Ciclos de vida de dípteros de interés médico forense en el Municipio de Ecatepec

Ciclos de vida de dípteros de interés médico forense en el Municipio de Ecatepec Resumen Se llevó a cabo un muestreo en un plantel escolar ubicado en el municipio de Ecatepec de Morelos, Estado de México, en el periodo comprendido de octubre de 2013 a febrero de 2014, con la finalidad de recolectar larvas de dípteros de importancia médica y forense. Se realizaron los procedimientos para desarrollar sus ciclos de vida para determinar los tiempos de desarrollo, considerando condiciones estándar de laboratorio. Se obtuvieron los ciclos de desarrollo de 6 especies de dípteros de importancia en su aplicación médica y forense, destacando especies pertenecientes a las familias Calliphoridae y Sarcophagidae. Se trabajaron los estadios de larva, pupa y adulto, siendo la especie Calliphora latifrons, perteneciente a la familia Calliphoridae, la mas abundante del muestreo en este periodo, seguidas de las especies Lucilia sericata y Cochlyiomyia macellaria. Los datos presentados, sientan las bases para el municipio de Ecatepec, como el primer muestreo reportado para estos dípteros, cuya aplicación puede extenderse al ámbito médico, ecológico y forense. 1

Introducción Marco Teórico Los dípteros son organismos que pertenecen a la clase Insecta, distribuyéndose ampliamente en casi todo el mundo, explotando nichos terrestres, acuáticos y algunos de ellos se han identificado en las regiones frías del mundo. Conocidos comúnmente como moscas, tienen gran importancia ecológica, ya que pueden explotar diferentes fuentes nutricionales dependiendo de la fase de desarrollo. Es común observar en los diferentes ambientes que los individuos de la misma especie, presenten diferentes hábitos alimenticios, observando una alimentación omnívora en su fase adulta, mientras que en sus etapas larvales, presentan una conducta necrófaga, alimentándose de materia orgánica por lo que son considerados como organismos recicladores de materia orgánica en estado de descomposición al realizar la remoción de los restos de plantas y animales del ambiente. (Barnes, 1992). A través de los estudios de observación directa y experimentales se ha establecido que los dípteros tienen selección por la materia orgánica incluidos los tejidos animales entre ellos el humano, constituyendo un microhábitat muy atractivo formando cadenas alimenticias que dependerán de la descomposición cadavérica y dependiendo de las características ambientales y ecológicas del sitio donde se encuentre el cadáver (Villanueva y Concherio, 1994). En México los estudios de insectos de éste orden son muy extensos, sin embargo, cuando se trata de dípteros de interés médico o forense, los estudios se restringen siendo prácticamente nulos en el área de Entomología Forense, dirigidos principalmente a estimar el tiempo transcurrido desde que ocurre la muerte hasta el momento en que se efectúa el hallazgo de un cadáver, este índice denominado intervalo postmortem se aplica en las ciencias forenses para dar solución a diversas problemáticas en la investigación criminalística y médico legal (Deloya, 1997, Magaña, 2001). 2

En la práctica médica estos insectos son utilizados en sus estadíos juveniles para facilitar el tratamiento de heridas y lesiones que se generan en pacientes que cursan algún tipo de enfermedad metabólica destacando como la principal a la diabetes que son una causa muy común y altamente frecuente de ingreso hospitalario. Dentro de las categorías y lesiones que pueden ser tratadas por tales insectos se encuentran aquellas heridas externas que presentan dificultades para cicatrizar por causas diversas llamadas también heridas crónicas, cuyo tratamiento se dificulta y a veces conducen a cuadros graves o incluso fatales. Se sabe que los dípteros se encuentran entre los primeros organismos que degradan la materia orgánica, desde los inicios de la descomposición, identificándose especies de por lo menos 10 familias, entre las que se encuentran las siguientes: Calliphoridae, Sarcophagidae, Muscidae, Piophilidae, Scathophagidae, Sepsidae, Sphaeroceridae, Stratiomydae, Phoridae, y Psychodidae (Anderson 2001; Byrd y Castner, 2001; Deloya, 1997). Planteamiento del problema En México existen pocos profesionistas dedicados al estudio de insectos o sus partes y la interrelación de ellos con la práctica forense, entendiéndose ésta como un conjunto de normas jurídicas que regulan las conductas sociales en una población determinada. Los datos emitidos por algunas dependencias gubernamentales indican que la entomología forense puede jugar un papel importante al auxiliar en la resolución de casos forenses de los más de 21 000 homicidios dolosos reportados a nivel nacional en los últimos años. Por otro lado el empleo que se da a la conducta biológica de las larvas puede ser aplicado con fines terapéuticos. En ambos casos, conocer los ciclos de vida de los 3

dípteros se convierte en uno de los problemas básicos a resolver ya que existen muy pocos reportes biológicos y médicos en relación al tema. Contando con los antecedentes sobre la importancia que tienen los dípteros en los campos de la medicina y medicina legal podemos cuestionar: qué beneficios brinda a la población estudiar los ciclos de vida de dípteros de importancia forense? Justificación En la actualidad, en nuestro país los homicidios continúan ocupando los encabezados de los diarios de circulación nacional. De acuerdo con los reportes sobre la incidencia delictiva del Sistema Nacional de Seguridad Pública de 2012 a 2013 se han reportado más de 18 mil homicidios dolosos 1. Desafortunadamente el sistema de justicia en México no cuenta con personal suficiente y capacitado para la investigación de delitos en donde se involucra el análisis y tratamiento de muestras biológicas que puedan esclarecer incógnitas que presentan muchos de los cadáveres encontrados en circunstancias particulares, careciendo también del conocimiento, de las herramientas que puedan determinar el denominado Intervalo postmortem o IPM el cual sirve para determinar el tiempo transcurrido entre la muerte y el hallazgo de un cuerpo. Conocer los ciclos de vida de los dípteros auxilia a los órganos encargados de la procuración de justicia en México a aplicar de manera objetiva las herramientas para determinar dicho intervalo, además de su aplicación en el campo médico para el tratamiento de heridas o lesiones producidas por enfermedades incapacitantes. 1 Fuente tomada de reporte periodístico en la Jornada. http://www.jornada.unam.mx/2014/03/01/politica/012n2pol 4

Por lo anterior, el presente estudio surge como una alternativa que contribuye al conocimiento del ciclo de vida de estos organismos para auxiliar a la ciencia médica y forense. Hipótesis Los factores ambientales y climáticos repercuten en los tiempos de desarrollo entre los dípteros necrófagos. Objetivo general Determinar los ciclos de vida de las especies de dípteros de interés médico y forense distribuidas en el municipio de Ecatepec de Morelos estado de México en el período invernal. Desarrollo A) Caracterización de la zona de estudio. La zona de estudio donde se llevó a cabo el muestreo y recolección de dípteros presenta las siguientes características. Centro de Bachillerato Tecnológico ubicado en el municipio de Ecatepec. El municipio de Ecatepec se ubica al Noreste de la Ciudad de México, perteneciente a la Región III-Texcoco del Estado de México. Colinda al Norte con los municipios de Tecámac y Coacalco de Berriozábal, al Sur con el municipio de Nezahualcóyotl, al Este con los municipios de Acolman, Atenco y Tezoyuca, y al Oeste con los municipios de Tlalnepantla y Tultitlán; también colinda al Sur con la Delegación Gustavo A. Madero. Ecatepec es un núcleo habitacional e industrial de gran importancia, se encuentra ubicado a una altitud promedio de 2259 msnm, entre los paralelos 19 36' 03" latitud Norte y 99 03' 09" longitud Oeste. Cuenta con 1 ciudad, 6 pueblos, 2 5

rancherías, 6 ejidos, 12 barrios, 102 raccionamientos y 209 colonias. (Portal Municipio Ecatepec, 2014). 2 B) Metodología de campo: Se ubicó un sitio de recolección en un terreno del plantel escolar. En el período correspondiente de octubre de 2013 a febrero de 2014, realizándose la captura de dípteros mediante trampas aéreas. Las trampas fueron elaboradas con contenedores de polietileno transparente con medidas de 30 x 15x 12 cm, considerando una abertura lateral de 10 cm de largo x 9 cm de ancho para la entrada y salida de moscas adultas, la trampa presenta en la parte superior una asa de sujeción con un cordón para ser sujetada. Se utilizó como sustrato una capa de arena de 2 cm y sobre ella una capa de aserrín de 8 a 10 cm. Se empleó como cebo fragmentos de carne de cerdo (Sus scrofa) con gran cantidad de tejido graso, en cortes de 300 a 500 gramos, los cuales se dejaron en descomposición por dos días antes de su colocación. Las trampas fueron colocadas en árboles a un altura promedio de 3 metros sobre el nivel del piso, permaneciendo en el sitio de recolección durante 5 días, Figura 1. Figura 1. Muestreo realizado en una zona escolar en el Municipio de Ecatepec. Se utilizaron trampas aéreas con cebo de carne de puerco. 2 Portal Municipio de Ecatepec, 2014 Consultado: http://www.ecatepec.com/historiaecatepec.htm 6

Una vez concluido el período las trampas fueron retiradas selladas y colocadas en bolsas de residuos biológicos y enviados al laboratorio multifuncional de ciencias naturales y experimentales para concluir el primer ciclo de desarrollo. Fase de laboratorio: Una vez en el laboratorio fueron colocados en una incubadora, la cual fue fabricada con unicel de 1 m x 0.5 m de longitud y acoplado a ella un termostato y un foco para incrementar temperatura en los días más fríos para evitar la muerte larval; se tuvo una exposición a 12 horas obscuridad y 12 horas luz blanca con una intensidad de 5 watts. En todas las fases del desarrollo se registró la temperatura y humedad relativa en el exterior durante los 6 días que permaneció fuera y en el interior el resto del tiempo, tres veces por día, las cuales fueron registradas con higrotermómetros digitales Cole-Palmer, (modelo 03313-86,± 1 C; 50% HR). Durante toda la fase se llevó a cabo un registro de la temperatura y humedad relativa que se presentó en el laboratorio y en la incubadora. Figura 2 Figura 2. Colocación de larvas para su desarrollo en incubadora de unicel. En la fase de desarrollo se tomaron datos de temperatura y humedad relativa. 7

Para la clasificación del desarrollo larval, se recolectaran durante su desarrollo, y se clasificaron en sus diferentes estadios tomando en cuenta los siguientes criterios: Estadio 1: eclosión, céfaloesqueleto, espiráculos protoráxicos y espiráculos posteriores en diferenciación presentando de 1 a 2 Slits o aberturas espiraculares. Estadio 2: céfaloesqueleto, espiráculos protoráxicos y espiráculos posteriores diferenciados presentando 2 Slits o aberturas espiraculares. Estadio 3: céfaloesqueleto, espiráculos protoráxicos y espiráculos posteriores diferenciados presentando 3 Slits o aberturas espiraculares. Periodo pupal: las larvas postalimentarías se retraen y obscurecen, además de presentar una ausencia de contenido gástrico e inmovilidad. Una vez que emergieron los adultos, se llevaron a cabo la identificación y el sexado por morfoespecie de éstos, por lo que fueron separados en contenedores de polietileno transparentes con medidas de 30x 15x12 cm con apertura posterior y con malla de tipo mosquiteros, estos contenedores se unieron con interconectores fabricados con codos y tubos de PVC de diámetro de 2 cm. Posterior a la separación se colocó un fragmento de algodón con éter etílico para adormecer a los adultos y poder realizar su separación por sexo. El sexo se determinó cualitativamente observando al microscopio estereoscópico la separación interocular y las sedas interoculares que presentan las hembras con respecto a los machos y finalmente por las características morfológicas de la genitalia del macho, el cual esta presente con una protuberancia muy abultada. Figuras 3 y 4. 8

Figura 3. Características morfológicas de los ojos, distancia interocular entre machos y hembras para efectuar el sexado. Imagen izquierda macho, imagen derecha hembra. Figura 4. Sexado de dípteros por morfoespecie, tomando en cuenta la distancia interocular y el tamaño de la genitalia. Una vez sexados y separados por morfoespecie, 5 ejemplares de cada especie, fueron sacrificados en cámaras húmedas con cloroformo y montadas en alfileres entomológicos para su identificación taxonómica, para ello, se consideraron la morfología de las larvas, pupas y adultos con auxilio de claves taxonómicas generales y apoyándose en la confirmación de especies en laboratorio de Entomología Forense de la Coordinación General de Servicios Periciales de la Procuraduría General de Justicia del D.F. las claves taxonómicas utilizadas fueron las descritas para fases de desarrollo larval y adultos propuestos por los siguientes autores: Brues y Col., 1954; Peterson, 1960; U.S.D.HEW., 1969. Posteriormente, se colocaron cinco hembras y tres machos en cámaras de reproducción con medidas de 50 x 30 x 30 cm fabricadas con poliuretano de 9

alta densidad, tela de organza y mangas laterales, permaneciendo en dicha cámara hasta observar las primeras cópulas de los organismos. Se le suministró continuamente una mezcla de carbohidratos, proteína animal y agua, para obtenerla, se horneó una porción de azúcar, leche en polvo y clara de huevo durante media hora hasta lograr una pasta seca la cual fue triturada posteriormente. Se observó el comportamiento y actividad sexual estableciendo los tiempos de cópula con la finalidad de determinar la maduración sexual y colocar contenedores de plástico dentro de las cámaras de cría con medidas de 10 x 15 cm con un suministro de 250 gramos de carne y vísceras de cerdo para la oviposición y larviposición, la carne fue colocada al interior de este contenedor sobre una cubierta de aserrín de 8 a 10 cm. Las cámaras de crianza se mantuvieron a temperatura ambiente dentro del laboratorio multifuncional hasta observarse la presencia de larvas en la carne de los contenedores. Este criterio se consideró como tiempo cero para el desarrollo de los dípteros y fueron trasladados para su desarrollo en la incubadora previamente descrita. Para evitar estrés en el desarrollo de las larvas por falta de recursos se agregaron continuamente fragmentos de carne de cerdo a los contenedores, evitando sesgos en la determinación del tiempo de transformación hacia la siguiente fase. Figura 5. Para observar la fase larval se obtuvieron las medidas de ejemplares, transfiriéndolos a recipientes con agua a una temperatura de 70 a 80 grados centígrados durante 20 a 30 segundos con el objeto de obtener la longitud máxima de ellas. Se llevaron a cabo registros desde el tiempo inicial en que se colocaron las larvas hasta alcanzar el estadio de pupa. 10

Figura 5. Cámara de crianza donde se colocaron los dípteros machos y hembras para efectuar la crianza. Una vez que alcanzaron el estadio de pupa los dípteros se enterraron en el aserrín considerando el tiempo cero del estadio de pupa cuando no se observó movimiento y la cutícula se queratinizó y cambió de color; hasta el tiempo final de este estadio que se consideró cuando emergieron los primeros adultos de estas pupas, se obtuvo la densidad poblacional promedio de las especies identificadas, figura 6. Se cuantificaron los adultos, se obtuvo la proporción sexual de acuerdo con la prueba de X 2 de acuerdo con la propuesta hecha por Montemayor, (1973). Figura 6. Separación de pupas de diferentes dípteros para su desarrollo en laboratorio, colocadas posteriormente en frascos de plástico para emergencia de adultos. 11

Resultados: Análisis e interpretación de resultados Durante la etapa de colecta, se observó que la degradación de la carne fue determinada por las condiciones ambientales prevalecientes alrededor de la necro trampa y por las condiciones climáticas frías en las que esta permaneció en el sitio de trampeo. La descomposición del cebo impactó sobre el comportamiento de los dípteros que se acercaron al dispositivo para ovipositar o larvipositar. En los sitios donde la incidencia de la luz solar fue mayor y directa sobre el cebo, no se observaron huevos ni larvas. Por otro lado, en aquellos sitios con poca incidencia de luz y calor por el sol, se detectó mayor abundancia de huevos y larvas. Utilizando las trampas áreas descritas fue posible capturar especies de dípteros los cuales fueron identificados como correspondientes a 6 morfoespecies y posteriormente identificadas las especies, pertenecientes a 2 familias y a 5 géneros, las cuales se reportan en el cuadro número 1. Morfoespecie Familia Género Calliphora latifrons Calliphoridae Calliphora Lucilia sericata Calliphoridae Lucilia Chrysomya rufifacies Calliphoridae Chrysomya Chrysomya megacephala Calliphoridae Chrysomya Cochlyiomyia macellaria Calliphoridae Cochlyiomyia Sarcophaga haemorrhoidalis Sarcophagidae Sarcophagidae Cuadro 1.- Familias y especies de dípteros identificados en las necrotrampas colocadas en la fase de campo en el plantel escolar. Se puede observar que la familia Calliphoride está representada con 4 géneros siendo los primeros organismos en detectarse en las trampas aéreas, seguido de la especie S. haemorrhoidalis la cual pertenece a la familia Sarcophagidae, la 12

cual se presentó hasta con 5 días posteriores a la colocación de cada una de las trampas. Es necesario mencionar que esta última especie se depositó directamente como larva sobre la carne en degradación. Respecto del cebo utilizado en las trampas, se hizo un registro cualitativo de degradación desde el momento de su colocación en campo hasta su traslado al bioterio. Una vez efectuado el conteo de las especies de dípteros identificados previamente se obtuvo una densidad poblacional promedio, obteniendo resultados para cada una de estas especies, misma que se muestra en la figura número 7. 350 300 250 Densidad 200 150 100 50 348 212 98 94 147 79 0 Especies de dípteros Figura 7. Se muestra la densidad poblacional promedio de seis especies de dípteros colectadas en el terreno del plantel escolar del Centro de Bachillerato Tecnológico Juan Gutenberg, ubicado en municipio de Ecatepec de Morelos. Se puede notar que la especie con mayor densidad poblacional correspondió a Calliphora latifrons. 13

Una vez trasladados al laboratorio multifuncional se efectuaron observaciones en el comportamiento de los dípteros durante las fases de larva, pupa y adulto. Una característica del último período de la fase larval de todas las especies fue la migración de los sitios de alimentación hacia el interior de la capa de aserrín evitando los espacios iluminados, comportamiento denominado como fotófobo formando agregados en sitios oscuros desarrollando ahí su fase de pupa. Todas las especies identificadas desarrollaron su fase de pupa hacia el interior de los sustratos. Se determinaron los tiempos promedio en horas de desarrollo de las estadios de larva, pupa hasta que emergieron los primeros adultos, los resultados obtenidos se muestran en la figura número 8. Sarcophaga haemorrhoidalis 370 540 Cochliomyia macellaria 257 150 Especies Chrysomya megacephala Chrysomya rufifacies Lucilia sericata 269 268 328 204 204 208 Preovoposición Huevo Larva Pupa Callíphora latifrons 256 132 0 500 1000 Tiempo en horas Figura 8. Tiempos determinados en el ciclo de vida de 6 especies de dípteros de interés médico y forense, se muestran los tiempos de desarrollo de los estadios de larva y de pupa Como muestran los datos del cuadro 2 y figura 8 se presentaron marcadas diferencias en los tiempos de desarrollo de todas las especies identificadas correspondiendo a Calliphora latifrons el tiempo menor de desarrollo y a Sarcophaga haemorrhoidalis el tiempo mayor observándose el mismo fenómeno tanto en estadios larvales como de pupa. Aun cuando no se recolectaron todos 14

los datos fue posible observar que durante la crianza de estas especies, el estadio de pupa fue la etapa más crítica determinando un alto porcentaje de mortalidad. En cuanto a la proporción sexual observada, los datos obtenidos después de aplicar el estadístico de X 2 se pudo determinar que por cada dos hembras emerge un macho, es decir, se obtuvo una proporción de 2:1 con excepción de los dípteros de Sarcophaga haemorrhoidalis con una proporción de 3:1, como puede observarse en el cuadro número 2. Especie 15 Proporción sexual Calliphora latifrons N= 348 2:1 241 107 Lucilia sericata N= 348 2:1 241 107 Chrysomia rufifacies N= 348 2:1 241 107 Chrysomya megacephala N= 348 2:1 241 107 Cochlyiomyia macellaria N= 348 2:1 241 107 Sarcophaga haemorrhoidalis N= 348 2:1 241 107 Cuadro 2. Proporción sexual obtenida de los dípteros desarrollados en su fase adulta. Se aprecia la proporción obtenida de acuerdo con el modelo de X 2 propuesto por Montemayor, (1973). Nivel de significancia α 0.5, g. l. 1 Macho ( ); hembra ( )

Conclusiones El método y los dispositivos de captura incluidos el cebo y el sustrato utilizado, brindaron resultados satisfactorios para la captura de fases larvales de dípteros y su desarrollo hasta la fase adulta. Los datos registrados sobre los tiempos de captura indicaron que la colocación y los tiempos de recolección fueron los idóneos para este muestreo. Fue posible establecer la presencia de seis especies de dípteros con hábitos alimenticios necrófagos representantes de cinco géneros y dos familias, reportados como especies asociadas a etapas tempranas de descomposición cadavérica, Villanueva y Concheiro, (1994). Fue posible establecer que la especie representativa en este muestreo en el período contemplado de octubre de 2013 a febrero de 2014 fue el díptero Calliphora latifrons considerado como insecto necrófago en su fase larval, este se constituye como la de mayor frecuencia de aparición asociados a cadáveres humanos con una distribución muy amplia y consideradas como degradadores primarios en un fenómeno ecológico denominado sucesión, Arnaldos y Cols., (2006). Se establece un ciclo de desarrollo para esta especie de 16.16 días. Lucilia sericata considerada también como especie necrófaga fue identificada en este muestreo con una densidad menor a C. latifrons pero representativa. Es una especie considerada también como pionera en la sucesión ecológica y al igual que la especie anterior se presentaron los adultos a ovipositar desde el inicio de la fase de campo. L. sericata es una especie que se ha asociado con tratamientos de terapia larval útil en la debridación de tejidos necrosados y como reciclador de este material en sus estadios iniciales de desarrollo. Su ciclo de desarrollo fue de 22.33 días. Con respecto a las especies Chrysomya rufifacies, Chrysomya megacéfala y Cochliomyia macellaria se puede establecer que también corresponden a especies pioneras en las fases de degradación cadavérica. Se sabe que C. 16

rufifacies es depredadora de larvas, por lo que su identificación grupal constituye un antecedente notable, dada la competencia y depredación sobre el resto de las especies. Sus tiempos de desarrollo son 19.66, 19.70 y 16.95 días respectivamente. Por otro lado, la especie Sarcophaga haemorrhoidalis fue capturada y desarrollada durante esta etapa de muestreo, determinando un ciclo de vida mayor que para el resto de las especies, 37.91 días. Esta especie es considerada como organismo secundario durante la sucesión ecológica, por lo que en conjunto con el resto de las especies pueden ser utilizadas como indicadores para estimar tiempos de transformación cadavérica y determinar un índice útil en la criminalística denominado Intervalo Postmortem (IPM). Existen datos sobre la aplicación del estudio de estas especies entomológicas con la finalidad de identificación humana utilizando marcadores moleculares y el contenido gástrico de algunas de estas especies. El objetivo básico es lograr la identificación de un humano en cualquiera de las fases de degradación cadavérica, pero en estadios de desarrollo específico de estos dípteros Nava y cols., (2011). Este estudio se constituye como el primero en su tipo en investigación forense para estos dípteros llevado a cabo en el municipio de Ecatepec. Los resultados sobre el ciclo de vida pueden ser de gran utilidad para instituciones encargadas de Procuración de Justicia. Instituciones educativas interesadas en ecología, zoología y en control de plagas y a especialistas de la salud que requieran de esta información y que brinden un servicio con eficacia y eficiencia a la comunidad. Fuentes de información Anderson, G. S. 2001. Insects sucesión on carrion and its relationship to determining time of death. In: Forensic Entomology. The utility of 17

artrhopods in legal investigations. Byrd J. H., Castner J. L. (eds.) CRC Press- pp 143-175. Arnaldos, M. I., García, M., Romera, Presa, J. J. y Luna, L. 2005. Estimation of the postmortem interval in real cases based on experimentally obtained entomological evidence. Forensic Science International. 149: 57-65. Barnes, R. D. 1992. Zoología de los invertebrados. Editorial Interamericana. México. Bland, R. G., Jaques, H. E. 1978. How to know the insects. The picture key nature series. 3a ed. Dubuque, Iowa. Brues, C. T., Melander, A. L. y Frank, F. M. 1954. Clasification of insects. Bulletin of Museum of Comparative Zoology. Vol. 108: 305-413. Byrd J. H., Castner, J. L. 2001. Insects of forensic importance. In : Forensic Entomology. The utility of artrhopods in legal investigations. Byrd J. H., Castner J. L. (eds.) CRC Press- pp 43-79. Deloya, L. C. A. 1997. Importancia económica, agrícola, médica, veterinaria, pecuaria y forestal de los escarabajos y su uso potencial en medicina legal, EN: Sociedad Mexicana de Entomología- Universidad Autónoma de Puebla (eds) Manual sobre Entomología y Acarología aplicadas. Puebla, México. Magaña, C. 2001. La Entomología Forense y su aplicación en Medicina Legal. Data de muerte. Boletín de la Sociedad Aragonesa de Entomología. Montemayor (1973), G. F.1973. Fórmulas de estadística para investigadores. Colección científica manuales. Instituto Nacional de Antropología e Historia. México. 416 pp. Nava, H. L. M., Flores, L.R., Molina, Ch. H. A. Luy, Q. J. A., Galindo, M. N. E. 2011. Determinación de ADN humano en larvas de dípteros recolectadas de cadáveres en distintas fases de degradación. Entomología mexicana. 10: 600-604. Peterson, A. 1960- Larvae of insects. An introduction to Neartic species. Parte II. Columbus, Ohio. U S D. H. E. W. 1969. The pictorial keys to artrhropods, reptils, birds and mammals of public health significance. Public Heatlh Service Publication. No. 1995. Pp 192. 18

Villanueva, C. E. y Concheiro, C. L. 1994.Problemas tanatológicos médico-legales. En Medicina Legal y Toxicología. Editor Gisber C. J. A.- Masson-Salvat. España. Consulta en internet Portal Municipio de Ecatepec, 2014 Consultado: http://www.ecatepec.com/historiaecatepec.htm http://www.jornada.unam.mx/2014/03/01/politica/012n2pol 19