina ( Leica Historesin)
26 Adhesión de cortes de diente a la lamina Los especímenes de diente humano que tengan grandes restauraciones o tratamiento endodóntico son mas susceptibles a soltarse de la lamina en la hora de la coloración. Esta es una de las dificultades de trabajar con dientes descalcificados. Esto también puede ocurrir cuando la descalcificación es realizada por ácidos, y es necesario saber el tiempo correcto para detener el proceso de descalcificación.
27 Adhesión de cortes de diente a la lamina Para minimizar la posibilidad de separación de los cortes de la lamina, debemos utilizar laminas: Señalización. Poly lisina. Laminas con carga. Hacer cortes de 3 a 5 micrómetros. Lâmina de Diente incisivo de cierdo bem aderida.
28 Métodos de coloración Hematoxilina Eosina. Tricromico de Masson. Tricromico de Mallory. Picrosirus. Trap (fosfatasa ácida resistente al tartrato).
29 Hematoxilina Eosina Lamina de diente canino coloreada con H.E. Tejido Óseo. Ligamento periodontal. Dentina.
30 Hematoxilina Eosina Mandibula de camundongo o raton, podemos observar un diente, primer molar y sus raizes.
31 Tricromico de Masson Imagen de diente porcino descalcificado com EDTA 10%. Observen la área de la dentina y los túbulos dentinários.
32 Tricromico de Mallory Lamina de diente de cerdo coloreada con Tricromico de Mallory. Presencia del Ligamento Periodontal. Dentina.
Trap 33 La coloración de TRAP (fosfatasa ácida resistente al tartrato) permite que identifiquemos los osteoclastos, como una reacción de color rojo. Este método es muy importante en investigaciones de ortodoncia, pues permite visualizar la reabsorción ósea. Pitol et al : Int. J. Morphol., 25(4):907-910, 2007
34 Histotecnología Sin embargo, la Histotecnología no se resume solamente al preparo de los especímenes de manera correcta y los métodos de coloración adecuados. También necesitamos aplicar métodos de análisis cuantitativos. Método histomorfométrico. Usar software de análisis de imágenes. Inmunohistoquímica.
Cuantificación de fibras de colágeno 35 Esta es una imagen de cuantificación de colágeno retirada de um artículo publicado por nuestro grupo de investigación. Con imágenes microscópicas polarizadas y con auxilio del software imagej, podemos cuantificar las fibras de colágeno.
Análisis Histomorfométrico 36 Con cortes semi seriados de huesos, hacemos el análisis histomorfométrico aplicando sobre la imagen del tejido un sistema - test. El sistema test es colocado sobre la imagen con el software imagej. Contamos los puntos que caen sobre el tejido óseo maduro, y sobre el tejido óseo recién formado.
37 Análisis Histomorfométrica En seguida aplicamos las fórmulas y conseguimos cuantificar el área de hueso recién formado en porcentaje.
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41 Agradecimento dimitrius@forp.usp.br dimipitol@yahoo.com.br
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